Pesquisa apoiada por New Hampshire-INBRE através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA), P20GM103506, do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH.

Nota: As considerações de tempo para cada ensaio devem ser feitas uma vez que as preparações de mídia individuais exigem tempos diferentes. Por exemplo, meios sólidos de placas de ágar devem ser deixados suficientemente arrefecer e secar (1-2 dias). Considerações de tempo adicionais ( isto é, colônia única e crescimento da cultura durante a noite) são especificadas em cada protocolo e são encontradas na Tabela 2 . 1. Preparação de mídia <ol><li> 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) <ol><li> Pesar 4,0 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,72 g de Na2HPO4 e 0,12 g de KH2PO4. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada, ajuste o pH para 7,2 usando um medidor de pH e adicione HCl gota a gota à solução, e autoclave ou filtre a esterilização usando um filtro de 0,22 μm. 1x PBS pode ser armazenado à temperatura ambiente indefinidamente. CUIDADO: O HCl é um ácido concentrado e deve ser manuseado de acordo comPara regulamentos institucionais, locais, estaduais e federais. Para obter as orientações de manuseio adequadas, consulte a ficha de dados de segurança fornecida pelo fabricante. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Caldo <ol><li> Pesar 5,0 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura e 2,5 g de NaCl. Combine os constituintes em uma garrafa de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada, autoclave e armazene à temperatura ambiente por até 6 meses. Para condições clássicas de indução de virulência de biótipo, ajuste o pH para 6,5 ​​usando HCl antes do autoclave. </li></ol></li><li> Meio AKI contendo 0,03% (p / v) de NaHCO3 <ol><li> Para Componente 1 (meio AKI): pesa 7,5 g de peptona, 2,0 g de extracto de levedura e 2,5 g de NaCl. Combine os constituintes em uma garrafa de 1 L, ajuste o volume para 450 mL com água desionizada e autoclave. O meio AKI pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 6 meses. </li><li> Para Componente 2 (NaHCO 3 ): pesa 1,5 g de NaHCO 3 e ajuste o volumeA 50 mL com água desionizada em uma vesícula estéril. Filtre a esterilização de NaHCO 3 usando um filtro de 0,22 μm. NaHCO 3 deve ser preparado imediatamente antes da utilização. </li><li> Combine aspticamente os dois componentes criando uma relação de 1:10, filtrando o Componente 2 no Componente 1 antes de usar. </li></ol></li><li> Placas de agar de Luria-Bertani (LB) <ol><li> Pesar 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 2,5 g de NaCl e 7,5 g de ágar. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada, autoclave e prepare-se em placas de Petri esterilizadas de tamanho normal de 100 mm x 15 mm. A mídia chapeada pode ser armazenada em plástico por até 6 meses, com a tampa aberta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Placas de Agar LB suplementadas com polimixina B <ol><li> Para Componente 1 (agar LB): pesa 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 2,5 g de NaCl e 7,5 g de ágar. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL wiÁgua desionizada e autoclave. </li><li> Para o Componente 2 (polimixina B): dissolver a polimixina B em água desionizada em um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL até uma concentração de 50 000 UI / μL e esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm. </li><li> Uma vez que o Componente 1 é frio ao toque, mas ainda não solidificado, adicione assépticamente 500 μL de Componente 2 ao Componente 1 criando uma concentração final de 50 UI / μL e misture bem. Prepare-se em placas de Petri estéril padrão de 100 mm x 15 mm, despejando meios misturados de agar nos pratos de Petri. A mídia revestida pode ser armazenada em plástico por até 3 meses, com a tampa aberta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Pratos de Agar Médio de Citrato Mínimo <ol><li> Para Componente 1 (agar com azul de bromotimol): pesa 7,5 g de ágar e 0,02 g de azul de bromotimol. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 450 mL com água desionizada e autoclave a mistura. </li><li> Para Componente 2 (10x VBMM): pesa 10,00 g de MgSO4 7H2O, 10,0 g de ácido cítrico H2O, 50,0 g de K 2 HPO 4 anidro e 17,5 g de NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL Com água desionizada e autoclave ou filtro esterilizado usando um filtro de 0,22 μm. VBMM 10x pode ser armazenado a temperatura ambiente até 6 meses. </li><li> Adicione 50 mL do Componente 2 ao Componente 1 e prepare-se em placas de Petri esterilizadas de tamanho padrão de 100 mm x 15 mm, despejando meios de agar misturados nas placas de Petri. A mídia chapeada pode ser armazenada em plástico por até 6 meses, com a tampa aberta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Pratos de Agar de Leite <ol><li> Para o Componente 1 (leite): pesar 8,0 g de leite seco sem gordura instantânea em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 200 mL com água desionizada e autoclave. </li><li> Para Componente 2 (agar com infusão cérebro-coração): pesa 3.68 g de infusão cérebro-coração e 6,0 g de ágar. Combine o conEm um balão Erlenmeyer de 500 mL, ajuste o volume para 200 mL com água desionizada e autoclave. </li><li> Combine os dois componentes despejando o Componente 2 no Componente 1, depois de se autoclavar e misture bem. Prepare em placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm. As placas de leite podem ser armazenadas por até uma semana em plástico, lado da tampa para baixo a 4 ° C. Prepare-se em placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm, despejando meios de agar misturados nas placas de Petri. </li></ol></li><li> Placas de Agar Motilidade <ol><li> Para o Componente 1 (agar LB): pesa 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 2,5 g de NaCl e 2,0 g de ágar. Combine os constituintes em um frasco Erlenmeyer de 1 L, ajuste o volume para 500 mL com água desionizada e autoclave. </li><li> Para o Componente 2 (cloreto de trifeniltetrazólio de 1% (p / v); TTC): pesar 0,25 g TTC. Ajuste o volume para 25 mL com água desionizada em uma vesícula estéril e filtre-se esterilizando usando um filtro de 0,22 μm. Armazenar até 6 meses a temperatura ambiente embrulhadoEm papel alumínio para minimizar a exposição à luz. </li><li> Adicione 2,5 mL de TTC estéril a 1% (p / v) a mídia autoclavada. </li><li> Despeje a mídia tão grossa quanto possível (≥50 mL / placa) em grandes placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm. A mídia revestida pode ser armazenada em plástico por até uma semana, com a tampa aberta a 4 ° C. Prepare-se em placas de Petri estéril de 150 mm x 15 mm, despejando meios de agar misturados nas placas de Petri. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Para o Componente 1 (caldo Metil Red-Voges-Proskauer, MR-VP): pesa 1,7 g de meio MR-VP em um balão Erlenmeyer de 500 mL, ajuste o volume para 100 mL com água desionizada e autoclave. O resíduo esterilizado MR-VP pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 6 meses. </li><li> Para Componente 2 (5% (p / v) alfa (α) naftol): pesa 1,0 g de a-naftol em uma vesícula estéril e ajuste o volume para 20 mL com etanol a 95%. O α-naftol pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 1 semana envolvido em papel alumínio para minimizar a luz expOsure. </li><li> Para o Componente 3 (40% (p / v) de hidróxido de potássio; KOH): pesar 20,0 g de KOH em uma vesícula estéril, ajustar o volume para 50 mL com água desionizada estéril. KOH pode ser armazenado por até 6 meses a temperatura ambiente em um recipiente de plástico. </li></ol></li></ol> 2. Manutenção e crescimento de V. Cepas de cólera <ol><li> Preparação e Uso de Culturas de Stockes Frozen <ol><li> Pellet 1,8 mL de cultura líquida durante a noite por 2 min por centrifugação (≥8,600 xg) em um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL, remover o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular em 900 μL de caldo LB fresco por pipetagem. </li><li> Adicione 900 μL de glicerol esterilizado a 60% (v / v) à cultura e misture por vortex. </li><li> Transfira a mistura para um tubo criogênico esterilizado de 2 mL e armazene indefinidamente a -80 ° C. </li><li> Para usar, remova uma pequena quantidade de estoque congelado usando um loop de inoculação estéril e uma série para colônias individuais em LB agAr chapas. Volte imediatamente o estoque congelado a -80 ° C após o uso para evitar que as culturas descongelam completamente. Incube as placas do lado da tampa para baixo durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Crescimento de culturas durante a noite em meio líquido <ol><li> Streak para colônias únicas (de acordo com a seção 2.1.4) de estoque congelado em placas de agar LB. Incube as placas do lado da tampa para baixo durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li><li> Inocule 4 mL de caldo LB líquido em um tubo de cultura estéril de 10 mL com uma única colônia, tocando a superfície da colônia única com uma vara de aplicador estéril e transferindo a colônia para o caldo líquido. </li><li> Incubar com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Curva de crescimento <ol><li> Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido, conforme descrito anteriormente no protocolo 2.2. </li><li> Faça uma diluição 1: 100 de cultura durante a noite transferindo 250 μL de cultura durante a noite para 25 mL de caldo LB fresco num balão Erlenmeyer esterilizado de 250 mL. </li><li> Medir a densidade óptica das culturas líquidas a 600 nm (OD 600 ) a cada hora a partir do momento da inoculação (T 0 ). </li><li> Incubar uma diluição 1: 100 de cultura durante a noite com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm até 30 h a 37 ° C, ou até que a cultura alcance a densidade máxima. </li><li> Grafique o OD 600 vs. Tempo e use regressão linear para determinar o tempo de duplicação aproximado para cada estirpe. </li></ol></li><li> El Tor Biotype Virulence Inducing Conditions <ol><li> Streak para colônias únicas de estoque congelado em placas de agar LB. Incube as placas com o lado da tampa para baixo, durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li><li> Inocular 10 mL de meio AKI contendo 0,03% (p / v) de NaHCO3 com uma única colónia. </li><li> Incubar cultura sem aeração a 37 ° C durante 3,5 h. </li><li> Remova 7 mL de cultura e incuba os 3 mL restantes de cultuRe com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm por mais 4 h. </li></ol></li><li> Condições Clínicas de Indução de Virulência de Biótipo <ol><li> Streak para colônias únicas de estoque congelado em placas de agar LB. Incube as placas do lado da tampa para baixo durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li><li> Inocule 4 ml de caldo líquido LB (pH 6,5) com uma única colônia. </li><li> Incubar com aeração em uma incubadora de agitação a 225 rpm durante 12 a 16 h a 30 ° C. </li></ol></li><li> Pellet de células de lavagem em 1x PBS <ol><li> Pellet 1,8 mL de cultura durante a noite por 2 min por centrifugação (≥8,600 xg) num tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL e remova o sobrenadante usando uma pipeta. Re-suspender o sedimento celular em 1,8 mL 1x PBS por pipetagem. </li><li> Repita o procedimento de lavagem três vezes seguido de uma ressuspensão final em 1,8 mL 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Caracterizando V. Biótipos de cólera <ol><li> PTelas genéticas baseadas em CR usando ctxB e tcpA <ol><li> Desenhe um conjunto de primers, que recozem aproximadamente 50-70 pb a montante e a jusante dos locais de inicialização e parada de translação de ctxB e tcpA , respectivamente. </li><li> Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido, conforme descrito anteriormente no protocolo 2.2. </li><li> Isolar DNA cromossômico usando um kit comercialmente disponível projetado para bactérias Gram-negativas. O DNA cromossômico purificado pode ser armazenado indefinidamente a -20 ° C. O isolamento de DNA cromossômico usando kits comercialmente disponíveis geralmente leva cerca de 4 h. </li><li> Use um espectrofotômetro de micro-volume para garantir que a amostra de DNA cromossômico seja de alta qualidade (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Para cada isolado de DNA cromossômico, prepare a (s) reação (s) em cadeia da polimerase (PCR) no gelo em tubos de PCR de 200 μL estéreis e amplifique as regiões de ctxB e tcpA usando componentes de PCR padrão: Taq polymerase and buFfer (ou equivalentes), solução dNTP e primers forward / reverse. Use parâmetros de PCR padrão (~ 3 h). Por exemplo, use o seguinte protocolo: <ol><li> Desnaturação inicial a 95 ° C por 120 s. </li><li> Desnaturação a 95 ° C por 60 s. </li><li> Imprima os iniciadores a 60 ° C por 45 s. </li><li> Estende-se a 72 ° C por 90 s. </li><li> Repita as etapas 3.1.5.2 até 3.1.5.4 para 34 ciclos. </li><li> Extensão final 72 ° C por 600 s. </li><li> Suporte infinito a 4 ° C. </li></ol></li><li> Dye 5 μL de produto (s) de PCR respectivo (s) utilizando um corante de carga de gel de ADN 6x padrão e carrega aproximadamente 10 μL de escada de 1 kb e 10 μL de produto de PCR num gel de agarose a 1% em 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) amortecedor. </li><li> Execute a eletroforese em gel a 130 V até a frente do corante atingir a extremidade, mas não desligada, do gel (aproximadamente 90 min). O monitoramento constante é recomendado porque a tensão e os tempos de funcionamento podem variar dependendo do equipamento. </li><li> Após verificação deAmplificação de PCR bem sucedida no tamanho esperado, purifique os demais produtos de PCR de 45 μL usando um kit de limpeza e concentrado de DNA comercialmente disponível. </li><li> Produto (s) de PCR limpo de seqüência usando os mesmos primers utilizados para amplificação por PCR e prepara-se por diretrizes de facilidade de seqüenciamento local. </li><li> Compare o formato FASTA das sequências de genes de cada isolado para a seqüência publicada disponível no site do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), pesquisando os seguintes números de acesso na caixa de consulta de pesquisa. </li><li> CtxB : região (clássica) entre VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (clássico) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Ensaios fenotípicos para a classificação do biótipo através da mancha <ol><li> Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido, conforme descrito anteriormente no protocolo 2.2. </li><li> Lavar a (s) pastilha (s) de células conforme especificado no protocolo 2.6. </li><li> Use uma pipeta paraDetectar 1 μL de cultura lavada no respectivo meio. Para as especificações de seleção e incubação médias, consulte a Tabela 2. </li></ol></li><li> Ensaio de Motilidade <ol><li> Prepare a (s) cultura (s) durante a noite no caldo LB líquido, como indicado anteriormente no protocolo 2.2. </li><li> Lavar a (s) pastilha (s) de células conforme especificado no protocolo 2.6. </li><li> Inocule as placas de agar de motilidade inserindo inoculação de facada na cultura líquida lavada e &quot;stab&quot; verticalmente na mídia. Entre cada inoculação, esterilize a faca através de um queimador de Bunsen e, quando apanhar agar, assegure-se de que a faca de inoculação não se dobre, pois isso pode alterar os resultados. </li><li> Incubar as placas do lado da tampa para cima durante 14 a 24 h a 37 ° C. Após 14 h, monitore as placas de motilidade de perto para evitar o crescimento excessivo de culturas. </li></ol></li><li> Ensaio Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Prepare a (s) cultura (s) durante a noite no caldo LB líquido, como indicado anteriormente no protocolo 2.2. </li><li> Inocular 4ML de caldo de Voges-Proskauer de metal vermelho ou caldo MR-VP, por pipetagem de 10 μL de cultura durante a noite previamente preparada em 4 mL de caldo de MR-VP em um tubo de cultura estéril e incuba com aeração em uma incubadora de agitador a 225 rpm por 12 a 16 H a 37 ° C. </li><li> Adicionar 150 μL de α-naftol a 5% (p / v) e 50 μL de KOH a 40% (p / v) a 1 mL de alíquotas de RM-VP durante a noite, em tubos de cultura estéril, respectivamente. </li><li> Em breve vortex e deixe repousar a temperatura ambiente por até 4 h até a mudança de cor se desenvolver. </li></ol></li></ol>

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	<li>Shimada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+serotyping+scheme+for+Vibrio+cholerae.">Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae.</a> Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).</li><li>Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+serogroups+of+Vibrio+cholerae+non-O1+non-O139+with+specific+reference+to+their+ability+to+produce+cholera+toxin,+and+addition+of+novel+serogroups.">Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups.</a> Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).</li><li>Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sixth+and+seventh+cholera+pandemics+are+due+to+independent+clones+separately+derived+from+environmental,+nontoxigenic,+non-O1+Vibrio+cholerae.">The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae.</a> J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).</li><li>Albert, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+epidemic+of+cholera-like+disease+in+Bangladesh+caused+by+Vibrio+cholerae+O139+synonym+Bengal.">Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal.</a> Lancet. 342 (8868), 387 (1993).</li><li>Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+Cholera.">History of Cholera.</a> Cholera. , 1-36 (1992).</li><li>Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Genetics+of+Vibrio+cholerae.">Population Genetics of Vibrio cholerae.</a> Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).</li><li>Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonality+of+classical+and+El+Tor+cholera+in+Dhaka,+Bangladesh:+17-year+trends.">Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).</li><li>Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Vibrio+cholerae+O1+El+Tor+biotype+variant+clinical+isolates+from+Bangladesh+and+Haiti,+including+a+molecular+genetic+analysis+of+virulence+genes.">Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).</li><li>Ghosh-Banerjee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+production+by+the+El+Tor+variant+of+Vibrio+cholerae+O1+compared+to+prototype+El+Tor+and+classical+biotypes.">Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).</li><li>Ansaruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+in+Mozambique,+variant+of+Vibrio+cholerae.">Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae.</a> Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).</li><li>Ansaruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+El+Tor+strains+of+Vibrio+cholerae+O1+with+hybrid+traits+isolated+from+Bangladesh+and+Mozambique.">Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).</li><li>Lan, R., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+spread+of+cholera:+genetic+diversity+and+relationships+within+the+seventh+pandemic+clone+of+Vibrio+cholerae+determined+by+amplified+fragment+length+polymorphism.">Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).</li><li>Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+variants+of+Vibrio+cholerae+O1+biotype+El+Tor+with+attributes+of+the+classical+biotype+from+hospitalized+patients+with+acute+diarrhea+in+Bangladesh.">New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).</li><li>Nair, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+O1+strains+similar+to+pre-seventh+pandemic+El+Tor+strains+during+an+outbreak+of+gastrointestinal+disease+in+an+island+resort+in+Fiji.">Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji.</a> J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).</li><li>Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+hybrid+variants+of+Vibrio+cholerae+O1.">Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1.</a> Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).</li><li>Safa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+characteristics+of+Matlab+variants+of+Vibrio+cholerae+O1+that+are+hybrids+between+classical+and+El+Tor+biotypes.">Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes.</a> J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).</li><li>Nusrin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+CTX+phages+among+toxigenic+Vibrio+cholerae+O1+and+O139+strains+isolated+between+1994+and+2002+in+an+area+where+cholera+is+endemic.">Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic.</a> J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).</li><li>Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphisms+in+regulator-encoding+genes+have+an+additive+effect+on+virulence+gene+expression+in+a+Vibrio+cholerae+clinical+isolate.">Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate.</a> mSphere. 1 (5), e00253 (2016).</li><li>Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+for+stimulating+cholera+toxin+production+by+Vibrio+cholerae+O1+El+Tor.">Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor.</a> Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).</li><li>DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+cascade+controls+virulence+in+Vibrio+cholerae.">Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).</li><li>Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duel+regulation+of+genes+involved+in+acetoin+biosynthesis+and+motility/biofilm+formation+by+the+virulence+activator+AphA+and+the+acetate-responsive+Lys-R+type+regulator+AlsR+in+Vibrio+cholerae.">Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae.</a> Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).</li><li>Vogel, H. J., Bonner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylornithinase+of+Escherechia+coli:+partial+purification+and+some+properties.">Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties.</a> J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).</li><li>Son, M. S., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+biochemical+assays+to+characterize+Vibrio+cholerae+O1+biotypes:+classical+and+El+Tor.">Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).</li><li>Kovacikova, G., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+virulence+gene+expression+in+Vibrio+cholerae+by+quorum+sensing:+HapR+functions+at+the+aphA+promoter.">Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter.</a> Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+functional+quorum-sensing+systems+in+recently+emerged+Vibrio+cholerae+toxigenic+strains.">The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques.">Aseptic laboratory techniques.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li><li>Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+laboratory+maintenance+of+Vibrio+cholerae.">Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae.</a> Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Dos mais de 200 V identificados. Sorogrupos de colesterol, apenas O1 e O139 têm potencial de epidemia. O serogrupo O1 pode ser dividido em dois biótipos: clássico e El Tor. No entanto, emergiram as variedades híbridas, denominadas Variantes 13 , 17 de El Tor , que possuem o fundo do biótipo El Tor e apresentam características clássicas 8 , 9 , 10</s...

A cólera é uma doença do intestino delgado distal causada pelo consumo de alimentos contaminados ou água contendo a bactéria Gram-negativa Vibrio cholerae aquática. Os sintomas da cólera incluem vômitos e diarréia aquosa incontrolável, levando a desidratação severa, que, se não for tratada adequadamente, resultará em morte. V. Cholerae pode ser dividido em mais de 200 serogrupos com base na estrutura do antígeno O de lipopolissacarídeo de superfície celular. No entanto, apenas 2 sorogrupos, O1 e O139, mostraram potencial epidêmico ou pandêmico 1 , 2 . Além disso, o serogrupo O139 foi isolado principalmente no Sudeste Asiático 3 , 4 , enquanto o serogrupo O1 está distribuído em todo o mundo. Além disso, o sorogrupo O1 pode ser dividido em 2 biótipos principais: clássico e El Tor. O biótipo clássico foi responsável pela primeira pandemia de cólera 6Entre 1817 e 1923. A sétima pandemia em curso é resultado do biótipo El Tor, que deslocou globalmente o biótipo clássico no ambiente 5 , 6 , 7 . Recentemente, surgiram tensões que contêm características distintivas dos biótipos clássicos e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e desde então foram denominadas variantes 13 , 17 de El Tor. Algumas variantes de El Tor demonstraram capacidades de virulência elevadas com progressão de doença mais rápida e grave do que a observada anteriormente, enfatizandoA necessidade de uma abordagem mais abrangente para identificação de agentes e prevenção e tratamento de doenças 8 , 9 , 18 . Embora a identificação do biótipo não dê de imediato o tratamento, os avanços no desenvolvimento da vacina e nos futuros agentes terapêuticos podem beneficiar da distinção biótipo. A primeira série de protocolos listados aqui permitirá que os investigadores mantenham corretamente V. Cepas de cólera em um ambiente de laboratório. Consistência e análise subseqüente requerem a preparação de estoque e o crescimento de isolados, o que não é biótipo-dependente. No entanto, para induzir de forma otimizada a expressão de genes de virulência, são necessárias técnicas de cultura de bioótipo independentes 19 . Além disso, a preparação para vários ensaios genéticos e bioquímicos é descrita neste manuscrito. A toxina da cólera (CT) e a toxina co-rePilula gulosa (TCP) são dois principais fatores de virulência controlados pelo regulador mestre ToxT em ambos biótipos do V. Serogrupo 20 de cholerae O1. CT é uma toxina bipartida composta por cinco CtxB Subunidades envolvendo uma única subunidade CtxA, e é responsável pela perda rápida de eletrólito associada à cólera. TCP é um pilus tipo IV codificado pelo operão tcp ( tcpABQCRDSTEF ), e está envolvido na fixação e colonização do intestino delgado distal. TcpA é o primeiro gene do operão tcp que codifica as subunidades individuais de pilina essenciais para a construção do pilus 8 . A sequência de genes para ctxA é completamente conservada entre biótipos clássicos e El Tor, enquanto ctxB e tcpA diferem entre os dois biótipos, mas são conservados dentro de cada biótipo 8 . CtxB é completamente conservado entre biótipos, exceto em dois pontos básicos(115 e 203). No biótipo de El Tor, a timina reside nas posições de base 115 e 203, enquanto o biótipo clássico contém citosina nestas bases. TcpA é completamente conservado dentro de cada biótipo, mas diferem em bases múltiplas entre biótipos. Essas distinções genéticas servem como marcadores primários de identificação de biótipo e, depois de seqüenciar o produto de amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo esses locais, as seqüências isoladas podem ser comparadas com O395 ou WT El Tor N16961 de tipo selvagem (WT) para determinar o fundo do biótipo De CT e TCP, respectivamente, em um isolado de V. cholerae . Numerosos protocolos foram desenvolvidos para caracterizar as distinções fenotípicas entre os biótipos clássicos e El Tor 21 , 22 , 23 . A polimixina B é um antibiótico peptídico que compromete a integridade da membrana celular externa em bactérias Gram-negativasE a resistência à polimixina B podem ser visualizadas através do ensaio de resistência à polimixina B 21 . O citrato é um substrato primário do ciclo do Kreb e a capacidade de metabolizar o citrato como única fonte de carbono pode ser determinada utilizando o ensaio de metabolismo de citrato 22 . HapR codifica um regulador global e o regulador mestre de sensor de quorum em V. cholerae, HapR, que se liga a várias regiões promotoras e regula a expressão de genes e operões 24 . Algumas cepas patogênicas de V. cholerae têm uma mutação de mudança de quadro natural no gene hapR que causou a perda da densidade da expressão de genes da virulência 24 , 25 . Medir a atividade de protease regulada por HapR usando meios de agar de leite permite ao pesquisador identificar se um isolado particular contém um HapR 23 funcional. oTestes de análise de hemólise para a capacidade de uma cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisam glóbulos vermelhos; O grau de hemólise pode ser visualizado em placas de agar de sangue 23 . A mobilidade é freqüentemente associada à virulência em V. cholerae e pode ser analisada usando placas de ágar de motilidade 23 . O teste de Voges-Proskauer prova a capacidade de uma cepa para fermentar a glicose como única fonte de carbono e produzir o acetato de subproduto 21 . Com o surgimento de variantes de El Tor, é difícil prever os resultados de qualquer teste fenotípico dado sem rastreio genotípico extensivo e antes de deduzir o fundo biótipo de V. Isolados de cholerae , recomenda-se a realização desta montagem de ensaios 23 e compare os resultados com as cepas de referência como na Tabela 2 . Aqui, avançamos uma série de protocolos, utilizando coletivamente o referidoEnsaios fenotípicos e fenotípicos referentes a uma abordagem mais abrangente para a caracterização de V. Biótipos de cólera . Além disso, descrevemos as distinções genotípicas e fenotípicas do V conhecido. Variantes de cholerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), em comparação com as estirpes de referência de biótopos comummente usadas (WT clássico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabela 1 ). O surgimento de variantes de El Tor apresentou desafios à confiabilidade de protocolos de caracterização de bióto simples de ensaio previamente empregados; No entanto, este sistema de identificação de múltiplos ensaios permitirá uma caracterização mais confiável do V clínico e ambiental. Isolados de cólera .

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glycerol</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agar with brain-heart infusion</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&amp;amp;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&amp;amp;_dynSessConf=1766917479792147141&amp;amp;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&amp;amp;lastLanguage=en&amp;amp;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&amp;amp;_D%3AcurrentLanguage=+&amp;amp;currentLanguage=en&amp;amp;_D%3AlastLanguage=+&amp;amp;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P288500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Blood Agar Plates</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C;&amp;nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A73500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromothymol Blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=B38810&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Cirtric acid &amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S311500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator&amp;trade; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr><tr><td>Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Corrosive;&amp;nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A144212&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P217500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P285500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P250500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr><tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=M63500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&amp;amp;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&amp;amp;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Broth</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S374500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S27110&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S233500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S218500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophtometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>Nonfat dry milk</td><td>Nestle Carnation</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=FB0875714&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Store at 2-4 &amp;deg;C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_pageLabel=search_page&amp;amp;sfMode=search&amp;amp;sfStartNumber=1&amp;amp;clearQR=true&amp;amp;js=1&amp;amp;searchString=1840148&amp;amp;database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&amp;amp;tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Triphenyltetrazolium chloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=BP1521&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

A bactéria aquática Gram-negativa Vibrio cholerae é o agente etiológico da doença gastrointestinal infecciosa cólera. Devido à prevalência global e à gravidade desta doença, V. Cholerae tem sido amplamente estudado em ambientes ambientais e laboratoriais, exigindo técnicas adequadas de manutenção e cultura. Classical e El Tor são dois biótipos principais que compõem o V. Serogrupo de cholerae O1, cada um apresentando características genotípicas e fenotípicas únicas que fornecem mecanismos confiáveis ​​para a caracterização de biótipos e requerem indução de condições de cultivo que induzem a virulência. Independentemente do biótipo da tensão causadora para qualquer infecção ou surto, o tratamento padrão para a doença envolve a terapia de reidratação suplementada com um regime de antibióticos. No entanto, a classificação do biótipo pode ser necessária para estudos laboratoriais e pode ter impactos mais amplos no campo biomédico.No início de 2000, foram identificados isolados clínicos que exibem traços genotípicos e fenotípicos de biótipos clássicos e El Tor. Os híbridos recentemente identificados, denominados variantes de El Tor, fizeram com que a identificação de biótodos isolados clínicos e ambientais se tornasse mais complexa do que os protocolos tradicionais de identificação de ensaio simples. Além de descrever V. Técnicas de manutenção e cultura geral de cholerae , este manuscrito descreve uma série de ecrãs genéticas baseadas em PCR específicas para genes ( ctxB e tcpA ) e testes fenotípicos (resistência a polimixina B, metabolismo de citrato, atividade proteolítica, atividade hemolítica, motilidade e metabolismo de glicose através de Voges- Ensaio Proskauer) usado coletivamente para caracterizar e / ou distinguir entre biótipos clássicos e El Tor. Juntos, esses ensaios fornecem uma abordagem sistemática eficiente para ser usada como alternativa ou, além disso, em experiências caras e intensivas em mão-de-obra na caracterizaçãoÇão de V. Isolados clínicos (e ambientais) de cholerae .

Para uma manutenção e uso adequados de qualquer tensão bacteriana, recomenda-se conhecer o tempo de duplicação da (s) tensão (ões) de interesse. Aqui, as taxas de crescimento variáveis ​​dos V comummente utilizados . As cepas de colesterol foram demonstradas através de uma curva de crescimento, e tempos de duplicação aproximados foram calculados usando regressão linear. WT El Tor N16961 e a variante El Tor MQ1795 demonstraram tempos de duplicaç...

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Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Este manuscrito descreve as técnicas adequadas de manutenção de Vibrio cholerae , além de uma série de ensaios bioquímicos, utilizados coletivamente para a diferenciação rápida e confiável entre a V clínica e ambiental. Biótipos de cholerae em um ambiente de laboratório.

Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolados clínicos e ambientais

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

laboratory-techniques-used-to-maintain-differentiate-biotypes-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.8K visualizações.  Plymouth State University.  Este manuscrito descreve as técnicas adequadas de manutenção de Vibrio cholerae , além de uma série de ensaios bioquímicos, utilizados coletivamente para a diferenciação rápida e confiável entre a V clínica e ambiental. Biótipos de cholerae em um ambiente de laboratório. 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

I am Es.In MindUP, we study biology of human pathogens in non hosts environments. Many human pathogens after exiting their human host have to survive in the environment before infecting another host. So our goal is to better understand processes that control survival of human pathogens in the environment.And our goal is to then better understand transmission dynamics of infectious agents. So we are using Vibrio cholera, the cost of agent of diarrhea, disease, cholera as a model organism. Vibrio cholera is a facultative human pathogen and it has an aquatic lifecycle.Therefore, it provides us great opportunity to study the survival of human pathogen in a natural environment. There are many tools to study this organism. Its genome is completely sequenced and there are micro array representing every gene in the genome.And furthermore, there are many tools that we can manipulate the genome of this organism. My research program takes advantage of these tools and integrates them to study aquatic lifecycle of cholera. So in our experiments, we try to simulate the aquatic environments that organism lives in.And then we would like to know how does this organism so senses fluctuations in its environment with respect to nutrient load, temperature, salinity, or other biological stressors such as pages and tzo? So in aquatic environment, RIA cholera is found either in a free living form or in a surface attached form. And the surface attached forms are known as biofilms, which are simply composed of microorganisms and their extra polymeric substances, which can be exo polysaccharide and proteins and sometimes DNA.And this matrix acts as a glue and hold the organism together. And when grown in biofilm mode, these organisms are actually resistant to fluctuating parameters of their environments and they can be better protected from, for example, phage and proteasome probations. And these are factors that are controlling abundance of microorganisms in the environment.Some of the recent techno technological advance that helped us in our studies are the completion of the genome sequence of the organism and development of microray technology. Using these technologies, we can determine at the whole genome level how this organism responds to major fluctuations in its environment such as nutrient deprivation or changes in temperature. Or one of our major goal is to integrate our whole genome expression studies to a network analysis.So we would like to identify genetic regulatory network that controls response of to fluctuating environmental parameters. We would like to be able to model behavior of organism in the environment. And also we still do not know when in the environment with whom Vibra Cide interacts with.We do not know much about ecology of this organism, and we also do not know relevance of the genes and processes we identified to be important for survival of this organism in the laboratory to the real world. No are the genes that we identified express when Ria cholera is present in natural environment. We also would like to be able to identify and culture organisms that Vibrio Cora interacts with because in the environment, Vibrio Cora is a part of the complex microbial community.So I think understanding biology of Vibrio Cora in natural environment would be a, it's a challenging and it's critical for us to understand biology of the organism. Within the next five years, I hope that we would be able to better characterize op polysaccharide components of biofilms. For example, in Vibrio cholera, we still do not know structure of the op polysaccharide that is holding the cells together.We also do not know all the components of biofilm metrics. Eventually I think it be great to be able to quantify components of the biofilm metrics in natural biofilms of these organisms. I think another major challenge is to study, be OC in natural environment.And I hope that we would be able to take advantage of comparative genomic studies and combine whole genomic expression profiling comparative genomics to better understand evolution of IBR cholera as a pathogen.

Vibrio cholerae: organismo modelo para estudar Patogênese Bacteriana - Entrevista

Biologia

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - um método para modificar geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

Cultivar e Manter<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em um ambiente anaeróbico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; E outro<em&gt; Vibrio</em&gt; Espécies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Indução de diferenciação celular e imagens de células<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer e Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Ensaio de coincubação para quantificar interações competitivas entre isolados de Vibrio fischeri

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de

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Vibrio cholerae: organismo modelo para estudar Patogênese Bacteriana - Entrevista

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

TransFLP - um método para modificar geneticamente

Cultivar e Manter

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de

Indução de diferenciação celular e imagens de células

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Ensaio de coincubação para quantificar interações competitivas entre isolados de Vibrio fischeri

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes