Este protocolo simplifica e esclarece os métodos de implementação da síntese de auto-proteína por não especialistas. O acesso aprimorado a esses métodos ajudará a desmarketizar a plataforma e o amplo conjunto de aplicativos que ela permite. As principais vantagens dessa técnica são a velocidade, o custo-efetividade e a facilidade de reação configurada em comparação com outras plataformas de síntese de auto-proteína.
Nossa plataforma pode habilitar uma série de aplicações, incluindo genômica funcional, higominagem, biosensores, kits educacionais e com pequenas modificações, engenharia metabólica e expansão de código genético. Embora essa técnica exija apenas treinamento laboratorial básico, novos usuários devem se familiarizar com técnicas como a sônica para execução bem sucedida do protocolo. Para iniciar este procedimento prepare todas as células de mídia e cultura E.coli, conforme descrito no protocolo de texto.
Coloque uma garrafa de centrífugas de um litro em um banho de água gelada. Uma vez que as culturas OD600 atinjam 3.0, despeje a cultura celular na garrafa gelada. Usando um equilíbrio de feixe duplo, adicione água a uma segunda garrafa de centrífugas de um litro até que ele pese o mesmo que o primeiro para criar um equilíbrio para a centrífuga.
Depois de pré-resfriamento da centrífuga a quatro graus Celsius, centrifugar as garrafas a 5.000 g e a 10 graus Celsius por 10 minutos para pelotar as células. Depois disso, despeje lentamente e elimine o supernaspe. Coloque a pelota de célula no gelo.
Usando uma espátula estéril raspe a pelota celular da garrafa centrífuga e transfira-a para um tubo cônico frio de 50 mililitros. Adicione 30 mililitros de tampão S30 frio suplementado com dois mililitros DTT e resuspenda a pelota por vórtice em rajadas curtas com períodos de descanso no gelo até que a pelota esteja totalmente ressuspendida sem pedaços. Depois disso, use outro tubo cônico de 50 milímetros cheio de água como equilíbrio para centrifugar a amostra a 5.000 g e 10 graus Celsius por 10 minutos.
Despeje e elimine o supernatante. Resuspene a pelota com 20 a 25 mililitros de tampão S30 frio. Centrífuga a 5.000 g e a 10 graus Celsius por 10 minutos.
Despeje e elimine o supernatante. Em seguida, adicione 30 mililitros de tampão S30 e resuspense a pelota usando um vórtice como descrito anteriormente. Coloque três tubos cônicos pré-pesados, frios, 50 mililitros.
Utilizando um enchimento de pipeta sorológico com uma pipeta estéril, aliquot dez 10 mililitros de suspensão de pelotas em cada tubo. Centrifugar todos os tubos usando saldos apropriados conforme necessário a 5.000 g e 10 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, despeje e elimine os supernantes.
Limpe cuidadosamente o interior de cada tubo e tampa com um tecido limpo para remover o tampão de acesso, certificando-se de evitar tocar na pelota. Utilizando um equilíbrio analítico, ressunam os tubos e relatam o peso final da pelota para cada tubo. Para começar, adicione um mililitro de tampão S30 frio com 2 mililitros DTT por um grama de massa celular a cada pelota.
Use um vórtice para resuspensar as pelotas como descrito anteriormente. Em seguida, transfira 1,4 mililitros de cada pelota resuspended em tubos de microcentrifuge separados de 1,5 mililitro. Coloque um tubo em um banho de água gelada em um béquer e posicione a sonda sonicator de tal forma que não toque na parte inferior ou nas laterais do tubo.
Sonicar o tubo com a amplitude fixada em 50% durante 45 segundos, seguido por 59 segundos de descanso. Certificando-se de fechar e inverter os tubos durante os períodos de folga. Imediatamente após a sônicação estiver completa, adicione 4,5 microliters de um DTT molar no lise.
Inverta o tubo várias vezes para misturar e, em seguida, colocá-lo no gelo. Repita este processo, sonicando e adicionando DTT para cada tubo de células resuspended. Centrifugar as amostras a 18.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos.
Depois disso, pipeta cada supernacido em um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro, deixando alguns supernadíferos para trás para garantir que a pelota não seja perturbada. Leve os tubos de supernaspe para a plataforma de agitação de uma incubadora e incuba-os a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM por 60 minutos. Esta é a reação do segundo turno.
Em seguida, centrifugar as amostras a 10.000 g e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova cada supernante sem perturbar a pelota transferindo-os para novos tubos. Crie muitas alíquotas de 100 microliter do extrato para armazenamento.
Primeiro, descongelar a solução A, solução B, o modelo de DNA, o extrato BL21DE3, T7 RNA Polymerase, e uma alíquota de água de grau molecular no gelo. Em seguida, rotule a quantidade necessária de tubos de microcentrifuuge necessários para a reação do CFPS. Misture cada reagente por pipetação ou vórtice, em seguida, adicione a solução ao tubo de reação rotulado, certificando-se de não vórtice do extrato celular, mas, em vez disso, inverter o tubo para misturar.
Certifique-se de que a reação final está bem misturada e combine em uma única conta de 15 microliter na parte inferior de cada tubo. Incubar cada reação sem tremer a 37 graus Celsius por quatro horas, ou a 30 graus Celsius durante a noite. Para começar, obtenha uma placa de 96 poços e carregue 48 microliters de 0,05 molar HEPES em pH 8 em cada poço necessário para quantificação.
Em seguida, remova os tubos de reação da incubadora. Misture cada reação ao subir e descer e transfira dois microliters de cada reação para os poços que contêm HEPES. Misture cada poço por pipetting para cima e para baixo.
Depois de todas as reações serem carregadas e misturadas, carregue a placa em um fluorômetro e meça os fluorescentes de ponto final SFGFP usando um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 510 nanômetros. Use uma curva padrão gerada anteriormente para determinar a concentração de GFP superpastado a partir da leitura fluorescente obtida. Neste estudo, é investigada uma preparação de extrato de E.coli baseada em sônica.
As pelotas celulares e o extrato celular estão estáveis a 80 graus Celsius negativos por pelo menos um ano. Além disso, o extrato celular pode sofrer pelo menos cinco ciclos de congelamento sem uma perda significativa de produtividade. Algumas etapas dentro deste protocolo podem ser variadas sem prejuízo da produtividade geral do sistema.
Mais notavelmente, as células podem ser colhidas dentro da faixa de 2,7 a 4,0 densidade óptica a 600 nanômetros sem um efeito significativo na produtividade do extrato celular. No entanto, a qualidade do DNA do modelo é uma fonte de variabilidade em lote a lote que impacta os rendimentos volumosos da reação cfps. Isso é resolvido purificando o DNA através de um Midi ou Maxiprep seguido de uma etapa adicional de limpeza de DNA.
O vaso de reação também impacta os rendimentos volumosos da reação do CFPS. Um aumento na relação superfície/volume resulta em maiores rendimentos volumosos. Para otimizar os rendimentos volumosos da reação do CFPS e reduzir a variabilidade do extrato celular em lote, deve-se realizar uma titulação de magnésio para cada nova preparação do extrato.
Para extratos celulares compostos por 30 miligramas por proteína total mililitro, a concentração ideal de magnésio e o volume de extrato para minimizar o uso de reagentes e maximizar o rendimento volumoso é de 10 mililitros e cinco microliters, respectivamente. Ao variar a escala de reação, os usuários podem buscar métodos que vão desde a triagem de alto rendimento até expressões em escala maior de uma proteína alvo. Esta técnica fornece duas vantagens fundamentais, primeiro ele tela produtos proteicos mais rapidamente, e segundo, sintetiza proteínas difíceis de expressar.
Exemplos incluem proteínas que são citotóxicas ou requerem condições oxidantes para sua função. Como em qualquer procedimento laboratorial, todos os reagentes devem ser tratados com cautela. Além disso, as centrífugas devem ser sempre equilibradas e a proteção do ouvido deve ser usada durante a sônicação.
