Agradecemos ao Dr. Agnes Viale eo MSKCC Genomics Laboratory Núcleo para assistência técnica. Este protocolo foi desenvolvido com o apoio do Centro de Pesquisa do Câncer Geoffrey Beene e da Fundação Agricultor Familiar.

1. ADN e de preparação dos reagentes Nota: Este protocolo descreve o processamento simultâneo e análise de 24 amostras de tumor (por exemplo, 12 / pares normais), mas pode ser adaptado para lotes mais pequenos e maiores. As amostras de DNA pode derivar de FFPE ou tecido fresco congelado, espécimes citológicos, ou sangue. Tipicamente, tanto do tumor e tecido normal a partir do mesmo paciente será perfilado em conjunto, a fim de distinguir as mutações somáticas de polimorfismos hereditários. O protocolo começa imediatamente após a extração de DNA. <ol><li> Aliquota 50-250 ng (250 ng recomendado) do ADN extraído por amostra, diluídos em 1x Tris-EDTA (pH 8,0) tampão para um volume final de 50 ul, em Covaris tubos separados de fundo redondo. </li><li> Distorcer o DNA no instrumento Covaris E220 nas seguintes configurações de cisalhamento: 360 SEC em 10 fator de serviço, 175 PIP, e 200 ciclos por explosão. </li><li> Descongele AMPure XP Contas (Tabela 2) à temperatura ambiente. Descongele tudo buffers e enzimas no gelo antes de a etapa adequada. </li></ol> 2. Módulo Repair End - Preparação Biblioteca <ol><li> Preparar a mistura de mestre reparação fim em um tubo de microcentrífuga estéril usando os seguintes volumes por amostra: 10 ml de 10x NEBNext Fim Reação Repair Buffer (Tabela 2), 5 jul NEBNext Fim Reparação Mix enzima (Tabela 2), 35 mL estéril nuclease livre H 2 O. </li><li> Alíquota de 50 ul de cada um de DNA cortado em poços separados de uma placa de 96 poços. Adicionam-se 50 ul da mistura principal de reparação extremidade preparada para cada reacção. Incubar em um termociclador durante 30 min a 20 ° C. </li></ol> 3. Reparação Mensagem Final Clean-up <ol><li> Adicionar volume de 2x (200 mL) de AMPure XP Contas (Tabela 2) para cada amostra e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta multicanal. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Coloque no suporte magnético (Tabela 2 </forte&gt;) à temperatura ambiente durante 15 min, até que a amostra parece transparente. </li><li> Retire com cuidado e descarte claro sobrenadante tomando cuidado para não perturbar as esferas. Algum líquido pode permanecer nos poços. </li><li> Com os tubos na posição, adicionar cuidadosamente 200 mL de etanol preparada de fresco de 80% a cada amostra e incubar a placa a temperatura ambiente durante 30 seg. Cuidadosamente, remover o etanol, com uma pipeta. </li><li> Repetir passo 5, para um total de duas lavagens de etanol. Certifique-se de todo o etanol foi removido. Retirar do suporte magnético e deixar secar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Ressuspender contas secas, com 44,5 mL estéril H 2 O. Gentilmente, volume inteiro pipeta cima e para baixo 10x misturando bem. Assegurar grânulos já não estão ligados ao lado do poço. </li><li> Incubar grânulos em suspensão à TA, durante 2 min. Coloque em suporte magnético por 5 minutos até que a amostra parece clara. </li><li> Gentilmente transferir 42 mL de sobrenadante claro que contém a amostra de um novo poço. O procedimento pode ser interrompido com segurança nesta ruaep e as amostras armazenadas a -20 ° C durante 7 dias. Para reiniciar, descongelar amostras congeladas no gelo antes de prosseguir. </li></ol> 4. Preparação Biblioteca - dA-tailing Módulo <ol><li> Preparar a mistura de mestre dA-Tailing num tubo de microcentrífuga estéril, usando os seguintes volumes por exemplo: 5 ul de 10x NEBNext Reacção dA-Tailing Buffer (Quadro 2), 3 ul (3&#39;-5 &#39;-exo) Fragmento Klenow (Tabela 2 ). </li><li> Adicionar 8 mL da mistura principal preparado dA-Tailing a cada cavidade contendo 42 ul de DNA reparado nas extremidades. Incubar em um termociclador durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Execute um post dA-tailing limpeza: Repita os passos 3,1-3,8 usando volume de 2x (100 mL) de contas, mas ressuspender em H 2 O estéril para um volume final de 33,75 mL. O procedimento pode ser interrompido de forma segura a este passo, e as amostras armazenadas a -20 ° C durante 7 dias. Para reiniciar, descongelar amostras congeladas no gelo antes de prosseguir. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Preparação Biblioteca - Adaptador Ligadura Módulo <ol><li> Preparar a mistura de mestre ligadura num tubo de microcentrífuga estéril, usando os seguintes volumes por amostra: 10 ul de 5x NEBNext rápida ligadura de tampão de reacção (New England Biolabs, Tabela 2), 5 ul de DNA ligase de T4 rápida (Tabela 2). </li><li> Adicionam-se 15 ul da mistura principal Ligadura para cada poço contendo o ADN dA-cauda. </li><li> Adicionar 1,25 mL da apropriada uM NEXTflex adaptador de código de barras 25 (Tabela 2) para cada poço. Cada amostra deve receber uma placa com código de barras separado. Incubar em um termociclador durante 15 min a 20 ° C. </li><li> Realizar um adaptador de pós ligadura limpeza: Repita os passos de 3,1-3,8 usando volume de 1x (50 mL) de contas, mas ressuspender em H 2 O estéril para um volume final de 50 ul. </li><li> Repita os passos de 3,1-3,8 para um segundo volume 1x (50 mL) de limpeza, mas ressuspender em H 2 O estéril a umvolume final de 23 ul. O procedimento pode ser interrompido de forma segura a este passo, e as amostras armazenadas a -20 ° C durante 7 dias. Para reiniciar, descongelar amostras congeladas no gelo antes de prosseguir. </li></ol> 6. Ampliação da Biblioteca <ol><li> Preparar a mistura de mestre KAPA HiFi num tubo de microcentrífuga estéril, usando os seguintes volumes por amostra: 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tabela 2), 1 ul de cada uma de 100 uM Iniciador 1 e iniciador 2 (Tabela 3). </li><li> Adicionar 27 ul da mistura de base para cada uma das cavidades contendo o produto de ligação. Definir pipeta a 50 ul e gentilmente pipeta todo o volume para cima e para baixo 10x. </li><li> Colocar no termociclador para os seguintes ciclos de PCR: desnaturação inicial de 45 segundos a 98 ° C, 10 ciclos de 15 seg a 98 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, e extensão final de 1 min a 72 ° C. </li><li> Realizar uma pós amplificação limpeza: Repita os passos de 3,1-3,8 usando1x o volume (50 mL) de AMPure XP grânulos, e voltar a suspender em água estéril para um volume final de 30 ul. </li><li> Quantificar a concentração de cada biblioteca usando Qubit Ampla Gama Ensaio (Life Technologies, Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca Hibridização, Wash, e amplificação <ol><li> Descongele bloqueadores de oligonucleotídeos universais e índice (Tabela 3), SeqCap EZ Biblioteca, e componentes de captura Nimblegen (DNA COT, tampão de hibridação 2x, e hibridação componente A, Tabela 2) no gelo. Todos os bloqueadores de oligonucleótidos são armazenados em stocks de trabalho de 1 mM. Nossa SeqCap EZ Library é um conjunto de design personalizado de sondas de captura, abrangendo todos os exons codificadores de proteínas de 279 genes associados ao câncer, embora possam ser utilizados outros projetos personalizados e de catálogo. </li><li> Prepare uma piscina 1 mM de bloqueadores índice de oligonucleotídeos correspondentes ao código de barras específico anúnciosequências Aptor usados ​​na preparação de biblioteca. Combine 1 ml de cada bloqueador, e vortex. </li><li> Em uma nova estéril de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo, adicionam-se 5 ul de DNA COT 1mg/ml, 2 ul de 1 mM bloqueador universal e 2 ul da piscina mM de bloqueadores índice de oligonucleótidos 1. </li><li> Piscina 24 bibliotecas com código de barras em uma única reação. Adicionar um total de 1-3 ug de reunidas, biblioteca sequência de código de barras (preparado anteriormente) à mistura de captura. Para 24 amostras, é recomendado 100 ng por amostra. Ao reunir os tumores e as amostras normais correspondentes, é recomendável adicionar mais biblioteca de tumor (por exemplo, 100 ng por tumor e 50 ng por normal) de modo que eles são sequenciados para uma maior profundidade de cobertura. </li><li> Feche a tampa do tubo e fazer 15-20 furos na parte superior da tampa com um 18-20 G ou agulha menor. Speed ​​Vac a amostra de ADN da biblioteca / COT / oligos amplificados num concentrador de vácuo o DNA em alta temperatura (60 ° C). </li><li> Uma vez completamente seco para baixo, hidratar com 7,5 l de 2x hybriditampão zação e 3 l de hibridização componente A. O tubo agora deve conter o seguinte: 5 mg COT DNA, mg variável biblioteca amostra amplificada, 1000 pmol de Universal e Índice Oligos, tampão 7,5 mL 2x hibridização, 3 componente mL hibridização A em um volume total de 10,5 mL. </li><li> Cobrir os orifícios na tampa, com um pequeno pedaço de fita de laboratório. Vortex a amostra por 10 segundos e centrifugar a velocidade máxima por 10 segundos. </li><li> Incubar a amostra a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturar o ADN, seguido de centrifugação à velocidade máxima durante 10 segundos à temperatura ambiente. </li><li> Em um novo 0,2 ml PCR tubo tira, preparar 2,25 mL alíquota de SeqCap EZ sondas de captura Biblioteca e 2,25 mL de estéril nuclease livre H 2 O e adicionar o conteúdo do passo 7.7. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10x. </li><li> Incubar no termociclador a 47 ° C durante 48-96 horas. Definir e manter a temperatura da tampa do termociclador a 57 ° C. </li><li> Folbaixos passos no Capítulo 6 do Manual do Usuário do SR NimbleGen SeqCap EX Biblioteca v3.0 (Tabela 2) para a lavagem e recuperação do DNA capturado. </li><li> Segue passos no capítulo 7 do protocolo Roche NimbleGen para amplificação do DNA capturados com as seguintes modificações: <ul type="disc"><li> Use 2x KAPA HiFi Polimerase (Tabela 2) em vez de Phusion High-Fidelity PCR Master Mix </li><li> Utilizar 100 uM Iniciador 1 e iniciador 2 listadas na Tabela 3. </li><li> Executar os seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 98 ° C durante 30 seg, 11 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 segundos, e extensão final a 72 ° C durante 5 min . Manter a 4 ° C. </li></ul></li><li> Quantificar a concentração de DNA amplificado capturado usando Qubit alta sensibilidade do ensaio (Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Analisar a qualidade do DNA capturado usando Agilent Biochip de ADN analisador HS (Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante. <ul type="disc"><li> O rendimento de PCR deve ser de pelo menos 100 ng (gama 100-1000 ng). </li><li> O comprimento médio de fragmento deveria ser entre 150-400 pares de bases. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hi-Seq Seqüenciamento <ol><li> Diluir o DNA capturado ampliado para duas horas e coloque a amostra em uma única pista de uma célula de fluxo Illumina HiSeq 2000. Seqüência emparelhado-end par 75 de base lê de acordo com as instruções do fabricante. Em nossa experiência, uma pista é suficiente para produzir uma cobertura única seqüência de 500 700x por amostra através de 279 genes para uma piscina de 24 amostras. </li><li> Software Illumina (Análise Real Time) irá converter imagens de alta resolução para intensidades de cluster para basear chamadas e índices de qualidade. Use casava demultiplex dados de acordo com a identidade de código de barras e gerar arquivos FASTQ individuais para cada amostra. </li></ol> 9. Dados Analysis <ol><li> Seqüências adaptadoras guarnição da extremidade 3 &#39;da seqüência lê arquivos FASTQ usando Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). O comprimento mínimo de sobreposição (-O) é 3, com uma taxa de erro (-e) de 1%. O comprimento base mínima para a retenção de emparelhado lê após o corte é 25. </li><li> Alinhe seqüência lê a Referência hg19 genoma humano utilizando a ferramenta de Burrows-Wheeler Alinhador (BWA) 12. Execute as etapas de pós-processamento, incluindo a marcação duplicada, realinhamento seqüência múltipla local, e recalibração índice de qualidade de base usando a Análise de Genoma Toolkit (GATK) de acordo com as suas melhores práticas padrão ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = melhores práticas</a> ) 13. Ao traçar o perfil de várias amostras do mesmo paciente (por exemplo, tumor combinados e normais), realinhamento seqüência múltipla local deve ser desemMED em conjunto. A saída dessas etapas de pós-processamento é um arquivo BAM separado para cada amostra, que contém todas as seqüências, qualidade e informação de alinhamento e pode ser carregado diretamente na Integrative Genomics Viewer (IGV) para visualização de leituras e seqüência de variantes 14. </li><li> Calcular as métricas de desempenho de seqüência usando ferramentas Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Métricas informativos incluem taxa de alinhamento, distribuição de tamanho de fragmento, GC-content viés cobertura associada, captura de especificidade no alvo, PCR duplicar taxa, a complexidade da biblioteca, e significa a cobertura alvo. Os valores representativos são apresentados na Figura 1. As freqüências alélicas em locais polimorfismo comum calculados usando DepthOfCoverage de GATK são usados ​​para monitorar a contaminação por DNA independentes e para garantir que amostras pareadas veio dos mesmos pacientes. As seguintes análises computacionais dependem da presença de correspondênciaAs amostras tumorais e normais para a detecção de alterações genéticas somáticas. Tumores não coincidentes também podem ser analisados ​​utilizando-se uma amostra de controlo normal, separada, mas mais mutações somáticas não pode ser facilmente distinguida de variantes de sequências de herdadas. </li><li> Chame variantes de um único nucleotídeo somáticas (SNVS) para cada par de tumor do normal usando uma chamada mutação somática, como muTect 15, SomaticSniper 16 ou Strelka 17. Usamos muTect com critérios de filtragem modificados, permitindo variantes com baixo (não zero) contagens de alelos na amostra normal, desde que a frequência do alelo é pelo menos 5 vezes maior do tumor. Variantes recorrentemente chamados em um painel de DNAs normais são removidos como artefatos sistemáticas prováveis ​​de seqüenciamento ou alinhamento. Cada SNV passando filtros é, então, cuidadosamente revistos usando IGV. </li><li> Chame indels somáticos para cada par tumor normal utilizando algoritmos como SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 ou 19 SOAPindel </sup&gt;. Usamos SomaticIndelDetector com os seguintes critérios: pelo menos 10% de frequência de alelos com pelo menos três leituras de apoio, ou, pelo menos, 2% de frequência de alelos com, pelo menos, 10 de suporte lê. Nós permitir indels com baixo (não zero) contagens de alelos na amostra normal, desde que a frequência do alelo é pelo menos 5 vezes maior do tumor. Indels chamados em um painel de ADN normais são removidos, como acima. Cada indel passando filtros é, então, cuidadosamente revistos usando IGV. </li><li> Extrapolar cópia status de número a partir da cobertura de seqüência em exons alvo. Para cada amostra individual, realizar uma normalização Loess de cobertura média seqüência para todos os exons alvo, regressão sobre percentual GC. Ajustar os valores de cobertura unnormalized subtraindo o ajuste loess e adicionando a cobertura média de toda a amostra. Calcule a razão da cobertura seqüência normalizada em todos os exons alvo para pares tumorais normal. Na ausência de uma amostra normal combinado e / ou para diminuir o ruído, outro diplóide pareados por sexopodem ser utilizados controlos normais que faltam variantes do número de cópia da linha germinativa. Determine os ganhos no número de cópias somáticas e perdas com base em aumentos ou diminuições no índice de cobertura. </li><li> Chamar rearranjos envolvendo somáticas genes do cancro, onde, pelo menos, um ponto de interrupção genómico cai dentro ou próximo de um intervalo alvo do genoma. Algoritmos sugeridos incluem GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22, e Dranger 23. Intrachromosomal inversões, duplicações e deleções, em tandem podem ser distinguidos com base na posição relativa e a orientação de apoiar lê em pares discordantes. Todos os rearranjos candidatos devem ser revistos manualmente usando IGV. Recomendamos validação experimental por PCR e seqüenciamento Sanger através dos pontos de interrupção de rearranjo putativos. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Dr. Berger recebeu honorários de consultoria e financiamento para pesquisa da Fundação de Medicina, uma empresa de diagnóstico de câncer.

Nosso ensaio IMPACTO produz uma alta taxa de alinhamento, de alta taxa de on-alvo, cobertura alvo elevado e alta sensibilidade para detecção de mutações, indels e copiar alterações numéricas. Nós demonstramos a capacidade de nosso ensaio IMPACTO a seqüência de DNA de ambos fresco congelado e arquivados amostras FFPE de entrada de baixa DNA. Ao realizar o seqüenciamento exon alvo de genes-chave associados ao câncer, pode-se atingir a cobertura seqüência muito profundo para os exons desses genes mais crític...

A identificação de eventos genéticos tumorais &quot;driver&quot; em oncogenes chave e genes supressores de tumor tem um papel fundamental no diagnóstico e no tratamento de muitos tipos de câncer 1. Esforços de pesquisa em larga escala utilizando sequenciamento paralelo em massa &quot;de última geração&quot; permitiram a identificação de muitos desses genes associados ao câncer nos últimos anos 2. No entanto, essas plataformas de sequenciamento exigem tipicamente grandes quantidades de DNA isoladas de tecidos congelados frescos, representando, assim, uma grande limitação na caracterização e análise de mutações de DNA de tecidos conservados, como a parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras tumorais. Melhoria esforços eficiente e confiável para caracterizar a informação genômica &quot;acionáveis&quot; a partir de amostras de tumores FFPE permitirá a análise retrospectiva de espécimes previamente inclinadas e ainda incentivar abordagens individualizadas para tratamento de câncer. Tradicionalmente, d molecularlaboratórios iagnostic têm contado com metodologias baixo rendimento demoradas, como sequenciamento Sanger e PCR em tempo real para a mutação do DNA profiling. Mais recentemente, métodos de maior rendimento, utilizando PCR multiplexada ou genotipagem de espectrometria de massa foram desenvolvidos para investigar mutações somáticas recorrentes nos genes chave do cancro 3-5. Estas tentativas, no entanto, são limitadas na medida em que apenas predeterminados &quot;ponto quente&quot; mutações são ensaiadas, tornando-os inadequados para a detecção de mutações de inactivação nos genes supressores tumorais. Sequenciamento paralelo em massa oferece várias vantagens em relação a estas estratégias, incluindo a capacidade de interrogar exons inteiros de mutações comuns e raros, a capacidade de revelar classes adicionais de alterações genômicas, tais como os ganhos e perdas no número de cópias, e maior sensibilidade de detecção em amostras heterogêneas 6, 7 . Seqüenciamento do genoma inteiro representa a abordagem mais abrangente para a descoberta da mutação, embora seja relativaly caro e incorre em grandes demandas computacionais para análise e armazenamento de dados. Para aplicações clínicas, onde apenas uma pequena fração do genoma podem ser de interesse clínico, duas inovações específicas em tecnologia de seqüenciamento foram transformadora. Primeiro, através baseada em hibridização captura exon, pode-se isolar o DNA correspondente a genes-chave associados ao câncer de profiling mutação alvejado 8. Em segundo lugar, através da ligadura de códigos de barras molecular (ou seja, seqüências de DNA 6-8 nucleotídeos de comprimento), pode-se reunir centenas de amostras por sequenciamento de correr e aproveitar plenamente a capacidade cada vez maior de instrumentos de seqüenciamento de massivamente paralelo 10. Quando combinadas, estas inovações permitem que os tumores de ser perfilado para menor custo e com maior rendimento, com menores exigências computacionais 11. Além disso, através da redistribuição de cobertura de sequência com apenas os genes mais importantes para a aplicação particular, pode-se Achieve maior profundidade seqüenciamento de maior sensibilidade de detecção de eventos de baixa freqüência do alelo. Aqui nós descrevemos nosso ensaio IMPACT (Integrated Mutação Profiling de Metas Câncer acionável), que utiliza a captura de código de barras no exon piscinas biblioteca seqüência por hibridização com oligonucleotídeos personalizados para capturar todos os exons codificadores de proteínas e selecione íntrons de 279 genes-chave associados ao câncer (Tabela 1 ). Esta estratégia permite a identificação de mutações, indels, alterações no número de cópias e selecione rearranjos estruturais envolvendo estes 279 genes. O nosso método é compatível com o DNA isolado a partir de ambos os tecidos congelados frescos e FFPE, bem como aspirados por agulhas finas e outros espécimes citológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Os esforços para detectar e investigar mutações oncogênicas chave provaram valiosos para facilitar o tratamento adequado para pacientes com câncer. O estabelecimento de alto rendimento, massivamente paralelo sequenciamento &quot;de última geração&quot; tem ajudado a descoberta de muitas dessas mutações. Para aumentar a utilidade clínica e de translação desta tecnologia, as plataformas devem ser de alto rendimento, custo-benefício, e compatível com parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras de tecido que podem render pequenas quantidades de DNA degradado ou danificado. Aqui, descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e multiplexados seguidos de captura baseada em hibridização de exons direcionados para a detecção de mutações associadas ao câncer em tumores congelados e frescos FFPE por sequenciamento paralelo em massa. Este método permite a identificação de mutações de seqüência, copiar alterações numéricas e selecionar rearranjos estruturais envolvendo todos os genes-alvo. Alvejado seqüenciamento exon oferece tele beneficia de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência profundo, conferindo, assim, alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Uma piscina de 24 bibliotecas de seqüência com código de barras (12 pares de tumor do normal) foi capturado usando sondas correspondentes a todos os exons codificadores de proteínas de 279 genes do cancro e sequenciados como 2 x 75 pb lê em uma única pista de uma célula de fluxo HiSeq 2000. Tumor e bibliotecas normais foram reunidas na proporção de 2:1. Métricas de desempenho das amostras para um conjunto de amostras de ADN de tumor congeladas são mostrados na Figura 1, incluindo a taxa de al...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa &quot;próxima geração&quot;. Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K visualizações.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de...

Vídeo: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Biologia

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.