Nosso protocolo permite a captura da relação genética entre lesões primárias e metastáticas através da identificação de alterações moleculares envolvidas na progressão da doença. Nosso método oferece a oportunidade de explorar a relação genética em espécimes clínicos com alta sensibilidade e especificidade. Isso se deve à integração da análise molecular e histopatológica.
A avaliação da heterogeneidade intratumor no campo da pesquisa do câncer é de suma importância na concepção de estratégias anti-tumor eficazes e nosso método é amplamente aplicável a muitos tipos de tumores sólidos. Depois de preparar e quantificar as bibliotecas de interesse, diluir cada biblioteca para uma concentração de 100 picomolares em água sem nuclease e combinar 10 microliters de cada biblioteca diluída para uma única corrida em um único tubo. Em seguida, misture as bibliotecas agrupadas por pipetting.
Para iniciar uma execução de sequenciamento, primeiro abra o navegador Torrent em um computador conectado ao sistema de sequenciamento. Planeje uma nova execução usando o modelo genérico para o aplicativo selecionado e sob a guia kits selecione o sistema Ion Proton ou o sistema Ion Gene Studio S5. Selecione o chip apropriado no menu suspenso do tipo chip e selecione Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit na lista suspensa do kit de biblioteca.
Selecione o botão Ion Chef para o kit de modelo e selecione o Kit Chef apropriado na lista suspensa do kit de modelos. Selecione o kit de sequenciamento apropriado no menu suspenso do kit de sequenciamento e selecione Ion Express na lista de dropdown do conjunto de código de barras. Na guia plugin, selecione o plugin de análise de cobertura.
Na guia do plano, selecione o genoma GRCH37HG19 na lista suspensa da biblioteca de referência. Na lista suspensa das regiões-alvo, selecione o painel apropriado a ser sequenciado. Em seguida, defina o número de códigos de barras a serem sequenciados e defina o nome do código de barras e o nome da amostra para cada biblioteca.
Para uma diluição de bibliotecas agrupadas, diluir a biblioteca de estoque com água sem nuclease para uma concentração de 25 picomolar para um chip de próton de íons e pipetas 50 microliters de cada biblioteca diluída para o fundo do tubo de amostra de biblioteca apropriado. Carregue tubos de amostra contendo as bibliotecas diluídas agrupadas no sistema de preparação da biblioteca e inicie a amplificação clonal. Para sequenciamento da próxima geração, siga as instruções na tela para inicializar o instrumento.
Quando a amplificação clonal estiver concluída, abra a porta do instrumento Ion Chef e abra a tampa da centrífuga de carregamento do chip e remova os dois chips do sistema de preparação da biblioteca. Coloque os chips em recipientes separados de armazenamento de chips e carregue um dos chips no compartimento do chip no instrumento. Em seguida, feche a tampa do compartimento do chip e inicie o sequenciamento.
Para análise de mutação, abra o plugin de análise de cobertura e utilize a saída de análise de cobertura para verificar a profundidade de cobertura e uniformidade. Use o plugin Torrent Variant Caller para executar a variante que chama a linha germe ou fluxo de trabalho somático conforme apropriado. Em seguida, baixe variantes filtradas variantes arquivos de formato de chamada e use o software preditor de efeito variante no banco de dados NCBI RefSeq para anotar as variantes.
Para estimar as variações do número de cópia, use o plugin uploader do repórter de íons para carregar os dados de sequenciamento no software do repórter de íons e use o fluxo de trabalho normal do par normal do tumor do painel de câncer para analisar os dados. Filtrar manualmente as mutações e as variações de números de cópia com base nas pontuações atribuídas pelo software e verificar as variações visualmente com o Visualizador de Genômica Integrativa. Em seguida, inspecione visualmente o alinhamento para leituras incomuns que possam gerar chamadas artefatosuais e inspecione a cobertura normalizada para todos os amplicons através de um determinado gene contra a cobertura normalizada da linha de base para verificar as variações de número de cópia.
Para cada caso, indexe as chamadas de mutação a partir do sequenciamento de tecido normal ou sangue ou tumor primário ou metástase. Sinalizar como linha de germes e descartar chamadas que também são evidentes a partir dos dados de sequenciamento do DNA da linha germinal. Bandeira como clonal ou fundador as mutações que são compartilhadas entre todas as lesões de um determinado paciente.
Em seguida, sinalizar como subclonal ou progressor as mutações que são detectadas em alguns, mas não em todas as lesões de um determinado paciente. Neste experimento representativo, o sequenciamento de várias lesões de cinco casos sólidos de neoplasia pseudopapillary visando as sequências de codificação de 409 genes relacionados ao câncer identificou um total de 27 mutações somáticas em oito genes. As mutações foram definidas como fundadoras ou clonais quando compartilhadas entre todas as lesões de um determinado paciente e progressor ou subclonal quando detectadas em alguns, mas não em todas as lesões de um determinado paciente.
Consistentemente, a coloração imunohistoquímica para beta-catetina e KMD6A foi homogênea entre as diversas lesões de casos com mutações dos genes correspondentes. A coloração moderada para KMD6A em amostras mutantes sugere que a alteração genética provavelmente alterará a função em vez da expressão da proteína. A perda de função kmd6A em tumores pancreáticos está associada à regulação do marcador de hipóxia GLUT-1.
E assim, o GLUT-1 foi expresso em casos com mutações KMD6A. A imunohistoquímica para BAP1 e TP53 confirmaram que as mutações nesses genes eram subclonais. Neste karyótipo virtual de um caso representativo mostrando a localização, proximidade e status de número de cópia de genes alterados, a análise de variação de número de cópia usando dados de sequenciamento revelou alterações em todas as amostras analisadas.
E em contraste com mutações pontuais, a maioria das alterações de variação de número de cópias eram subclonais. A validação e indexação de mutações e variação de número de cópia e o uso da comparação de DNA normal do tumor são importantes para evitar a geração de chamadas artefatosas que poderiam invalidar os resultados. Este procedimento também poderia ser aplicado a estudos de sequenciamento de genomas inteiros destinados a interrogar todo o genoma para a identificação de mutação entre lesões de diferentes tipos de tumores sólidos.
No campo da pesquisa sobre o câncer, essas técnicas são ferramentas críticas para a compreensão da biologia das doenças com importantes implicações clínicas destinadas a projetar terapias-alvo personalizadas e eficazes.
