AF foi apoiado por uma bolsa a partir do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) / acordo de subvenção CEI n ° 203413 e pelo Centro Minerva de Bio-híbrido systems.HA complexo e AI são suportadas pelo Dalia e Dan Maydan Fellowship para estudantes avançados de graduação na Universidade Hebraica de Jerusalém.

1. Criando uma matriz de Peptide <ol><li> Dividir a sequência da proteína alvo em parcialmente sobrepostos 10-20 resíduos péptidos. Variar a quantidade de sobreposição no experimento específico e os recursos do laboratório de realização, mas, em princípio, quanto mais tempo a sobreposição da melhor. Ao projetar os peptídeos ter em conta conhecidos elementos da estrutura secundária da proteína que pode ser responsável pela interação. </li><li> Encomende a matriz peptídeo projetado através de fornecedores comerciais. Aqui, o uso péptidos ligados covalentemente à matriz através do C-terminal. </li></ol> 2. Bloqueio de ligação não específica <ol><li> Adicione uma solução tampão 50 mM Tris ou fosfato contendo 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) e ajustar ao pH desejado com uma quantidade medida de HCl ou NaOH (para saber a força iónica preciso) e a força iónica desejada com NaCl . Aqui, usar um pH de 7,5 e uma força iónica de 150 mM. </li><li> Adicione uma solução de bloqueio de2,5% (w / v) de leite em pó desnatado em TBST / PBST. </li><li> Para impedir a ligação não específica, imergir a matriz em 5 ml de solução de bloqueio. Incubar a matriz durante 2-4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C num agitador. </li></ol> 3. A incubação com a Proteína <ol><li> Lava-se a matriz primeiro com 5 ml de solução de bloqueio durante 30 segundos e, em seguida, duas vezes com 5 mL de TBST / PBST, durante 5 min num agitador à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a matriz lavada com 5 ml de solução de proteína marcada com His contendo 2,5% (w / v) de leite em pó desnatado para prevenir a ligação não específica. Aqui, utilizar 4,5 ^ M de solução de proteína (STIL 500-650) dissolvido na solução de bloqueio descrito. NOTA: Normalmente de 5-10 uM de proteína são usados ​​para o rastreio, mas a concentração de proteína pode ser mesmo tão baixa como 2-3 uM, dependendo da afinidade de ligação e as concentrações locais de péptidos que se ligaram na matriz (a eficiência da síntese). O tampão no qual a proteínaé dissolvido pode variar, mas é comum para diluir a proteína utilizando a mesma solução de bloqueio descrito acima. </li><li> Incubar a matriz na solução de proteína de 3-8 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ºC. </li></ol> 4. A incubação com o anticorpo <ol><li> Lava-se a matriz três vezes com 5 mL de TBST / PBST. A primeira lavagem é de 30 seg seguido por duas lavagens de 5 min no agitador, à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a matriz lavada com 5 ml de anticorpo conjugado com HRP diluída (1: 1500) em um tampão de incubação que contém os mesmos ingredientes nas mesmas concentrações como a solução de bloqueio, durante 1 h num agitador à temperatura ambiente. O anticorpo pode ligar-se quer a proteína alvo, ou a etiqueta. </li><li> Realizar experiências de controlo testar a interacção do anticorpo com os péptidos sobre a matriz, especialmente se a matriz contém péptidos da proteína alvo (por exemplo, para estudos de oligomerização) através da repetição do mesmo protocolo sem step 3, a incubação com a proteína. </li><li> Lava-se a matriz três vezes com 5 mL de TBST / PBST. A primeira lavagem é de 30 seg seguido por duas lavagens de 5 min no agitador, à temperatura ambiente. </li></ol> 5. Leitura da Matriz <ol><li> Realizar desenvolvimento de quimiluminescência com um kit de substrato western blotting ECL. </li><li> Realizar a detecção com um analisador de imagem luminescente. </li><li> Analisar os resultados. Certifique-se de que ambos os duplicados na matriz apresentam os mesmos sinais, por isso os resultados são confiáveis. Se a estrutura do parceiro de proteína é conhecido, pesquisa sobre a estrutura para os péptidos de ligação e procurar os locais de ligação. Mesmo os péptidos que estão longe na sequência podem estar próximos uns dos outros na estrutura terciária e criar um local de ligação. </li></ol>

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	<li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptides+to+study+protein&#8211;protein+interactions.">Using peptides to study protein&#8211;protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li><li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries.">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry &amp; Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot-synthesis:+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable,+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support.">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li><li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays.">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li><li>Hansen, L. 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Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique:+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports&#8212;principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports&#8212;principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays.">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li><li>Castiel, A., Danieli, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification.">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li><li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation.">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li><li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells.">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li><li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation.">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li><li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells.">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li><li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint.">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li><li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCL/TAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell.">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li><li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity.">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li><li>Olaussen, K. a., Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines.">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li><li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Vif&#8211;A3G+interaction+using+peptide+arrays:+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides.">Mapping the Vif&#8211;A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li><li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2.">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li><li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+(tBID)+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+(MTCH2)+Protein:+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY.">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li><li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly.">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Rastreio de matriz péptido é uma excelente ferramenta para identificar os locais de ligação de uma proteína alvo nos seus parceiros. Este ensaio é rápido e fácil de realizar e os resultados podem ser obtidos em um ou dois dias de trabalho. Rastreio de matriz péptido é versátil e pode ser usado para muitas finalidades. Ele pode ser usado para a caracterização de modificações pós-tradução, tais como a fosforilação e identificação de substratos de quinases. Por exemplo: a quinase FLT3, que está relac...

Interacções proteína-proteína mediar a maior parte dos processos na célula viva. Interacções proteína Deficiência pode resultar em doença, as interacções proteicas importantes alvos de drogas. Assim, é muito importante para compreender essas interações a nível molecular. Interacções entre proteínas são estudados usando uma variedade de técnicas que vão desde os ensaios celulares e bioquímicos para ensaios quantitativos biofísicas, e estas podem ser realizadas tanto com as proteínas de comprimento completo, com domínios de proteína ou com péptidos. Peptídeos servir como excelentes ferramentas para estudar interações protéicas. Isto é porque os péptidos podem ser facilmente sintetizadas e permitem que a focagem sobre um sítio de interacção específica de um lado e de vários alvos de proteína de uma forma de alto rendimento, por outro lado 1,2. Rastreio de matriz é um péptido rápido, fácil de executar método para a obtenção de uma grande quantidade de dados sobre as interacções de uma proteína alvo com numerosos parceiros num curto espaço de tempo 3. Ao contrário de outros métodos bioquímicos ou biofísicas para detectar e analisar interacções proteína-proteína, péptido rastreio matriz requer uma concentração muito baixa de proteína e pode detectar ligação muito fraca. Matrizes de péptidos pode ser utilizada para muitas aplicações em interacções péptido-proteína, tais como mapeamento de proteína-proteína ou sítios de interacção ligando-receptor 4, interfaces de homo- ou hetero-oligomerização, anticorpos que caracterizam epitopos 5, 6 estudar as actividades enzimáticas e de alto rendimento estrutura- relação atividade (SAR) estuda 7. Para uma análise aprofundada sobre a seleção matriz peptídeo ver Katz et al. 4 Vários tipos de matrizes de péptidos existem actualmente. Existem duas principais estratégias sintéticas para preparar matrizes de péptidos: síntese dos péptidos antes anexando-os ao suporte sólido, ou a síntese de péptidos directamente no suporte sólido, utilizando principalmente o SPOT 4,8 técnica. Oos péptidos são sintetizados sobre o suporte sólido geralmente por 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) 8 química. Entre os esquemas sintéticos comuns são apego peptídeo através do terminal N (por exemplo, JPT Pepstar matrizes 9) e apego peptídeo através do terminal C (por exemplo, PEPSCAN matrizes pepchip 10, JPT pepspot matrizes 9 ​​e INTAVIS matrizes celluspot 11) 4. O suporte sólido pode variar e assim faz a química do acoplamento de péptidos a ele. Péptidos de Cis-terminados pode ser ligado a lâminas de vidro através do grupo tiol 12. O terminal N de um péptido pode ser ligado covalentemente a um grupo hidroxilo na membrana de celulose através de esterificação do aminoácido ligado 8. Aqui é apresentado um protocolo detalhado para o rastreio de matrizes de péptidos como um método para estudar as interacções proteína-proteína. A matriz que é utilizada a matriz Celluspots, que é uma micro-array contendo grande amount de pontos (duplicatas de até 384 pontos) em uma membrana de celulose pequena apoiados por uma lâmina de vidro. Isto permite trabalhar com volumes baixos de proteína e anticorpos e obtenção quantidade significativa de dados por única experiência. Essa matriz também contém alta densidade peptídeo que permite a detecção de baixa afinidade de ligação. A matriz foi utilizado para o mapeamento da interacção Stil-chfr, o que é altamente importante para o controlo da proliferação celular normal 13. Descontrolada interacção entre as duas proteínas pode levar ao desenvolvimento de cancro. Ao mapear essa interação encontramos o sítio de ligação específico e resíduos de 14 vinculativa. Isso abre o caminho para a concepção de inibidores racionais que inibem esta interação proteína-proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:231px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptide array</td>
			<td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His-probe Antibody (H-3) HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8036 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-ECL Kit</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>20-500-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skim Milk</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LAS-3000 camera&#160;</td>
			<td>FUJI film</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

Interacções proteína-proteína mediar a maior parte dos processos na célula viva e o controlo da homeostase do organismo. Interacções proteína Deficiência pode resultar em doença, as interacções proteicas importantes alvos de drogas. Assim, é muito importante para compreender essas interações a nível molecular. Interacções entre proteínas são estudados usando uma variedade de técnicas que vão desde os ensaios celulares e bioquímicos para ensaios quantitativos biofísicas, e estas podem ser realizadas tanto com as proteínas de comprimento completo, com domínios de proteína ou com péptidos. Os péptidos servir como excelentes ferramentas para estudar as interacções proteína desde os péptidos podem ser facilmente sintetizadas e permitem que o foco em locais específicos de interacção. Peptídeo matrizes permitem a identificação dos sítios de interacção entre duas proteínas, bem como a despistagem de péptidos que se ligam a proteínas alvo para fins terapêuticos. Eles também permitem alta produtividade estudos de SAR. Para a identificação dos locais de ligação, um TYPIcal matriz peptídica normalmente contém parcialmente sobrepostos 10-20 resíduos de péptidos derivados a partir das sequências completas de uma ou mais proteínas associadas da proteína alvo desejado. O rastreio da matriz para a ligação da proteína alvo revela os péptidos de ligação, o que corresponde aos locais de ligação nas proteínas parceiras, em um método fácil e rápido usando apenas uma pequena quantidade de proteína. Neste artigo descrevemos um protocolo de triagem de matrizes de peptídeos para mapear os sítios de interação entre uma proteína-alvo e seus parceiros. A matriz péptido foi concebido com base nas sequências das proteínas parceiras, tendo em conta as suas estruturas secundárias. As matrizes utilizadas neste protocolo foram Celluspots matrizes preparadas por INTAVIS bioanalíticos Instruments. A matriz é bloqueada para evitar ligação inespecífica e depois incubadas com a proteína estudada. A detecção utilizando um anticorpo revela os péptidos de ligação correspondentes aos sítios específicos de interacção entre as proteínas.

STIL é uma proteína centrosomal altamente importante. Ele controla a divisão celular normal e proliferação celular 13,15 - 19. STIL interage com várias proteínas 18,20,21, e a maior parte das interacções ocorrer através da sua parte central, que é uma região intrinsecamente desordenados (IDR) 14. Concebemos uma matriz composta de péptidos derivados da proteína de ligação STIL chfr. Chfr é um supressor de tumor que é induzida em resposta ao estresse 22 mitóti...

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Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

17.8K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem. Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.