Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (número prêmio IOS-1031416) e foi realizado em colaboração com Nathan Miller, Logan Johnson e Edgar Spalding, da Universidade de Wisconsin e Brian Bockelman, Carl Lundstedt e David Swanson do University of Holland Computing Center do Nebraska.

1. Image Acquisition Protocol Considerações: Este protocolo é mais eficiente realizada com duas pessoas, embora seja possível para um trabalho sozinho. O acordo de trabalho melhor neste laboratório foi para uma pessoa para preparar pratos para a digitalização enquanto outros trabalhos sobre a configuração do scanner, em seguida, ambos trabalham juntos para colocar placas em scanners e iniciar o processo de digitalização. Também é importante notar que os scanners neste projeto são orientados verticalmente com as tampas de scanner descansando na parte de trás do scanner. Um suporte personalizado foi feito para segurar pratos nesta posição vertical e foi afixada à superfície de mesa com tiras 3M Command (Figura 2). A tampa removível documento que vem com o scanner utilizada neste protocolo (um Epson V700) foi forrado em um lado com feltro preto. A tampa do documento foi posicionado contra a mesa com uma corda elástica paramanter as placas no lugar, e para fornecer uma imagem de contraste (Figura 3). Qualquer digitalizador de resolução suficiente poderia ser usado para a captura de imagem. O Epson Perfection V700 foi escolhido devido ao seu perfil quadrado (tornando mais fácil para posicionar verticalmente), sua alta resolução, e as opções adicionais para fazer a varredura do tanto a cama e tampa e usar o canal infravermelho. Estas opções adicionais não foram utilizados neste protocolo. Uma vez que as placas foram removidas da câmara de crescimento, é imperativo que o protocolo continuar até ao fim. Preparação Placa Foram utilizados pratos padrão de Petri contendo 10 ml de meio transparente e 9 sementes plantadas em todo o meio de cada placa. Procedimentos de rotulagem placa, preparação de mídia e plantio pode ser encontrado em: <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><li&gt; Recuperar a primeira placa de ágar e absorver a condensação recolhida sobre a tampa e o aro da tampa da placa de agar com um Kimwipe. </li><li> Aplicar o Triton X-100 (detergente) a tampa com um Kimwipe - ser generoso. (Note que o Triton X-100 ajuda a evitar o acúmulo de condensação na tampa como a placa é digitalizada. Uma aplicação de generoso (o suficiente para criar uma película na superfície da tampa) vai ajudar a certificar-se de que a tampa fica transparente ao longo de todo o prazo do scanner .) </li><li> Envolva a placa com micropore para fixar a tampa, e para permitir a ventilação. </li></ol> Configuração do scanner e coleção de imagens Este protocolo assume que mais de 1 scanner está sendo usado, e fornece instruções para começar a vários scanners de um único computador. <ol start="4"><li> Crie pastas para armazenar imagens de cada scanner. Cada scanner irá realizar duas placas, de modo manter isso em mente ao criar pastas. Umpode optar por usar os metadados como componentes do nome do arquivo, tais como IDs únicos para cada placa, com idades de mudas, tamanho da semente, e os IDs de ações plantadas. Um exemplo de um nome de pasta utilizada na coleta de dados contendo estes metadados é &quot;1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161&quot;. </li><li> Definir temporizadores saída para tempo coletando designado (9 hr foi usado neste laboratório). Certifique-se de definir um tempo extra (uma hora) para a preparação. (Note-se que scanners deve ser conectado a timers saída, a fim de definir o tempo de aquisição. Enquanto o software VueScan permite que um usuário para coletar imagens repetidamente, ele não permite que o usuário para indicar quantas imagens para coletar ou quanto tempo para coletar imagens para .) </li><li> Ligue o primeiro scanner e esperar cerca de 10 segundos para o scanner de passar por suas iniciais warm-ups. </li><li> Abra o programa VueScan uma vez. VueScan versão 9.0.20 foi utilizado neste protocolo (ver Tabela Materiais), embora as versões mais recentes podem ser usados ​​com pouca modificção. Verifique se o botão &quot;Mais&quot; foi pressionado no painel inferior da interface do usuário para exibir as opções de menu descritos abaixo. </li><li> Defina a repetição Auto: drop-down caixa para nenhum sob a guia de entrada e na guia Cortar definir a área de visualização: a máxima (Figura 4). Pressione &#39;Preview&#39;. </li><li> Criar uma caixa de culturas que captura a região de interesse, usando o mouse para clicar e arrastar toda a região de interesse na imagem de visualização. As configurações podem ser alteradas para a região de interesse na guia Cortar. Os ajustes típicos usados ​​para a caixa de corte foram: x-offset 0,675; 1.924 em, embora este foi ajustado para capturar área de mudas para cada scanner-offset y. O tamanho da caixa de colheita utilizado foi 7,246 em largura por 1,1 de altura na (Figura 5). </li><li> Para mover a caixa de corte, segure a tecla Shift enquanto arrasta com o mouse. Certifique-se a caixa de corte contém todas as mudas a serem verificados mais qualquer metadados desejado que podem estar contidas em um rótulo (Figura 5). </li><li> Sob a guia Colheita, definir a área de Preview: a caixa de corte e Imprensa &#39;Preview&#39;. </li><li> Vá até a aba Output e selecione o arquivo correto para o scanner (Figura 5). </li><li> Repita os passos 1,7-1,12 em todos os scanners para um computador. Escolha a opção &quot;sim&quot; quando perguntado se deseja abrir mais de uma instância de VueScan. </li><li> Passar por cada guia e verificar as configurações estão corretas. (Note-se que todas as especificações podem ser alteradas para atender às necessidades de um laboratório individual incluindo a cor da imagem, resolução, etc. No entanto, as definições utilizadas neste protocolo pode ser aplicado diretamente sobre a particular digitalização de hardware de um determinado laboratório, devido à interface comum do software VueScan. Consulte a lista de especificações em anexo para ver os parâmetros utilizados neste projeto, utilizando VueScan versão 9.0.20). </li><li> Sob a guia de entrada escolher contínua no repetição Auto: campo, ou escolher um intervalo de tempo maior entre as imagens, se desejar. O intervalo de tempo é o tempo em que o leitor faz uma pausa após guardar a última imagem e começando recolha da próxima imagem. No modo contínuo, 3-4 min resolução podem ser obtidas no 4800 dpi. </li><li> Repita os passos de 1,14-1,15 para o resto dos scanners ligados a um único computador. </li><li> Coloque placas preparados nos scanners corretas com mudas orientadas horizontalmente (não gravistimulate). </li><li> Temporariamente colocar um negro, sentiu fundo contra as placas para que eles não caem do modelo de Plexiglas. Repita o procedimento para todos varreduraparceiros. (Nota: Neste projeto, peças pretas de feltro foram anexados ao documento abrange fornecido com o equipamento para evitar o brilho e contraste para fornecer contra o tecido da raiz A cor de fundo específico usado dependerá da cor do tecido que está sendo trabalhada.). </li><li> Peça a uma pessoa transformar as placas de 90 ° (placas foram virou anti-horário neste protocolo) e imediatamente substituir o fundo de feltro. </li><li> A outra pessoa deve estar de pé em frente ao computador, para que possam imediatamente pressione o botão &#39;Scan&#39;. </li><li> Fixe o fundo para o scanner com uma corda elástica (Figura 3). Peça a uma pessoa segure o fundo no lugar enquanto outros cargos a corda elástica. (Nota: Imediatamente após gravistimulation (rotação das placas em 90 °) e colocação do fundo de feltro, &#39;Scan&#39; deve ser pressionado). </li><li> Repita os passos de 1,17-1,21 para o resto dos scanners num único computer. </li><li> Repita os passos 1,6-1,22 para o próximo conjunto de scanners se aplicável. </li><li> Não deixe os scanners até várias imagens foram coletadas para se certificar de que eles estão economizando corretamente. </li><li> É ideal para manter os scanners em uma área que vai ser livre de perturbações para o tempo de verificação designados. Também é prudente considerar as condições ambientais na área de varredura para assegurar respostas fenotípicas ideais. </li><li> Quando a coleta de dados estiver concluída, pressione o botão abort verde em cada janela VueScan que coincide com cada scanner. </li><li> Feche para fora de todos os programas no computador. </li><li> Reinicie o computador e desligue todos os scanners antes de iniciar uma nova rodada de coleta de imagem. </li></ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARL2,+ARG1+and+PIN3+define+a+gravity+signal+transduction+pathway+in+root+statocytes.">ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes.</a> Plant J. 53, 380-392 (2007).</li><li>Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root Development. , 157-174 .</li><li>French, A., Ubeda-Tom&#225;s, S., Holman, T. J., Bennett, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feature+counting+and+measurement+of+roots.">High-throughput feature counting and measurement of roots.</a> Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Observação fenotípica preciso é fundamental para a compreensão das manifestações da função do gene dentro de um organismo. Uma maneira de adquirir informação fenotípica é através da captura de dados de imagem de alta resolução. A plataforma baseada na do scanner desenvolvido permitiu coleção de muitas imagens (200 imagens / período scan) em alta resolução (4800 dpi) durante um número de horas. Além disso, a plataforma pode ser facilmente adaptado para uma variedade de ambientes de laboratório e em sala de aula, devido à flexibilidade do software VueScan para executar milhares de diferentes leitores que utilizam uma interface comum 18. O método aqui apresentado preenche um vazio em alto rendimento de captura de imagem, que se estende a partir de grandes instalações de fenotipagem de escala e sistemas automatizados implementáveis ​​em um único laboratório. As plataformas de alto rendimento disponíveis atualmente tendem a usar hardware de imagem especializada, incluindo câmeras montadas em suportes robóticos, para capturar imagens de alta resolução de primarily acima tecidos vegetais solo (por exemplo, centro de Planta Integrativa Tecnologia e da Scanalyzer HTS por LemnaTec) 20,21. Sistemas de imagem especializados utilizando raios-X e de ressonância magnética tecnologias também têm sido desenvolvidos para a imagem abaixo tecidos de terra com uma notável resolução à medida que crescem no ambiente do solo (por exemplo, Centro de Plantas Integrativa Tecnologia) 11,22,23. Este desenvolvimento de tecnologia mais especializada é geralmente o custo de produção, fazendo estudos fenotípicos dinâmicas mais difícil. É importante ressaltar que as necessidades de custo e de infra-estrutura para essas plataformas high-end fazê-los principalmente inviável para aplicação em laboratórios menores. Plataformas também têm sido desenvolvidos que usam a tecnologia de captura de imagem mais padrão e são bem adequados para a medição das respostas dinâmicas, como a resposta a um estímulo raiz gravidade. Por exemplo, as câmaras CCD têm sido utilizadas para capturar respostas plântulas individuais à luz e a gravidade em alta1,8,12 resolução espacial e temporal. Outros sistemas foram desenvolvidos permitindo a medição da orientação ponta da raiz de múltiplas raízes de uma única imagem (por exemplo, RootTipMulti pelo iPlant Collaborative) 17,24. No primeiro caso, o rendimento é relativamente baixo uma vez que só uma das plântulas é trabalhada por cada câmara de cada vez, enquanto que no segundo caso o rendimento é mais elevado, mas geralmente à custa da resolução. O procedimento descrito neste artigo apresenta uma plataforma para a captura de imagens de alta resolução em alto rendimento, com equipamentos e softwares que estão prontamente disponíveis e relativamente acessível. Usando esta configuração, 1.080 respostas de raiz individuais podem ser coletadas a cada semana em um único laboratório equipado com um banco de seis scanners. Em 15 meses de coleta uma média de 864 respostas individuais por semana, num total de 41.625 mudas foram digitalizadas para um estudo de genômica. Cerca de 15% das coleções individuais falhou devido a um erro de configuração, network falha ou mau funcionamento do equipamento. Outras respostas de 22% de falha, devido à falta de germinação ou crescimento da raiz insuficiente para provocar uma resposta de crescimento. O conjunto final de dados consiste de 27.475 respostas de mudas individuais a um estímulo gravidade das 163 linhagens recombinantes, mais 99 linhas isogênicas. Os dados foram coletados em um único laboratório, tornando esta uma abordagem muito de alto rendimento. Mesmo tendo em conta que o equipamento utilizado para a aquisição é relativamente barato, ele tem funcionado de forma confiável por mais de dois anos, mesmo com uso pesado. Embora este protocolo tem sido muito útil para os objetivos deste grupo de pesquisa, algumas limitações ainda existem. Devido à taxa de transferência de cerca de 50 GB de dados da imagem não comprimida por dia, era evidente que uma grande quantidade de espaço necessário para as imagens foi de casa, a menos que esquemas de compressão eficaz poderia ser desenvolvido. O problema foi temporariamente resolvido armazenamento através da compra de discos rígidos externos para cada computador. Além disso, dois 1Dispositivos de armazenamento de rede associadas 0 TB foram comprados. Mais tarde, os algoritmos de compressão foram desenvolvidos, como descrito acima, que pode ajudar a reduzir o tamanho dos dados em até 60% (figura 8). É importante notar que a velocidade à qual os dados podem ser guardados num dispositivo de armazenamento associado com a rede depende da velocidade da conexão de rede. Sistemas de compressão, também têm sido limitada devido ao desejo de evitar a perda de dados de imagem. Outras limitações específicas a um sistema de imagens baseado em scanner também estão sendo considerados. Por exemplo, em uma abordagem baseada no scanner de plântulas são expostos a luz de alta intensidade nas faixas brancas e potencialmente infravermelhos durante cada varrimento. Isso provavelmente afectando o crescimento de plântulas, embora mudas ainda pode ser observada a sofrer fortes respostas a um estímulo da gravidade (Figura 7). A melhoria futura poderia envolver programação scanners tais que apenas LEDs infravermelhos estão ativos. Uma área em developmen ativot é a criação de algoritmos de análise bem adaptado para a resolução e taxa de transferência de estes dados de imagem. O grande conjunto de dados gerados usando esse método baseado em scanner foi ideal para o desenvolvimento de ferramentas robustas para high-throughput fenotipagem de imagens de plântulas. O algoritmo de compressão empregada nestas imagens mostradas na Figura 7 é compatível com a afirmação de que eles são passíveis de aplicações de análise de imagem. Além disso, as imagens geradas podem ser analisados ​​pelo algoritmo publicado anteriormente, RootTrace 17,24, se forem coletadas em resolução mais baixa (menos de 1.200 dpi), e mudas individuais são segmentados a partir da imagem usando o algoritmo de compressão descrito acima antes da análise. Dados de crescimento da raiz pode ser extraído a partir de imagens reduzidas a 1.200 dpi, enquanto os dados de ângulo de ponta poderia ser extraído de imagens reduzidas para 900 dpi (observação não publicada). O procedimento descrito neste artigo se encaixa em seu próprio nicho no mundo do root imagem em que é alto rendimento e alta resolução, enquanto continuam sendo relativamente acessível. Uma vantagem adicional desta abordagem é que ele pode ser facilmente personalizado para acomodar as necessidades de imagem de um grupo de investigação particular.

Recolha de dados fenotípicos de alta resolução é útil em estudos que visam compreender a interacção da genética e do ambiente na mediação função do organismo 1,2. Estudos dessa natureza também são inerentemente grande escala, tornando-se necessário que, adicionalmente, métodos empregados para medir fenótipos neste contexto ser alta na taxa de transferência de 3,4. Ao estabelecer métodos para a investigação phenomics escala, trocas entre o throughput e resolução de entrar em jogo. Métodos que são superiores na taxa de transferência também tendem a ser mais baixos em resolução, tornando-o mais difícil de detectar pequenos efeitos da genética ou o ambiente 5. Alternativamente, os métodos que medem com mais cuidado um fenótipo desejado também tendem a ser mais baixos no rendimento, o que torna difícil fazer um levantamento efeitos genéticos e ambientais de forma ampla. Além disso, os métodos manuais para fenótipos quantificar, incluindo inspeção visual, pode estar sujeita a variações devido a diferenças nas per humanopercepção 6. Tecnologias de imagem pode fornecer uma ponte útil entre rendimento e resolução na obtenção de observações fenotípicas 7-9. Em geral, uma imagem é relativamente fácil para capturar, facilitando a produção, e quando feita com resolução suficiente, subtis fenótipos podem ser detectados 1,2,7. Tecnologias de imagem tendem a ser modificável para caber um sistema ou processo de interesse e são geralmente escalável 10-12. Devido a isso, as tecnologias de imagem são ideais para o desenvolvimento de trabalhos em larga escala de função do organismo. A resposta da raiz principal de um estímulo gravidade é um processo fisiológico complexo que ocorre dentro de um órgão morfologicamente simples. A resposta envolve a ativação de vias de sinalização que se propagam através do órgão de raiz e sua progressão é determinada por fatores genéticos e ambientais, incluindo fatores genéticos influenciados pelo ambiente 12-14 </sup&gt;. A resposta da raiz primária a um estímulo gravidade tem sido estudada pelo menos desde Darwin, ainda há muito a aprender sobre como ele funciona, particularmente nos primeiros eventos de sinalização e nos fatores mediadores resposta plasticidade 12,14,15. Ganhar uma compreensão detalhada da dinâmica de esta resposta é importante para encontrar maneiras de melhorar a capacidade de mudas para tornar-se estabelecida com sucesso dentro de um determinado ambiente 16. Além disso, a forma da raiz torna favorável para aplicações de processamento de imagem 8,12,17. Tomados em conjunto, a resposta gravitrópico raiz é um sistema ideal para o desenvolvimento de tecnologia de imagem de alto rendimento com a finalidade de realização de estudos de genômica de nível de função do organismo. Neste relatório, uma alta taxa de transferência, método de alta resolução para captura de imagem da resposta gravitrópico root usando baratos, scanners de mesa comercialmente disponíveis é apresentada. A visão geral doprotocolo é demonstrado na Figura 1. Mudas plantadas em placas de ágar foram posicionados em scanners de mesa orientados verticalmente equipados com suportes de acrílico personalizados placa. As imagens foram coletadas a cada poucos minutos a 4.800 dpi e salvas em uma unidade local ou servidor de dados. Metadados associados a cada série de imagens são armazenadas em um banco de dados e as imagens armazenadas são processados. A abordagem utiliza o software VueScan para captura de imagem. VueScan pode ser usado para executar mais de 2.100 scanners diferentes em Windows, Mac, ou sistemas operacionais Linux (ver Tabela Materiais). A resolução do scanner de 4800 dpi foi utilizada nesta aplicação para corresponder à resolução alcançada em estudos anteriores usando câmeras CCD fixos 1,8,12. A flexibilidade do software VueScan juntamente com a interface comum que utiliza para qualquer scanner é executado permite que os usuários adotem prontamente praticamente qualquer hardware digitalizador de resolução suficiente para o protocolo apresentado neste artigo. Rendimento atual permite a recolha de216 respostas individuais por dia. A tecnologia é adaptável e escalável para uso em instituições que vão desde escolas a universidades de pesquisa. Além disso, as imagens recolhidas são de qualidade suficiente para aplicações de análise de imagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

Os esforços de pesquisa em biologia exigem cada vez mais o uso de metodologias que permitem a coleta de grandes volumes de dados de alta resolução. Um desafio laboratórios podem enfrentar é o desenvolvimento ea consecução desses métodos. Observação de fenótipos em um processo de interesse é um objectivo típico de laboratórios de pesquisa que estudam a função do gene e isso muitas vezes é conseguido através de captura de imagem. Um processo especial, que é passível de observação usando abordagens de imagem é o crescimento corretiva de uma raiz de mudas que foi deslocado de alinhamento com o vetor de gravidade. Plataformas de imagem usado para medir a resposta gravitrópico raiz pode ser caro, relativamente baixa na taxa de transferência, e / ou de trabalho intensivo. Estas questões foram abordadas através do desenvolvimento de um método de captura de imagem de alto rendimento com baixo custo, mas de alta resolução, scanners de mesa. Usando este método, as imagens podem ser capturadas a cada poucos minutos a 4.800 dpi. A configuração atual permite a coleta de 216 indivíduo responses por dia. Os dados de imagem coletados são de ampla qualidade para aplicações de análise de imagem.

Imagens representativas Esta abordagem permite a produção rápida de alta resolução de séries temporais de Arabidopsis crescimento das plântulas. Primeiras imagens e último de uma corrida de scanner são mostrados nas Figuras 7A e 7B. Figuras 7C e 7D mostrar os melhores resultados a partir de metade de uma imagem de um scanner completo. Alguns problemas que podem afectar a qualidade da imagem são mostrados nas Figuras 7A e 7B. Essas questões incluem variação na germinação, variação na trajetória de crescimento das mudas no início da corrida, e acúmulo de condensação durante a digitalização. A condensação pode em grande parte ser resolvido pelo aumento da quantidade de Triton X-100 aplicada ao interior da tampa do prato. Outros fatores que podem inibir a coleção de imagens precisas são configuração incorreta da caixa de corte com relação às placas de posição da placa e posicionamento de tal forma que eles estão distorcidos em relação a caixa de corte. Aplicação Análise de Imagem: Compressão de Imagem Uma vez que uma seqüência temporal de imagens de scanner foi obtido, ele deve ser armazenado com segurança em uma forma acessível de rede para facilitar a análise de imagem. Os arquivos de imagem associados a um prazo de scanner indivíduo ocupar uma quantidade significativa de espaço no disco rígido. Um único arquivo TIFF coletadas em 4.800 dpi é de cerca de 220 MB e uma corrida típica do scanner gera 200 arquivos de imagem. Portanto, cerca de 44 GB de espaço em disco rígido é necessária por corrida. Para reduzir os custos de armazenamento e de transmissão de rede associados com a análise da imagem, é desejável reduzir a quantidade de espaço necessário para armazenar dados de imagem e, ao mesmo tempo, minimizando a perda de dados. Análise Downstream envolverá a identificação de cada muda em arquivos de imagem subseqüentes associadas com uma corrida experimental. Portanto, segmentando a única plântula a partir da imagem do scanner pode facilitar a análise a jusante. Porque a segmentação da plântula longe do resto dos poimagem e também pode reduzir significativamente o armazenamento de desnecessários pixels de fundo, esta abordagem também leva a uma redução significativa no tamanho dos dados. Além disso, se a análise a jusante é focado sobre o tecido da raiz, pode não ser necessário para reter a informação de cor desde que os pixels da raiz são relativamente estreitos no seu espaço de cor. Um protocolo de processamento de imagem de computador e código para reduzir o tamanho de dados, tanto segmentar fora mudas individuais e converter imagens para escala de cinza tem sido desenvolvido. A abordagem resulta em uma redução de 60% nos requisitos de espaço de armazenamento. O fluxo de trabalho usado para atingir esta compressão de dados é descrita nos seguintes passos: <ol><li> Comece com uma série de tempo de arquivos de imagem do scanner em uma única pasta. </li><li> Para cada imagem, converte a partir de uma escala de cinzentos para RGB (Figura 8, em cima). </li><li> Dividir a imagem em lados esquerdo e direito. </li><li> Extraia cada muda a partir da imagem em seu próprio arquivo (Figura 8).Isto é feito através da aplicação de um limiar para converter pixels de preto ou de branco e, em seguida, calcular a intensidade total de pixels de cada linha da imagem. A linha com a maior intensidade é identificado e cada pixel é classificado como &#39;planta&#39; ou &#39;nonplant&#39; com base na intensidade de seus vizinhos. O centro de cada &#39;planta&#39; dentro desta linha é encontrado ea partir desse ponto uma caixa de colheita de um tamanho pré-determinado é desenhada (Figura 8, abaixo). </li><li> Crie uma pasta separada para cada um dos lados da imagem (esquerda e direita) com subpastas separadas para cada muda para o armazenamento de arquivos de imagem séries de tempo individual. </li><li> Arquivar as pastas resultantes em um arquivo compactado. </li></ol> Um código que realiza essas etapas foi desenvolvido utilizando a linguagem de programação Python 20. O algoritmo permite uma redução de aproximadamente 60% no tamanho dos dados e é bem sucedido na identificação de todas as plântulas individuais em 90% do imag digitalizadorarquivos e analisados ​​até agora. Os códigos estão disponíveis gratuitamente para download sob a licença GNU General Public License versão 3 (ver Tabela Materiais). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. O procedimento de digitalização começa com o plantio de sementes (até nove sementes de Arabidopsis por placa) e termina com o armazenamento de dados e processamento de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> Emplate Figura 2. T para construção de suporte placa de Petri. Ple<html> xiglas foi cortada de tal forma que a largura de encaixar a base de cópia (neste caso 227 milímetros) e o comprimento foi de 128 mm. Dois círculos com um diâmetro de 88 milímetros foram cortadas a parte restante de modo a que eles foram distribuídos uniformemente ao longo da largura e comprimento do suporte. O apoio foi afixada à mesa com tiras 3M comando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> Configuração Scanner Figura 3. Após mudas foram gravistimulated ea tampa documento posicionado. Esta é a configuração do scanner na etapa 1.21 de configuração do scanner e coleção de imagens.&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Captura de tela de configurações selecionadas para a etapa 1.8 do programa de instalação de scanner e coleção de imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Captura de tela do software VueScan durante os passos 1.9 e 1.10 do programa de instalação de scanner e coleção de imagens. A caixa vermelha destaca o tamanho do corte, enquanto a caixa azul destaca configurações específicas fo<html> r-x e utilizado a fim de capturar mudas e informações rótulo distância y. A região da mesa a ser digitalizada é mostrada como uma linha pontilhada na área de pré-visualização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> Figura 6. Seleção de pasta de destino para a etapa 1,12 de configuração do scanner e coleção de imagens. Ao pressionar o botão @ ao lado da caixa de diálogo Default Folder (seta vermelha) permite que o usuário selecione a pasta de destino apropriado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . re 7 &quot;fo: content-width =&quot; 5 polegadas &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Figura 7 (AD). As imagens acima são exemplos de que o coletado usando o método descrito neste trabalho. Painéis A, B e C, D são as primeiras imagens e finais, respectivamente, a partir de um único período de verificação. A, B mostram a completa área digitalizada, enquanto C, D são uma região recortada da área digitalizada, mostrando uma única chapa. Várias inconsistências podem ser observados. O painel A mostra variação na germinação e na trajetória de crescimento. Painel B (as mesmas mudas como uma imagem; 9 horas posteriores) mostra que as placas podem se acumular condensação. Os painéis C e D são consideradas como bons resultados devido a um crescimento robusto of mudas e qualidade de imagem em toda a corrida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> Figura 8. O algoritmo de compressão de imagem desenvolvida converte uma imagem do scanner à escala cinzenta (em cima). A imagem é dividida em metades direita e esquerda e das fronteiras da imagem são removidos (não mostrado). Os cargos de mudas individuais em cada metade são identificados por encontrar a linha com a maior intensidade total de pixels. Essas posições são usadas para definir uma nova área da cultura, aplicada a todas as mudas na placa (em baixo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Este protocolo descreve um processo para cobrança rápida de imagens de plântulas de Arabidopsis que respondem a um estímulo gravidade usando scanners de mesa disponíveis comercialmente. O método permite a baixo custo, a captura de grandes volumes de imagens de alta resolução passíveis de algoritmos de análise a jusante.

Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.3K visualizações.  Doane College.  Este protocolo descreve um processo para cobrança rápida de imagens de plântulas de Arabidopsis que respondem a um estímulo gravidade usando scanners de mesa disponíveis comercialmente. O método permite a baixo custo, a captura de grandes volumes de imagens de alta resolução passíveis de algoritmos de análise a jusante. 

Vídeo: Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Biologia

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Sistema induzível de raiz lateral em Arabidopsis e milho

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.