MS e YZ são suportados pelo KCL e KCL-China bolseiros de doutoramento. MO foi financiado por uma Biotecnologia e PhD Ciências Biológicas Research Council studentship. Agradecemos Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki para o plasmídeo PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti para conselhos valiosos sobre eletroporação.

Este procedimento está de acordo com os Regulamentos do Reino Unido O Home Office (Lei procedimentos científicos animal, 1986). Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelos organismos reguladores animais institucionais e nacionais. 1. Pós-Natal Eletroporação 1.1. Preparação de capilares de vidro, solução de ADN e Electroporator <ol><li> Prepare capilares de vidro puxado (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) para injeção de DNA. (Configurações indicativos para um extrator capilar Sutter P-97 são: Heat 283; Puxe 50; Velocity 90; Tempo 50). Fazer uma marca no capilar que corresponde a um volume de cerca de 2 ul. </li><li> Ajuste a tensão da electroporador para 5 pulsos quadrados, 50 ms / pulso a 100 V, com 850 intervalos ms (100 V, pulso em 50 ms, pulso OFF 850 ​​ms, pulso 5). </li><li> Dilui-se de elevada pureza (OD 260/280&gt; 1.80) isenta de endotoxina plasmídeo de DNA para uma concentração final de 1-2 mg / mLcom endotoxina libertar tampão de Tris-EDTA, ou PBS. Recomenda-se adicionar 0,1% de Fast Green para a solução de ADN (o corante deve espalhar no ventrículo quando injectados com sucesso). </li><li> Prepare os eletrodos 5-7 mm, o gel do eletrodo e aquecer a almofada de aquecimento. </li></ol> 1.2. Eletroporação <ol><li> Retirar um dia pós-natal do rato 2 filhote de gaiola e anestesiar lo por inalação de isoflurano (a um caudal de ~ 0,6 L / min). </li><li> Após aproximadamente 1 min, determinar o estado de anestesia por meio da resposta pé pitada. Se ocorrer nenhum movimento, continue com injeção intraventricular. </li><li> Carregar agulha capilar com 1-2 ul de ADN, utilizando um tubo de aspirador ligado ao capilar. </li><li> Com uma fonte de luz fria, segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante. Ligeiramente puxar a pele para trás na cabeça para ajudar a identificação do ponto de injeção direita. </li><li> Considere uma linha virtual entre o olho ea tele craniométricas marco lambda (Figura 1A). Inserir a agulha capilar em cerca de um terço do comprimento da linha de lambda (cerca de 1 mm a partir do ponto médio linha 15). Insira o capilar de cerca de 2 mm de profundidade, tornando-se de evitar a penetração profunda no cérebro. </li><li> Injectar plasmídeo fundindo lentamente através da boca (uma seringa ligada ao capilar também pode ser utilizado). Durante este procedimento, certifique-se de que seus dedos não estão aplicando demasiada pressão sobre o cérebro, pois isso pode evitar injeção de sucesso plasmídeo. </li><li> Pare injecção, quando uma quantidade mínima de solução de ADN é deixado no capilar. É aconselhável administrar com menos do que 1 ml para evitar o aumento pernicioso da pressão intracraniana. </li><li> O revestimento de gel com os dois eléctrodos e colocá-las com o lado positivo sobre o lado lateral do hemisfério, onde o ADN foi injectada (Figura 1A). Por incorporação de DNA no ZSV rostral, colocar eletrodos levemente rostral aoponto de injeção. Variando posição do eletrodo pode alcançar especificidade regional de eletroporação em diferentes áreas do ZSV 22,25. </li><li> Iniciar transferência atual, pressione o pedal de pulso pedal. Quando a eletroporação é completa, verifique a tensão no visor electroporador (valores de tensão não deve ser inferior a 90 V, uma vez que os valores mais baixos de tensão se correlacionam com baixa eficiência eletroporação). </li><li> Reanimar o filhote sob oxigênio na almofada de aquecimento por alguns minutos e devolvê-lo à gaiola, colocando-o para longe da mãe. Certifique-se de que a mãe recupera o cachorro e se reúne com o resto da ninhada. Depois de eletroporação, deixe os filhotes com a mãe para 4-7 dias antes da próxima etapa. </li></ol> 2. Preparação das Culturas aguda do cérebro Fatia 2.1. Preparação de soluções e ferramentas <ol><li> As soluções que se seguem são necessárias (isto é também possível a utilização de DMEM-elevado teor de glicose para dissecar e imagiologia17): Dissection Médio (500 ml) Mídia equilibrada de Gey - 500ml 45% de Glicose - 5ml Médio Filme (10 ml) 45% de Glicose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0,100 ml Pen / Strep - 0,100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0,100 ml Glutamina - 0.200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (vermelho de fenol-livre) - 8,89 ml </li><li> Meio de aquecimento filme a 37 ° C. </li><li> Coloque Millicell insere em um prato de cultura de fundo 35 milímetros de vidro contendo 1 ml de meio de filme e colocar num incubador humidificado a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Prepare vibratome acessórios (chave de fenda, câmara, lâminas de barbear, cola). </li><li> Prepare ferramentas de dissecação: tesouras, pequena espátula, pinça retas. </li><li> Preparar as ferramentas para lidar com fatias: pincel pequeno ou loop inoculação suave (tamanho: 10 mL), pipetas Pasteur de plástico, uma caixa de gelo e vários pratos de plástico 6 cm. </li><li> Pré-resfriar o meio de dissecçãoa 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Preparação de fatias do cérebro <ol><li> Encha um prato com seis centímetros médio dissecção resfriadas e colocá-lo em gelo (para manter fatias recém-cortadas). </li><li> Após deslocamento cervical, use uma tesoura para decapitar o filhote do rato. Remover o couro cabeludo com um bisturi, cortar o crânio, ao longo da sutura sagital médio do OB para o cerebelo e remover suavemente as abas cranianos utilizando fórceps. Certifique-se de todo o cérebro é exposto e dissecar cuidadosamente-lo usando uma espátula, tendo especial cuidado para não danificar o tecido. A dissecção tem de ser feito com cuidado, mas ao mesmo tempo muito rapidamente (menos do que um minuto, se possível). Deslocação cervical é o nosso método preferido porque anestesia terminais com anestésicos drogas / gás pode influenciar as propriedades migratórias dos neuroblastos eo estado de saúde das culturas fatia do cérebro, que precisam ser trabalhada de forma relativamente rápida após o sacrifício de animais. </li><li> Hemisect o cérebro com uma razou lâmina (Figura 2). Descarte hemisfério não injectado ou utilizar para outros experimentos. </li><li> Coloque um pequeno pedaço de fita adesiva no porta-vibratome e usar a quantidade mínima necessária de cola para fixar o hemisfério cerebral em cima dela (Figura 2). Isso evita danos da superfície do suporte devido a repetidas aplicações de cola. </li><li> Deixe a cola secar por alguns segundos. </li><li> Coloque o suporte na bandeja do vibratome preenchido com solução dissecção pré-resfriado. O ponto do bolbo olfactivo em direcção da lâmina (Figura 2). </li><li> Comece cortando o hemisfério cerebral usando as configurações apropriadas. Os parâmetros a seguir são recomendadas: espessura do corte 300 mm, a velocidade ~ 3-5; freqüência ~ 9. De alta freqüência e baixa velocidade são recomendados para evitar danos à fatia. </li><li> Colete fatias usando um pincel pequeno ou um loop inoculação macio. Apenas manter fatias com OB visível (geralmente 2-3 fatias / cérebro). Tipicamente, a fatia contendo a maior parte dos ca RMSn ser encontrada em ~ 300 mm a partir da superfície de fundo. </li><li> Verifique fatias sob um microscópio fluorescente padrão para o sinal GFP (certificando-se para lançá-los ao longo de verificar fluorescência em ambos os lados), e escolha os que apresentaram fluorescência ao longo da maioria dos RMS. </li></ol> 2.3. Cultivar fatias do cérebro do <ol><li> Em uma capa de cultura celular, cortar o terceiro mais caudal da fatia do cérebro e eliminar quaisquer vestígios de cola usando uma pinça reta finas ou um bisturi microdissection. </li><li> Delicadamente aspirar a fatia usando uma pipeta Pasteur de plástico (corte a ponta da pipeta para criar uma abertura maior, isso vai evitar danos a fatia) e colocá-lo no centro de um pré-aquecido Millicell inserção. </li><li> Certifique-se de lado, com o sinal fluorescente brilhante é colocado em contacto com o Millicell inserir (para imagens com um microscópio invertido). </li><li> Remover o excesso de solução de dissecção no topo do inserto com uma pipeta. </li><li> Deixe culturas fatia paraestabelecer-se a 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 1 hr antes de imagem. </li></ol> 3. Time-lapse de imagens de Migração neuroblasto <ol><li> Pelo menos 2 horas antes de imagem, ligue o sistema de Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal fiação, invertido Nikon Ti-E microscópio, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), arrefecido câmera CCD digital, e sistema de aquecimento (Solent Scientific), fixado em constante temperatura de 37 ° C. </li><li> Abra o módulo de aquisição de software Volocity e clique no botão &quot;Viz&quot; e selecione o laser (s) para a imagem latente. </li><li> Dentro de 2 horas de cérebro preparação fatia, coloque o prato fundo de vidro que contém a fatia do cérebro na câmara de imagem no palco microscópio. </li><li> Utilize uma objectiva Nikon CFI Super Plano Fluor ELWD 20X/0.45 sob a luz fluorescente apropriado para selecionar e focar a área da fatia que vai ser trabalhada (por exemplo, a primeira parte descendente dos RMS logo após o local da injeção, ou o Elbow região das RMS, ou logo após o cotovelo antes neuroblastos entrar no OB). </li><li> Configure a imagem time-lapse com as seguintes ações: <ol><li> No microscópio, clique no botão L100 para permitir a digitalização a laser da amostra. </li><li> Em Volocity, abra o UltraView Laser Changer, selecionando o laser adequado (por exemplo, 488 nm laser para GFP). </li><li> Ajustar o tempo de exposição (normalmente entre 100-500 ms) e a intensidade do laser (geralmente 20-30%) em função da intensidade do sinal fluorescente. </li><li> Ajuste o ganho digital de imagem para melhorar a visualização celular. </li><li> Selecione o intervalo de z-stack de imagem dentro da fatia do cérebro (geralmente ao longo de um intervalo de 100-120 mm). Escolha de um intervalo com um número adequado de células isoladas a fim de evitar possível sobrepor tanto quanto possível (isto irá facilitar a análise subsequente de rastreamento). </li><li> Seleccione o espaçamento entre cada imagem z pilha (geralmente 2-4 mm) entre. </li><li> Escolha o tempo intErval entre cada captura z pilha (por exemplo, 3 min) e a duração de imagem total (por exemplo três horas). </li><li> Clique no ícone &quot;salvar&quot; para salvar as alterações nos parâmetros de imagem. </li><li> Pressione o botão de gravação para iniciar a imagem. </li></ol></li><li> Imagiologia alternativo de amostras de controlo e experimentais (por exemplo, tratamento do veículo / fármaco ou diferentes plasmídeos electroporadas) ao longo do mesmo dia. </li></ol> 4. Analisando neuroblasto Migração <ol><li> No módulo Volocity quantificação, abra a biblioteca desejada criado depois de completar um experimento de time-lapse. Selecione &quot;Focus prolongado&quot; da caixa superior esquerdo (Figura 4A, passo 1). </li><li> Clique na aba &quot;Medidas&quot; para exibir a janela de medição (Figura 4A, passo 2). </li><li> Uma lista de tarefas é visível no canto inferior esquerdo da tela. Arraste &quot;Track&quot; (presente no âmbito do &quot;Diversos&quot; título na parte inferior daa lista) no espaço acima. Isto irá pedir a abertura de uma nova janela chamada &quot;Track&quot; no topo seção esquerda da tela (Figura 4A, etapa 3). </li><li> Selecione &quot;Pontos&quot; na guia &quot;Input&quot; na janela Track (Figura 4A, passo 4). </li><li> Clique na ferramenta Ponto (Figura 4A, passo 5). </li><li> Começar a controlar a migração de neuroblastos, clicando com o mouse sobre a área central do corpo celular e manter o acompanhamento do movimento das células até o último instante do lapso de tempo é atingido (por exemplo ponto número 61 para um filme de longa hr-3) . </li><li> Para obter os dados, escolha &quot;Fazer item Medição&quot; no menu Medidas (Figura 4B, os passos 6-7). Uma janela irá aparecer no centro da tela. </li><li> Nesta janela, selecione &quot;Um novo item de medição chamado:&quot; e digite um nome (Figura 4C, passo 8). Lembre-se de selecionar a opção &quot;Todos os pontos temporais&quot; antes de pressing OK (Figura 4C, passo 9). Um arquivo de item de medição aparecerá sob o arquivo time-lapse e conterá os parâmetros de análise quantitativa (por exemplo, a distância de migração, velocidade, deslocamento, e de taxa de deslocamento). </li><li> Dê um duplo clique no arquivo do item de medição para abri-la como uma janela (Figura 4D, passo 10). </li><li> Para visualizar as faixas individuais de células analisadas, escolha &quot;Ponto de rastos&quot; entre as opções &quot;Display&quot; (Figura 4D, etapa 11). </li><li> Botão direito do mouse sobre o arquivo do item Medição e exportá-lo como um arquivo de texto, que pode então ser importado em programas como o Excel para analisar parâmetros de migração. </li><li> Para medir movimentos entre quadros consecutivos e pausas feitas por cada célula durante o período de filmagens, no arquivo do item de medição selecionar a opção &quot;Exibir&quot; opções &quot;Ponto&quot; ou &quot;populações&quot; e clique no ID (cada faixa tem uma identificação única). Exportar o arquivo resultante de procederção, tal como explicado no passo 4.10. </li></ol>

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	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain.">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li><li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions.">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain.">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb.">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury.">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li><li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury.">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li><li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury.">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883 (2008).</li><li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation.">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li><li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis,+spine+density,+synaptic+integration,+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons.">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174 (2012).</li><li>dal Maschio, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960 (2012).</li><li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).</li><li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+cell+migration:+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy.">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30 (2011).</li><li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls:+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis.">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13 (2011).</li><li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington's+disease.">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Migração eficiente de progenitores neurais ao longo das RMS garante sua maturação posterior em neurônios funcionais 10. Fluxos importantes de progenitores neurais voltadas para o OB são visíveis na infância humana e são susceptíveis de desempenhar um papel importante no início de pós-natal o desenvolvimento do cérebro humano 27. Além disso, essas células são capazes de atingir locais do cérebro afetadas por lesões e neurodegeneração 4,28. Ser capaz de monitorar em tem...

No cérebro de mamíferos, a geração de novos neurónios (neurogénese) ocorre após o nascimento, principalmente em duas regiões, da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular no giro dentado do hipocampo 1. Evidências consideráveis ​​se reuniram nos últimos anos suporta um papel crítico para a neurogênese pós-natal em funções de memória do hipocampo e bulbo olfatório 1-3. É importante ressaltar que a neurogênese pós-natal também tem potencial terapêutico por causa de sua relação com doenças neurológicas degenerativas, bem como a capacidade de neuroblastos para migrar para locais feridos no cérebro 4-6. A zona subventricular (SVZ) surgiu recentemente como um nicho neurogênico crucial. Neuroblastos ZSV derivados migram para o bulbo olfatório (OB) através do fluxo migratório rostral (RMS), tornando este o processo de migração mais longa do 1,7,8 cérebro pós-natal. A / RMS / sistema OB mamíferos ZSV tornou-se ummodelo útil para estudar os diferentes passos de neurogênese, como proliferação, migração e diferenciação 1,8. Muitos fatores de crescimento e sinais extracelulares regulam a neurogênese ZSV e migração ao longo das RMS, mas os mecanismos moleculares intracelulares estão longe de ser totalmente compreendida 1,9. Migração adequada ao longo das RMS é crucial para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos 10. Além disso, alguns estudos têm mostrado que neuroblastos ZSV derivados podem migrar para fora da RMS para locais de lesão cerebral 4-6,11-13. Assim, investigar a migração neuroblastos mecanismos de sinalização de regulação é fundamental não só para entender a neurogênese, mas também para potenciais aplicações terapêuticas. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para rotular progenitores neurais SVZ por eletroporação in vivo pós-natal e acompanhar sua migração ao longo das RMS em culturas agudos fatia cérebro usando time-lapse confocal disco giratório microscopiapy. A electroporação é amplamente utilizado em estudos de desenvolvimento embrionário a partir de fases adultas 14-18. É uma ferramenta poderosa para direcionar e manipular progenitores neurais SVZ e representa uma alternativa mais barata e consideravelmente mais rápido a injeção estereotáxica de vetores virais ou geração de modelos transgênicos 1,15,19,20. É um procedimento relativamente simples que não precisa de cirurgia e tem altas taxas de sobrevivência. Eletroporação de shRNA ou CRE plasmídeos expressando recombinase em modelos genéticos de mouse que utilizam o sistema LoxP pode ser usado para alvejar genes de interesse ou para alcançar marcação permanente de progenitores SVZ, representando, portanto, uma ferramenta útil para os estudos de neurogênese adulta 21,22. Imagem RMS neuroblasto migração no cérebro intacto ainda é um desafio devido a limitações técnicas atuais. No entanto, este processo pode ser monitorado usando disco confocal fiação microscopia de lapso de tempo de fatias cerebrais agudas, que proporcionam um sist adequadolos muito parecidas com a condição in vivo também passível de manipulação farmacológica 23,24. Acoplamento em electroporação pós-natal in vivo com imagiologia de lapso de tempo irá facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblastos e contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

A zona subventricular (SVZ) é um dos principais nichos neurogénicos no cérebro pós-natal. Aqui, células progenitoras neurais proliferam e dão origem a neuroblastos, capazes de se mover ao longo do fluxo migratório rostral (RMS) em direcção ao bolbo olfactivo (OB). Esta migração de longa distância é necessário para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos no OB, mas os mecanismos moleculares que regulam este processo ainda não são claras. Investigando as vias de sinalização que controlam a motilidade neuroblasto não só pode ajudar a entender um passo fundamental para a neurogênese, mas também têm potencial regenerativo terapêutico, dada a capacidade desses neuroblastos atacar sites do cérebro afetadas por uma lesão, acidente vascular cerebral, ou degeneração. Neste artigo descrevemos um protocolo detalhado para eletroporação in vivo pós-natal e posterior de imagens de lapso de tempo de migração neuroblastos na RMS do mouse. Eletroporação pós-parto pode eficientemente transfecção ZSV progenitorcélulas, que por sua vez geram neuroblastos que migram ao longo da RMS. Usando microscopia confocal girando time-lapse disco em culturas fatia agudas do cérebro, a migração neuroblastos pode ser monitorado em um ambiente que se assemelha de perto a condição in vivo. Além disso, a motilidade neuroblasto podem ser rastreados e analisados ​​quantitativamente. Como exemplo, descrevemos como usar in vivo pós-natal eletroporação de um plasmídeo expressando GFP para rotular e visualizar neuroblastos que migram ao longo das RMS. Electroporação de shRNA ou plasmídeos que expressam CRE recombinase em ratinhos knockout condicionais que empregam o sistema LoxP também pode ser utilizado para alvejar genes de interesse. Manipulação farmacológica de culturas de fatias cerebrais agudas pode ser realizada para investigar o papel de diferentes moléculas de sinalização em migração neuroblastos. Ao unir em eletroporação vivo com imagens de lapso de tempo, esperamos compreender os mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblasto e contribuir para o desenvolvimentomento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.

Etiquetagem de neuroblastos migratórias SVZ derivados podem ser observadas ao longo da RMS, normalmente 4-8 dias depois de um bem sucedido electroporação (Figura 1B). Os pontos de tempo mais longos, também pode ser escolhido, mas menos células serão encontrados na RMS vez que a maioria terá entrado no OB. Os neuroblastos iniciar a aquisição de morfologia típica e características de células granulares maduros no OB de cerca de 2-3 semanas após a electroporação (não mostrado). Depois de cu...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K visualizações.  King's College London.  Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo. 

Vídeo: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Neurociência

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...