Este método permite a captura imparcial da expressão genética de microglia em um nível unicelular, o que pode ajudar a elucidar a heterogeneidade molecular da microglia em um cérebro saudável e doente. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um procedimento detalhado para o rápido isolamento da microglia de diferentes regiões cerebrais e mostra como gerar eficientemente a base de reprodução das bibliotecas RA6 unicelulares para sequenciamento profundo. Para iniciar este procedimento, prepare todos os buffers e soluções necessários, conforme descrito no protocolo de texto e esfrie-os no gelo.
Depois de eutanásia e decapitação do rato, use uma pequena tesoura para cortar a pele na cabeça para expor o crânio por baixo. Em seguida, corte através da sutura sagital, sutura lambdoidal, e sutura coronal. Use fórceps para extrair ambos os lados do osso parietal e do osso interparietal sem danificar o tecido e mover cuidadosamente o cérebro para uma placa de Petri de dissecção contendo a lâmina média A.Usando uma lâmina pré-refrigerada, corte o cérebro através da linha média em dois hemisférios.
Use fórceps número 55 para separar o cerebelo do lobo cortical e do tronco cerebral. Em seguida, use o número 55 fórceps para dissecar cuidadosamente o hipocampo e o estriado do córtex e transferir cada tecido para uma placa de petri de coleta separada. Primeiro, use uma lâmina de barbear para cortar cada região cerebral em pedaços finos que são menos de um milímetro cúbico.
Usando uma pipeta de um mililitro com a ponta cortada, transfira os pedaços de tecido em homogeneizadores do Dounce pré-refrigerados. Homogeneize o tecido torcendo lentamente o pistão para dentro e para fora do homogeneizador Dounce por seis a 10 golpes completos até que não haja pedaços visíveis. Em seguida, transfira os tecidos dissociados em tubos de 50 mililitros através de cepas de 70 micrômetros.
Enxágüe cada homogeneizador e pistão dounce com o total de seis mililitros de meio frio A, em seguida, transfira a lavagem para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Centrífuga suspensão de célula única a 400 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos com uma pausa em cinco. Enxágüe uma grande coluna de esgotamento e três grandes colunas de seleção em um separador magnético com três mililitros de MCS.
Quando a centrifugação para as amostras de tecido estiver completa, pipeta para fora e descartar supernasce sem perturbar a pelota. Resuspendice as células no buffer MCS que contém inibidor RNase. Adicione 100 microliters de contas de remoção de mielina a cada tubo contendo células re-suspensas do córtex e cerebelo e adicione 50 microliters de contas de remoção de mielina a cada um dos tubos contendo células re-suspensas do hipocampo e do estriato.
Incubar os tubos no gelo por 10 minutos. Depois disso, adicione MCS ao tubo contendo células corticais para aumentar seu volume até dois mililitros e aos tubos restantes para trazer cada um de seus volumes até um mililitro. Uma vez que as colunas estejam vazias de tampão de lavagem, carregue dois mililitros de células corticais na grande coluna de esgotamento e um mililitro da suspensão celular entre si em colunas de seleção separadas.
Em seguida, lave as colunas de esgotamento grande com um mililitro de buffer MCS e lave cada grande coluna de seleção duas vezes usando um mililitro de buffer MCS para cada lavagem. Filtre as células através de 35 tampas de coador de microliter em tubos FACS de fundo redondo. Centrifugar esses tubos a 400 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos para pelotar as células.
Em seguida, despeje lentamente o sobrenante e dab a borda do tubo em papel de tecido. Resuspense as células em cada tubo com 300 microliters de tampão FACS. Primeiro, adicione cinco microliters de receptores FC de rato bloqueiam o reagente a cada tubo.
Incubar no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione um microliter de CD45 PE tamanho sete e um microliter de CD11B BV421 para cada tubo. Incubar os tubos em um agitador em temperatura ambiente por 10 minutos.
Depois disso, adicione dois mililitros de tampão FACS para lavar. Centrifugar a 400 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos para pelotar as células. Resuspenque as células em cada tubo com 400 microliters de tampão FACS contendo um microliter de inibidor de RNase e 0,5 microliters de iodeto de propídio.
Seguindo o procedimento FACS padrão, classifique microglia viva única com um bocal de 100 micrômetros em placas PCR de 96 poços que contêm quatro microliters de tampão de lise em cada poço. Brevemente vórtice das placas e gire-as para baixo usando uma centrífuga superior de banco. Armazene as placas a menos 80 graus Celsius até a preparação da biblioteca.
Quando estiver pronto para prosseguir, descongele a placa no gelo. Use um cicloviário térmico para realizar uma primeira transcrição para gerar cDNA e amplificar o cDNA com uma etapa adicional de digestão exonuclease, conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, purifique o cDNA adicionando 18 microliters de contas magnéticas a cada poço.
Incubar a placa em um suporte magnético por cinco minutos. Em seguida, remova o supernascer e lave as amostras duas vezes com 80% de etanol recém-feito usando 80 microliters de etanol por poço para cada lavagem. Para realizar a tagmentação, use uma máquina de pipetação nanoliter para misturar 0,4 microliters de cada amostra cDNA com 1,2 microliters de reagentes de tagmentação Tn5 do kit de preparação da biblioteca em uma placa de 384 poços a 55 graus Celsius por 10 minutos.
Para parar a reação de tagmentação, adicione 0,4 microliters de tampão de neutralização à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, com 384 índices e 1,2 microliters de PCR misturados às amostras e amplificando as bibliotecas conforme descrito no protocolo de texto. Misture todas as bibliotecas individuais da mesma placa de 384 poços e use contas magnéticas para purificar as bibliotecas finais.
Neste estudo, a microglia está isolada do córtex, cerebelo, hipocampo e estriado do hemisfério cerebral de um camundongo adulto. A suspensão celular preparada é examinada sob um microscópio usando azul tripano e um hemócito para estimar o rendimento, a viabilidade celular e a eficácia da remoção da mielina antes de realizar a coloração de anticorpos. A contagem total de células neste momento deve ser de mais de 30.000 para o córtex e mais de 5.000 para os outros tecidos.
Mais de 90% das células devem ser viáveis com pequenos detritos de mielina. Uma máquina FACS é usada para classificar a microglia, que normalmente são CD45 baixa e CD11B positivo. O isolamento bem sucedido deve gerar mais de 80% de microglia de todas as células únicas vivas, pelo menos para o tecido cortical.
Uma vez que a microglia individual é capturada no tampão de lise, o RNA é liberado e posteriormente transcrito para cDNA, que é então amplificado para 23 ciclos. Como uma plataforma de eletroforese capilar, o analisador de fragmentos e kits de fragmentos de NGS altamente sensíveis fornecem informações rápidas e precisas sobre a distribuição do tamanho, bem como a quantidade de moléculas de CDNA presentes em cada poço de uma placa de 96 poços. Amostras que mostram uma mancha entre 500 e 5.000 pares de base e estão acima de um certo limiar de concentração podem ser usadas para fazer bibliotecas.
As amostras são sequenciadas a uma profundidade de mais de um milhão de leituras brutas por célula, o que satura o poder de detecção da metodologia de sequenciamento de RNA unicelular. Com uma taxa de mapeamento de aproximadamente 60% sobre 2.000 genes podem ser detectados por célula microglial. Dados publicados anteriormente gerados a partir deste método de isolamento são reproduzidos a partir de experimentos independentes, demonstrando a sensibilidade para detectar genes específicos de microglia em toda a população sequenciada.
Com as informações de transcrições de microglia únicas, os pesquisadores podem descobrir as populações celulares únicas no contexto de seu interesse, e estudar melhor a relevância funcional dessas populações recém-identificadas.
