Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (Grant 53085), a Fundação JR Oishei, e The American Lung Association (Grant RG-123721-N) para APH e NIH (NIDCD) comunhão F31DC011218 a EAC.

1. Preparando culturas bacterianas <ol><li> Cultivo de cultura para utilização em experiências <ol><li> Em um bloco de aquecimento 37 ° C, descongelar um estoque congelado-frasco de S. pneumoniae e adicionar o seu conteúdo para 9 ml de fresco, pré-aquecido o caldo de Todd-Hewitt com extracto de levedura 0,5% (THY) para um volume total de 10 ml para um tubo de cultura de vidro. </li><li> Incubar estaticamente a 37 ° C até a cultura atingir a fase mid-log (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6). </li></ol></li></ol> 2. Detectando despolarização da membrana e ruptura <ol><li> Preparar reagentes <ol><li> Prepare um estoque de 50 mM de DiBAC 4 (3) em 100% DMSO, e um mg / ml 2 de PI em DDH 2 O. O DiBAC 4 (3) estoque é estável a -20 ° C durante pelo menos 6 meses. O estoque PI é estável a 4 ° C durante pelo menos 6 meses. </li><li> Enrole ações em papel alumínio para proteger da luz. </li></ol></li><li> Carregamentobactérias <ol><li> Agregar as células bacterianas a partir do passo 1.2.2 por centrifugação a 2400 xg durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes, removendo o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 10 ml de 1x com fosfato tamponado salino (PBS), e centrifuga-se novamente a 2.400 xg durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS no volume original. Isto irá fornecer durante cerca de 10 8 unidades formadoras de colônias de bactérias por ml. Remover 1 ml (suficiente para cinco amostras) de células lavadas e colocar num tubo de microcentrífuga. </li><li> Para estas células, adicionar 25 ul de uma solução 1 M esterilizado por filtro de estoque de glicose (preparado em ddH2O e filtrada através de um filtro de 0,45 um) para uma concentração final de glicose 25 mM, e incubar em um bloco de aquecimento de 37 ° C por quinze minutos. NOTA: Este fornece energia para todos os canais de membrana ATP-dependentes e componentes celulares. A necessidade para esta etapa podem variar, dependendo da experiência. </li><li> Adicionar 5 mL de 50 mM DiBAC 4 (3) estoque e 10 mL do estoque 2 mg / ml PI. Isto proporciona uma concentração final de 250 nM e 20 ug / ml, respectivamente. Misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Adicionar 200 ul desta suspensão de células a cada poço de amostra de um claro placa de 96 poços. </li></ol></li><li> A detecção de fluorescência <ol><li> Colocar a placa num pré-aquecido (37 ° C), leitor de placas de detecção de fluorescência. </li><li> Certifique-se de que os filtros apropriados estão em vigor para DiBAC 4 (3) (490 nm de excitação, emissão 516 nm) e PI (535 nm de excitação, emissão 617 nm). </li><li> Para permitir (e ao ​​mesmo tempo monitorar) equilíbrio de DiBAC 4 (3) sobre a membrana, defina o leitor a tomar medidas de fluorescência a cada min por cerca de 30-40 minutos, ou até que a leitura se estabilize, o que serve como uma leitura &quot;pré-tratamento&quot;. </li><li> Ejetar placa e adicionar o agente experimental de escolha e immediately colocar a placa de volta na leitora para continuar a monitorizar DiBAC 4 (3) e fluorescência de PI para o período de tempo desejado. Se o tratamento de várias amostras de uma vez, usando uma pipeta de canais múltiplos pode ser útil adicionar o agente ao mesmo tempo para todos os poços. </li><li> Exportar as leituras de um programa de análise de dados, como o Microsoft Excel. Gráfico de fluorescência ao longo do tempo para avaliar a despolarização da membrana e ruptura. O aumento de fluorescência de DiBAC e PI indica que a despolarização e ruptura ocorrem. </li></ol></li></ol> 3. Detecção de alterações no intracelular de Ca 2 + ou K + Concentrações <ol><li> Preparar os reagentes e tampão de carregamento <ol><li> Preparar os seguintes reagentes: 5 mM de estoque do corante fluorescente sensível aos iões (Fura-2/AM ou PBFI / AM, adicionar a quantidade apropriada de DMSO para um tubo contendo 50 mg de corante), &quot;100X&quot; probenecida (adicionar 1 ml de PBS para um frasco de 77 mg). O solubilizadoCorantes podem ser congeladas a -20 ° C uma vez e são estáveis ​​em solução durante 3 meses, ao passo que a probenecida é estável em solução a -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Prepare 1 ml de 2x tampão de carregar como se segue: Na parte inferior de um tubo de 15 ml de plástico, dispensar 20 ul de carga de potência 100X concentrado (estável a 2-8 ° C durante 6 meses), seguido de 2 ul de 5 mM de ião sensível corante diretamente na carga de potência. Vortex brevemente para misturar. Adicionar 960 ul de PBS, seguido de 20 ul de 100x probenecida. Vortex da mistura uma última vez. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz. </li></ol></li><li> Colocação das bactérias com corante <ol><li> Agregar e lavar a cultura bacteriana fase mid-log, conforme descrito no ponto 2.2.1. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de PBS para fazer uma suspensão de células &quot;2x&quot;. </li><li> Adicionar 1 ml de suspensão de células para a 2x 2x Carregando Buffer. Isto irá fornecer para um volume final de 2 ml, e concentr finaisções de 1x carga de potência, 5 uM de corante fluorescente, e 1x probenecida. NOTA: Esta suspensão fornece o volume suficiente para 10 amostras, já que cada poço da amostra para medição conterá 200 mL. </li><li> Incubar em C num banho de água a 37 ° durante 75 minutos, ao abrigo da luz. NOTA: O corante é carregado para dentro das células bacterianas, na ausência de quaisquer substratos glicolíticas e na presença de probenecida para minimizar o efluxo do corante. </li><li> LAVAGEM 1: Agregar as células por centrifugação a 2400 xg durante 10 min, remover o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de PBS contendo probenecid 1x. LAVAGEM 2, 3: Repita o passo 3.2.4 2x. Incubar a 37 ° C durante mais 30 min. Isto irá permitir que o tempo para as esterases bacterianas para hidrolisar o grupo éster AM longe dos corantes fluorescentes internalizadas. </li><li> LAVAGEM 4: Agregar as células por centrifugação a 2400 xg durante 10 min, remover o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de PBS contendo probenecid 1x. NOTA: Dependendo do experiment, a glicose pode ser adicionado de volta aqui para re-energizar as bactérias. </li></ol></li><li> A detecção de fluorescência <ol><li> Pré-aquecer o leitor de placas de leitor de placas de detecção de fluorescência a 37 ° C. </li><li> Para cada amostra desejada, adicionar 200 ul de células carregadas (a partir do passo 3.2.8) para os poços de uma placa de 96 poços. (Siga os seguintes passos para a conclusão de um poço / amostra de cada vez). </li><li> Para estabelecer uma base de leitura para um poço, colocar a placa na placa-reader detecção de fluorescência para medir a fluorescência (340 nm de excitação / emissão de 510 nm para &quot;Valor 1&quot; e 380 nm de excitação / emissão de 510 nm para &quot;Valor 2&quot;) em a cada segundo por um min. </li><li> Ejetar prato, adicione o tratamento de escolha para que o bem (em um pequeno volume de aproximadamente 5 mL), rapidamente pipeta cima e para baixo algumas vezes para misturar e coloque imediatamente de volta ao leitor de placa de detecção de fluorescência para ler a cada segundo por desejado comprimento de tempo. (Se o emjectors associadas com o leitor de placas estão disponíveis, estes também pode ser utilizados para adicionar continuamente o tratamento desejado, eliminando a necessidade de parar a leitura e ejectar a placa). </li><li> Exportar as leituras de um programa de análise de dados, como o Microsoft Excel. Calcula-se a razão dos valores de fluorescência para cada ponto de tempo dividindo um valor pelo valor 2, e representar os valores da relação de um gráfico. </li></ol></li></ol> 4. Detectar mudanças em pH intracelular <ol><li> Preparar reagentes e tampões de calibração <ol><li> Preparar os seguintes reagentes: 5 mM de estoque de BCECF / AM (. Adicionar a quantidade apropriada de DMSO para um tubo contendo 50 ug do corante Este estoque é estável a -20 ° C durante 3 meses); 100x probenecida (adicionar 1 ml de PBS a um frasco de 77 mg);. uma preparação de estoque mM de nigericina em etanol (necessária para equilibrar o pH intracelular (pH i) das células para o pH do tampão circundante Este estoque é stabela a -20 ° C durante 6 meses);. estoque 0,5 mM de cianeto de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP) em DMSO (protonophore para desacoplar a força motriz de protões Este estoque é estável a -20 ° C durante 6 meses) </li><li> Preparar 10 ml das seguintes tampões elevados de potássio: NaOH 135 mM de KH 2 PO 4/20 mM (monobásico) e 110 mM de NaOH K 2 HPO 4/20 mM (dibásico). Filtro esterilizar utilizando um filtro de 0,45 um. (Estes tampões podem ser armazenadas a 4 ° C até utilização). </li><li> Misturar os buffers elevados de potássio nas proporções necessárias para criar amortecedores elevados de potássio com pelo menos 5-6 valores de pH variando entre 6,5 e 8,0. </li><li> Prepare 1 ml de 2x tampão de carregar como se segue: Na parte inferior de um tubo de 15 ml de plástico, dispensar 40 ul de carga de potência de 100x, seguido de 20 ul de corante sensível aos iões 5 mM directamente na carga de potência. Vortex brevemente para misturar. Adicionar 900 ul de PBS, seguido de 40 ul de 100x probenecida. Vortex a mistura de uma última vez. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz. </li></ol></li><li> Colocação das bactérias com corante <ol><li> Pellet e lavar os 8 ml da cultura bacteriana de fase mid-log, como descrito em 2.2.1. Remover o sobrenadante, ressuspender sedimento em 2 ml de PBS para fazer uma suspensão de células &quot;4x&quot;. </li><li> Adicionar 1 ml de suspensão de células a 4x ao carregar 2x Tampão. Isto irá proporcionar um volume final de 2 ml, e concentrações finais de células 2x, 2x carga de potência, 50 uM de corante fluorescente, e 2x probenecida. </li><li> Incubar em C num banho de água a 30 ° durante 40 minutos, ao abrigo da luz. NOTA: O corante é carregado para dentro das células bacterianas na temperatura mais baixa, de 30 ° C e na ausência de quaisquer substratos glicolíticas para minimizar o efluxo do corante. </li><li> WASH 1: Pellet células por centrifugação a 2400 xg por 10 minutos, retire o sobrenadante para se livrar do excesso de corante, e ressuspender em 4 ml de PBS contendo 2x probenecida umnd 1 mM de glicose (reenergize as bactérias). LAVAGEM 2, 3: Repetir o passo 4.2.7, duas vezes, com a ressuspensão final em 4 ml de PBS (para uma concentração final de células 1x) contendo probenecid 2x e 10 mM de glucose. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 5 min. Isto irá permitir que as células completamente para energizar e permitir tempo para as esterases bacterianas para clivar o grupo de éster AM distante do BCECF internalizado. </li></ol></li><li> Estabelecimento de fluorescência de fundo e em curva de calibração vivo <ol><li> Pré-aquecer o leitor de placas de leitor de placas de detecção de fluorescência a 37 ° C. </li><li> Para determinar a fluorescência de fundo, filtro-esterilizar a cerca de 500 ul da suspensão bacteriana carregada e energizada (a partir do passo 4.2.7) para remover as bactérias, e adicionar 200 mL de filtrado para o poço da placa de 96 poços. </li><li> Coloque a placa no leitor de placa de detecção de fluorescência para medir a fluorescência (490 nm de excitação / emissão de 530 nm para&quot;Valor 1&quot; e 440 nm de excitação / emissão de 530 nm para &quot;Valor 2&quot;) para 1 min. Esta fluorescência de fundo deve ser subtraído antes do cálculo das proporções tanto para a curva de calibração e as amostras experimentais. </li><li> Para obter uma curva de calibração in vivo, lavar alíquotas de 500 ul de células carregadas e desligado a partir do passo 4.2.7 vez e ressuspender em tampões elevados de potássio em diferentes valores de pH (desde 6,5-8,0). </li><li> Adicionar 20 uM nigericina para as amostras a equilibrar o pH intracelular das células para o pH do tampão circundante e incubar a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 200 ul de tampão de combinações de bactérias / pH para os poços de uma placa de 96 poços. </li><li> Coloque a placa no leitor de placa de detecção de fluorescência para medir a fluorescência por alguns minutos para estabelecer uma leitura estável para cada poço. Exportar as leituras de um programa de análise de dados, como o Microsoft Excel. </li><li> Depois de subtrair o baOs valores de fluorescência ckground, calcular a razão entre os valores da fluorescência, dividindo pelo valor 1 Valor 2. Plotar os valores da relação de cada tampão de pH para criar a curva de calibração. (Uma curva de calibração deve ser gerado para cada novo lote de células carregadas, como a quantidade de corante fluorescente, que é carregado na bactéria pode variar de cada vez). </li></ol></li><li> Medidas de mudanças no pH intracelular <ol><li> Para cada amostra desejada, adicionar 200 ul de células carregadas e tensão (a partir do passo 4.2.7) para os poços de uma placa de 96 poços. </li><li> Coloque a placa no leitor de placas de detecção de fluorescência e medir a fluorescência das amostras a cada 5 segundos durante 5 minutos. </li><li> Ejectar a placa e adicionar 10 mM de CCCP a uma cavidade (serve como o controlo positivo para a diminuição do pH intracelular) e o agente experimental (s) de interesse para as outras cavidades. Para comparar com precisão os seus efeitos ao longo do tempo, adicione o CCCP e agentes de escolha ao mesmo tempo usando amultichannel pipeta. </li><li> Retornar imediatamente a placa para o leitor de placas e medir a fluorescência de continuar a cada 5 segundos durante 10 minutos. Como um controle adicional, ejectar a placa e adiciona-se 20 uM Nigericina para todas as amostras a equilibrar a i das bactérias pH ao pH do tampão circundante, e lido por 5 min. </li><li> Depois de se subtrair os valores da fluorescência de fundo, calcular as proporções de fluorescência para cada amostra. Interpolar o i pH para cada leitura a partir da curva de calibração. </li></ol></li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros a declarar.

Apesar da limitação que o tamanho apresenta para a utilização de métodos clássicos de eletrofisiologia para detectar mudanças na polaridade e integridade da membrana e as mudanças na concentração de íons dentro de bactérias, descrevemos uma forma de medir esses eventos em S. pneumoniae utilizando corantes fluorescentes. Nossos protocolos são os primeiros de sua espécie descrita para o pneumococo e um dos poucos descritos para espécies de bactérias em geral. Utilizando um leitor de placas de dete...

O nosso laboratório identificou um complexo proteína-lípido a partir de leite humano chamado ALDEOLA (por alfa-lactalbumina humana Feito letal para as células de tumor), que induz a apoptose em células tumorais, mas também é capaz de matar uma variedade de espécies bacterianas 1,2. As espécies que se verificou serem particularmente sensíveis eram os que visam o aparelho respiratório, com o Streptococcus pneumoniae (pneumococos), exibindo a maior sensibilidade e um fenótipo semelhante a apoptose de morte 2,3. Eventos de transporte de despolarização da membrana e de iões específica são bem descritas e eventos cruciais durante a apoptose em células eucarióticas, em particular nas mitocôndrias, onde iões radioactivos + TPP e corantes fluorescentes incluindo JC-1 e TMRE têm sido utilizados para demonstrar a despolarização da membrana mitocondrial 3 -5. Assim, buscou-se saber mais sobre o efeito de HAMLET sobre esses recursos relacionados à membrana no pneumococo como nós nos concentramos nossos esforços parapromover uma melhor compreensão dos componentes mecanicistas do fenótipo de apoptose como em bactérias, com grande potencial para a identificação de novas terapias anti-bacterianos ou vacinas candidatas no processo. Ao procurar estabelecer protocolos para os nossos estudos mecanicistas, descobrimos que, em contraste com a metodologia bem descrito em sistemas eucariotas, existem muito poucos estudos que detalham electrofisiologia e transporte de iões de mecanismos de 6,7 a membrana bacteriana. Isto é atribuído principalmente ao menor tamanho de microorganismos e sua arquitetura de superfície, em particular a presença de paredes celulares, que limita a acessibilidade da membrana para a utilização de métodos convencionais, como eucarióticos patch clamping, embora alguns estudos com protoplastos gigantes foram realizados com sucesso misturado 8,9. Como trabalho com esses protoplastos gigantes não é um método ideal ou mesmo prático para a maioria das espécies de bactérias, uma vez que requer que o homemipulated bactérias num estado anormal e abiótico, os estudos limitados de polarização da membrana bacteriana que tenham sido efectuados empregaram principalmente de citometria de fluxo e a utilização de cianina e corantes fluorescentes oxonol 10-16. Em vez de citometria de fluxo, que reúne as leituras de fluorescência individuais de uma bactéria a um único ponto de tempo, optou-se por utilizar um leitor de placas de detecção de fluorescência para detectar a intensidade de fluorescência de suspensões bacterianas, em um formato de placa de 96 poços ao longo do tempo. Isto permitiu-nos para tratar uma população de bactérias em vários momentos com muito mais simplicidade e facilidade, e monitorar continuamente a cinética de fluorescência de toda a população por longos períodos de tempo, o que é difícil de conseguir por citometria de fluxo. Depois de testar uma grande variedade de corantes fluorescentes sensíveis potenciais (incluindo aqueles acima mencionados para utilização com as mitocôndrias), que obteve o melhor sucesso técnico e prático utilizando ocorante bis-oxonol chamado DiBAC 4 (3) (bis-(ácido 1,3-dibutylbarbituric) oxonol trimethine) para monitorar mudanças na polaridade. Encontramos também é valioso para monitorar simultaneamente interrupções na integridade da membrana utilizando iodeto de propídio (PI). Este corante fluorescente por ligação a ácido nucleico, mas é apenas capaz de fazer isso, quando a integridade da membrana bacteriana é comprometida, o que torna o componente popular usado para detectar células mortas em ensaios de coloração vivos mortos. Além PI, SYTOX verde e TO-PRO-1 são corantes fluorescentes que são semelhantes em acção e que tenham sido previamente utilizados para as bactérias em alguns estudos de citometria de fluxo, utilizando métodos de detecção 17. Optamos por usar PI devido a seu comprimento de onda de excitação que nos permitiu acompanhar a sua fluorescência em simultâneo com DiBAC em uma dada amostra. Em nossos estudos, observamos que HAMLET, bem como um outro complexo protéico-lipídica relacionada com a atividade bactericidaconhecido como ELOA, a despolarização induzida e ruptura da membrana bacteriana, tal como indicado por um aumento na fluorescência de ambos os corantes sobre o tratamento dos pneumococos 3,18,26. Para ambos os complexos, observou-se que a intensidade de fluorescência de DiBAC 4 (3) um aumento em relação ao aumento da intensidade de PI, indicando que a despolarização ocorreu antes da ruptura e é, por conseguinte, um evento específico induzida pelos nossos complexos proteína-lípido de bactericidas interesse. Esta distinção é importante para fazer, como ruptura da membrana pode-se causar despolarização inespecífica. Cinética de medição e análise, tanto DiBAC 4 (3) e PI fluorescência simultaneamente nos permitiu analisar essa relação entre os dois eventos de membrana, o que é uma vantagem adicional do uso fluorometria em vez de citometria de fluxo. Para monitorar o fluxo de íons bacteriana, tem havido algum sucesso anterior com o uso de radioisótopos, incluindo medição de absorção de45 Ca 2 + no pneumococo 19,20, que também têm utilizado em nossos estudos recentes 18, 21. No entanto, trabalhar com esses íons radioativos tem vários inconvenientes. Eles podem ser caro, demorado e complicado, e pode também expor o indivíduo realizando a experiência de prejudicar, dependendo do isótopo de interesse. Além disso, é difícil controlar as rápidas mudanças ao longo do tempo. Assim, voltou-se para um método alternativo de medição que utiliza versões acetoximetílico (AM) de éster de corantes indicador fluorescente sensível ao íon. Por si só, o corante indicador é carregada e não passar facilmente através da membrana, mas com a adição do grupo de éster lipofílico, a molécula não carregada pode agora passar através da membrana da bactéria. Ao entrar no interior, as esterases bacterianas clivar o grupo éster, deixando o corante livre no interior da célula e novamente carregado, diminuindo significativamente a sua capacidade para sair da célula e permitindo que o corante to acumular dentro ao longo do tempo. No entanto, o uso desses corantes éster só foi descrito em algumas espécies bacterianas para detectar alterações no Ca2 + intracelular e 22-24 H + 16, com diferentes métodos de carregamento, detecção, e sucesso. Com o desejo de monitorar mudanças na Ca 2 + intracelular e também os níveis de K + e H + em S. pneumoniae após tratamento com ALDEOLA e outros compostos, que criado com sucesso protocolos para carregar eficientemente corantes indicadores fluorescentes em células bacterianas. Carregamento eficaz em bactérias necessárias tanto probenecida que aumenta a retenção de corante, bloqueando ânion-transportadores e carga de potência, um composto proprietário da Life Technologies, que aumenta a eficiência de carregamento. Fura-2/AM (detecção de Ca 2 +), PBFI / AM (detecção de K +), e BCECF / AM (detecção de H +) foram carregados com êxito em ambos não encapsulada e encapsulado pneumocócica ruachuvas que permitem a medição dos padrões de fluorescência resultante após adição de ionóforo, tais como ionomicina (Ca 2 + desacoplador), valinomicina (K + desacoplador) e CCCP (H + desacoplador) utilizando um leitor de placas de detecção de fluorescência 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

Despolarização da membrana e de iões de fluxos são eventos que têm sido extensivamente estudadas em sistemas biológicos, devido à sua capacidade de influenciar profundamente as funções celulares, incluindo a energética e transduções de sinal. Embora ambos os métodos fluorescentes e eletrofisiológicos, incluindo o uso de eletrodos e patch-fixação, foram bem desenvolvidos para medir esses eventos em células eucarióticas, a metodologia para a medição de eventos semelhantes em microorganismos têm se mostrado mais desafiador para desenvolver dada a sua pequena dimensão, em combinação com o mais complexo a superfície exterior de bactérias blindagem da membrana. Durante nossos estudos de morte-iniciação em Streptococcus pneumoniae (pneumococo), queríamos para elucidar o papel dos eventos de membrana, incluindo mudanças na polaridade, integridade e concentrações de íons intracelulares. Pesquisando na literatura, encontramos que existem poucos estudos. Outros pesquisadores haviam monitorado captação do radioisótopo ou equilíbrio para medir gripe íonxes e potencial de membrana e um número limitado de estudos, principalmente em organismos gram-negativos, já tinha visto algum sucesso usando carbocianina ou oxonol corantes fluorescentes para medir o potencial de membrana, ou carregar bactérias com acetoximetílico célula-permeante (AM) versões de éster de íon sensível corantes fluorescentes indicadores. Nós, portanto, estabelecido e otimizado protocolos para medir o potencial de membrana, ruptura e íon-transporte no organismo Gram-positivas S. pneumoniae. Desenvolvemos protocolos utilizando o corante de bis-oxonol DiBAC 4 (3) e o iodeto de propídio corante célula-impermeabilizante para medir a despolarização da membrana e de ruptura, respectivamente, bem como os métodos para carregar de forma optimizada os pneumococos com os ésteres de AM dos corantes raciométrica Fura-2, PBFI, e BCECF para detectar alterações nas concentrações intracelulares de Ca 2 +, K + e H +, respectivamente, utilizando um leitor de placas de detecção de fluorescência. Estes protocolos são o primeiro de seu tipo para o pneumococoe a maioria dos corantes não têm sido utilizados em todas as outras espécies bacterianas. Apesar de nossos protocolos foram otimizados para S. pneumoniae, acreditamos que essas abordagens devem constituir um excelente ponto de partida para estudos similares em outras espécies bacterianas.

Para todas as experiências, há uma amostra e um conjunto de condições presentes em cada poço. Assim, cada traçado representa a intensidade de fluorescência de uma população inteira de bactérias ao longo do tempo. Os resultados devem ser facilmente interpretável, com uma clara distinção entre a fluorescência das amostras tratadas e que os controles não tratados. A cinética eo grau de uma mudança observada na fluorescência poderia fornecer informações sobre o possível mecanismo e extensão do...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Ao contrário do que a observada para eucariotos, há uma escassez de estudos que despolarização detalhes membrana e concentração de íons mudanças nas bactérias, principalmente como seu pequeno tamanho faz com que os métodos convencionais de medição difícil. Aqui, os protocolos de detalhe para monitoramento de tais eventos no patógeno Gram-positivo significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescência.

Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando corantes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K visualizações.  University at Buffalo, State University of New York.  Ao contrário do que a observada para eucariotos, há uma escassez de estudos que despolarização detalhes membrana e concentração de íons mudanças nas bactérias, principalmente como seu pequeno tamanho faz com que os métodos convencionais de medição difícil. Aqui, os protocolos de detalhe para monitoramento de tais eventos no patógeno Gram-positivo significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescência. 

Vídeo: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Capsular sorotipagem de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por aglutinação em látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

Rotulagem de anticorpos com corantes fluorescentes utilizando proteína Magnetic A e esferas de proteína G

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

Purificação do compartimento da membrana retículo endoplasmático associado a degradação de antígenos exógenos em cruz-apresentação

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...