This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparação de in-house Reagentes látex <ol><li> Preparação de solução salina tamponada com glicina (GBS) <ol><li> Adicionar 1,5 g de glicina, cloreto de sódio e 11,7 g de 100 ml de água destilada para uma proveta de vidro de 200 ml. </li><li> Misturar até dissolver-se utilizando um agitador magnético. </li><li> Transferir a mistura de 500 ml de medição de cilindro e adicionando água destilada, para perfazer um total de 200 ml. </li><li> Transferir a solução de volta para o copo de 200 ml, verificar o pH e ajustar para 8,2 com hidróxido de sódio 5 M. NOTA: O hidróxido de sódio é corrosivo, usar equipamento de protecção pessoal. </li><li> Filtrar esterilizar a solução com 0,22 mm e vários filtros de 60 ml seringas em um frasco de vidro com tampa de rosca ml preautoclaved 250. </li><li> Armazenar à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de GBS com 0,2% de albumina de soro bovino <ol><li> Adicionar 0,2 g de albumina de soro bovino (BSA) em pó e 100 ml de GBS para uma proveta de vidro de 200 ml e misturar até se dissolver utilizando um agitador magnético. </li><li> Filtraresterilizar a solução através de filtros de 0,22 mM utilizando várias seringas de 60 ml em um ml preautoclaved parafuso frasco de vidro tampado 250. </li><li> Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de reagentes Latex <ol><li> Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo. NOTA: rodada tubos de fundo são usados ​​para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. </li><li> Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro pneumocócica adequado ao reagente de látex a ser preparado (por exemplo, associação, grupo, o tipo ou o factor). Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Dilui-se partículas de látex de poliestireno 01:10 por adição de 120 ul de partículas de látex de 1,080 pi de solução salina fisiológica estéril. NOTA: Este pode ser feito em grandes volumes, mas deve ser feito fresco cada vez que os reagentes de látex são produzidas. </li><li> Adicionar 1000 mL da suspensão de látex 1:10 (preparado no passo 1.3.3) para o 1,000 ul de suspensão 1:40 de anti-soro (preparado no passo 1.3.2). Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Incubar a 37 ° C sobre uma roda de rotação lenta (por exemplo, 4 rpm para uma roda de 38,5 cm de diâmetro), durante 2 horas. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em 2 ml de solução salina estéril. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1100 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de GBS e delicadamente ressuspender o sedimento. </li><li> Pipetar a suspensão de látex em um rotulados 5 ml com tampa de rosca de tubo. Adicione mais 1 ml de GBS. </li><li> Adicionar 2 ml de GBS contendo 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparada no passo 1.2). Adicionar 40 ul de 10% (w / v) de solução de azida de sódio como conservante. NOTA: A azida sódica é perigoso se inalado, e é uma pele e dos olhos irritante. É desejável para adquirir uma solução preparada a 10% em vez do que a forma em pó, como o que minimiza o risco de exposição por inalação. Equipamento de proteção individual (incluindo luvas umóculos d respingo) deve ser usado quando manusear este reagente. Consulte a Ficha de Segurança para obter detalhes. </li><li> Reagentes de látex armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação do reagente de látex controlo negativo <ol><li> Rotular a 2 ml redondas microtubo de fundo. NOTA: rodada tubos de fundo são usados ​​para minimizar partícula acerto o que pode afetar ligação de anticorpos. </li><li> Usando uma pipeta P1000 com pontas estéreis adicionar 975 ul de GBS no tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar 25 ul de anti-soro de coelho normal. Inverta cinco vezes para misturar. </li><li> Proceda como nos passos 1.3.3 a 1.3.10 acima </li></ol></li></ol> 2 Controle de Qualidade (CQ) de látex Reagentes <ol><li> Traga reagente de látex para TR. Imediatamente antes da utilização, mistura suavemente o reagente de látex, invertendo o tubo várias vezes. </li><li> Verifique reagente para autoaglutinação pipetando 15 mL em uma lâmina de vidro e proceda como nos passos 4.7 e 4.8 abaixo. Não deve haver umgglutination das partículas de látex. O reagente deve aparecer branca e lisa. </li><li> Teste o reagente contra um painel de baixa passagem isolados de pneumococo. Use culturas recém-cultivadas preparados como no passo 3 O painel de isolados deve incluir isolados do sorotipo &#39;target&#39; (o sorotipo específico para o reagente a ser testada) e sorotipos &quot;não-alvo&quot; (isolados de outros sorotipos que não deve normalmente cruzam reagem com o reagente). Inclua pelo menos um isolado de cada alvo e não-alvo para cada sorotipo reagente látex passando por QC. Se houver apenas um alvo ou sorotipo não-alvo, teste de duas amostras diferentes do sorotipo particular. NOTA: O painel de teste deve incluir vários isolados de cada sorotipo, alguns dos quais são comuns na doença invasiva e / ou coleções de culturas de tipo. É preferível incluir uma carruagem isolados, uma vez que são muitas vezes mais exigente para o serótipo (dados não mostrados), assim, ainda mais a testar o Capacidadef os reagentes e garantir que os reagentes são provavelmente capazes de sorotipagem tanto invasivo e transporte isola. </li><li> Proceder com testes de reagentes de látex com alvo e pneumocócica não-alvo isolados de acordo com o método descrito nas etapas 3 e 4 abaixo. </li><li> Reagentes de controle de qualidade no momento da produção e, em seguida, pelo menos, anualmente. NOTA: Se um reagente não passa QC, o lote deve ser descartada e uma nova preparação feita. Em caso de falha de repetição QC recomendamos os reagentes ser produzidos utilizando os métodos alternativos descritos no Ortika et al. De 2013 8 e na discussão que se segue. </li></ol> 3 Preparação das Culturas pneumocócicas para sorotipagem <ol><li> Usando uma agulha esterilizada selecionar uma única colônia da pneumocócica e isolar este raia-se para um meio de ágar de sangue não selectivo sólida de modo que o inoculo primário cobre aproximadamente um terço da superfície da chapa. Streak para colónias isoladas. NOTA: As lâminas preparadas a partir de cavalo desfibrinado ou sangue de carneiro são adequados; mas as placas de sangue preparadas com sangue ou sangue de animais com citrato não são. </li><li> Incubar a placa S / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Observar o crescimento na placa para avaliar a pureza e que há um crescimento suficiente para serotipagem. Observação: Uma cultura pura do isolado de pneumococos é necessário para serotipagem. Na nossa experiência, confluentes, ou perto de crescimento confluente abrangendo aproximadamente um terço da superfície da placa é geralmente suficiente para completar a serotipagem. Como as culturas pneumocócicas podem ser propenso a autólise, culturas preparadas para sorotipagem deve ser testada dentro de 24 horas de subcultura. Não tome a placa de cultura de fora da incubadora mais do que 15 a 20 minutos antes da sorotipagem começa. </li></ol> 4 Realização de sorotipagem de aglutinação em látex <ol><li> Remova todos os reagentes de látex de geladeira e deixe-os a aquecer a temperatura ambiente por aproximadamentemadamente 30 min. Imediatamente antes da utilização, inverter cuidadosamente os tubos para misturar os reagentes. </li><li> Rotular uma lâmina de microscópio. </li><li> Coloque 15 mL de reagente de látex controle negativo sobre a lâmina de microscópio. </li><li> Usando um circuito descartável 1 ml estéril tomar uma varredura da cultura pneumocócica para que o ciclo é de aproximadamente meio cheio. </li><li> Suavemente manchar o inoculo sobre a superfície da lâmina próximo da gota de reagente de látex de controlo negativo. O inóculo deve ser visível sobre a lâmina de vidro. </li><li> Depressa e bem misturar o inóculo para o reagente de látex de controle negativo usando o loop. Certifique-se de que a queda não se espalhou mais longe do que seu tamanho inicial. </li><li> Pegue o slide, segurando-o em ambas as extremidades. Balance a deslizar para trás e para frente para 1 min. Ter o cuidado de manter o líquido em movimento, lentamente, e assegurar que o tamanho da gota não aumenta. NOTA: Como alternativa, use uma placa oscilante. </li><li> Observe a aglutinação macroscópica (ou seja, porolho nu) e compensação da suspensão contra um fundo preto. </li><li> Se o reagente de látex de controlo negativo não mostra nenhuma aglutinação ou de compensação continua testando a cultura, substituindo os reagentes de teste de látex para o reagente de látex de controlo negativo em passos 4,1-4,8 acima. Um laço fresco deve ser usado de cada vez. Prossiga com o teste dos reagentes de látex começando com as piscinas. </li><li> Teste cada um dos reagentes de látex &#39;pool&#39; em sucessão, até que um teste positivo é obtido. NOTA:. A ordem dos testes das piscinas podem ser feitas em &#39;rounds&#39; para refletir a incidência local dos sorotipos específicos (por exemplo, por meio de testes para as três piscinas mais prováveis ​​sobre o primeiro slide Se uma reação positiva não é obtido, em seguida, teste a próxima mais provável três das piscinas restantes na segunda corrediça, e assim por diante até que uma reacção positiva é obtido). Isto assegura que os serotipos mais comuns são testados em primeiro lugar, minimizando o tempo e os reagentes necessários. </li><li>Usando a chave do fabricante do anti-soro anti-soros individuais determinar quais são representados no conjunto positivo. </li><li> Teste cada um dos grupos ou tipos contidos na piscina positiva individualmente para determinar o &#39;grupo&#39; ou &#39;tipo&#39; como nos passos 4,1-4,8 acima. </li><li> Determinar o resultado por referência a chave do fabricante do anti-soro. Se um &#39;tipo&#39; é determinado (por exemplo, o sorotipo 5), então não há mais testes são necessários e este resultado é gravado. </li><li> Se um &#39;grupo&#39; é determinado (por exemplo, grupo 19), em seguida, referem-se à chave fabricantes para determinar os fatores a serem testados. Continuar os testes com os reagentes de látex &quot;fator&quot; individuais e determinar o sorotipo final (por exemplo, 19B sorotipo). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem pneumocócica. Comerciais pneumocócicas reagentes de aglutinação de látex estão disponíveis, mas que atualmente não fazem distinção todos os sorotipos de pneumococos conhecida 10,12. No entanto, reagentes de aglutinação de látex pode ser facilmente produzido em casa usando anti-soros comprado levantada contra antígenos capsulares de pneumococos específicos. No método aqui descrito, os anticorpos são passivamente ligado a partículas de látex para fazer um conjunto de reagentes de aglutinação de látex. Uma reacção positiva ocorre quando o látex anticorpos específicos ligados às partículas de látex atribuem aos antigénios sobre a cápsula polissacarídica do pneumococo isolar 18,19. As partículas de látex ligados aos anticorpos permite a reacção anticorpo-antigénio específico a ser visualizado sem ampliação. Aglutinação em látex é um método adequado para um elevado rendimento laboratóriosd também para locais com poucos recursos. As principais vantagens do método são de aglutinação em látex que não é necessário equipamento especializado para executar o teste, os reagentes têm um prazo de validade de pelo menos 2 anos, quando armazenados a 4 ° C, 8, e que é de baixo custo, simples e rápida de realizar. Serotipagem um isolado de pneumococos por aglutinação em látex leva aproximadamente 10 minutos, e até quatro reagentes de látex podem ser testadas em paralelo a uma lâmina. Além disso, se a prevalência de serotipos é conhecida para a configuração epidemiológica relevante, os testes podem ser realizados em rodadas começando com as piscinas que contêm os serotipos mais comuns de modo semelhante ao teste de Quellung 17. Esta abordagem minimiza o número de testes necessários para determinar o serotipo. O método também é altamente reprodutível entre diferentes operadores (dados não mostrados). Uma desvantagem de aglutinação em látex serotipagem é que a produção dos reagentes é demorado, tendo cerca de quatro horas; embora REAGE múltiplaes podem ser facilmente produzidos em paralelo. Além disso, alguns antígenos são comuns a diferentes sorotipos de pneumococo, resultando em reações cruzadas com alguns anti-soros (por exemplo, o sorotipo 29, 42 e Grupo 35). No entanto, estas reacções cruzadas estão bem caracterizados pelo uso comercial anti-soros (o que é normalmente pré-absorvido para remover os anticorpos de reacção cruzada mais problemáticos) e tabelas de reacção adicionais são fornecidos pelo fabricante, a fim de distinguir o que se encontra presente serótipo. Reagentes de látex pode também reagiram de forma cruzada se os anticorpos não estão alinhados adequadamente sobre as partículas de látex; estes são detectados como falhas QC. Na nossa experiência, rigoroso QC é central para o sucesso deste método, mesmo quando os anti-soros disponíveis comercialmente são usados ​​para a produção. QC demora aproximadamente 15 min por reagente e depende de um conjunto de QC apropriada isolados como descrito acima. O método aqui descrito resulta em reagentes que dão uma reacção positiva bem widiluir o período de teste. Na nossa experiência, os falsos positivos são raros, na prática, (dados não mostrados). Falsos negativos ocasionais são observadas; geralmente estes se relacionam com problemas conhecidos com um anti-soro específico (por exemplo, o sorogrupo 6 isolados não pode reagir com piscina B anti-soro), ou baixa regulação da expressão cápsula pelo isolado. Usando o algrorithm sorotipagem fornecido pelo fabricante também é importante, como na maioria dos casos, uma reação positiva ou negativa falsa levará a um resultado &quot;final cego &#39;. Nestes casos, e quando as reações são de difícil interpretação, recomendamos repetir-testes e / ou testes por um método alternativo, como a reação Quellung. Alguns solução de problemas é por vezes necessária para fazer reagentes de látex satisfatórios. No método aqui descrito, o anticorpo é ligado a partículas de látex, através de adsorção passiva 15,19, então uma variável crítica é a concentração de anticorpo utilizado, o que determina quão bema superfície das partículas de látex é coberto e o subsequente alinhamento dos locais activos de anticorpos 15,20. Por conseguinte, se o anticorpo em excesso insuficiente ou está ligado às partículas de látex, as reacções antígeno-anticorpo não será óptimo, e reagentes insatisfatórias podem ser produzidos 15,20,21. Como os títulos de anticorpos variar entre diferentes lotes de soros, um conjunto padrão de diluições pode não produzir os reagentes que um bom desempenho 8. Um ponto de partida útil é a utilização de uma diluição 1:40 do anti-soro, se este não é bem sucedida, diluir ainda mais o anti-soro. Em nossa experiência, isso geralmente resolve o problema 8. Em um pequeno número de casos reagentes podem apresentar aglutinação fraca que não é acompanhada de compensação da suspensão, quando testado com alvo isolados. Nestes casos, a diluição de anti-soro não melhora a qualidade do reagente, mas reagentes satisfatórios podem ser geralmente produzidos por omitindo a centrifugação e passos de lavagem 8,22 </sup&gt;. Revestidas de anticorpo partículas de látex são usados ​​comumente em microbiologia de diagnóstico para a detecção, identificação ou sorotipagem de muitos micróbios diferentes 15,20. Como tal, o método aqui descrito pode ser adequado para a preparação de reagentes de látex para outras finalidades, desde que os anti-soros adequados estão disponíveis e são adequados CQ adoptada.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em crianças menores de cinco anos de idade, particularmente em locais com poucos recursos de 1,2 em todo o mundo. Gamas de doença pneumocócica de infecções localizadas a condições de risco de vida, tais como pneumonia, sepse e meningite 1,2. Mais de 90 sorotipos de pneumococos foram identificados com base em diferenças na sua polissacarídeo capsular 3. As vacinas atuais direcionar o polissacarídeo capsular e fornecer proteção contra os principais sorotipos causadores de doença invasiva 4. Sorotipagem pneumocócica isolamentos é importante para avaliar o impacto da vacinação sobre a carruagem e doença, bem como proporcionar informações epidemiológicas mais amplo 5,6. O actual método &quot;padrão ouro&quot; para sorotipagem pneumocócica é o teste Quellung, mas é demorado e requer alguma habilidade para perform 7. Aglutinação em látex é um método de sorotipagem alternativa recomendada pela Organização Mundial da Saúde 7. Aglutinação em látex é rápido e simples de realizar, e é empregada em muitos laboratórios em todo o mundo 8-11. Importante, aglutinação em látex mostrou precisão comparável ao teste Quellung para sorotipagem pneumocócica 10,12-14. No geral, este método é ideal para locais com poucos recursos, bem como laboratórios de alto rendimento. Os reagentes de aglutinação de látex (&#39;reagentes de látex&#39;) são criados por meio da ligação de anticorpos a partículas de látex 15. Numa reacção positiva, estas partículas marcadas aglutinar na presença do antigénio específico. Reagentes de látex comerciais estão disponíveis para uma gama restrita de sorotipos. Reagentes de látex também pode ser preparada em casa usando anti-soros comercialmente disponível 10. Misturas de anti-soro (&quot;pools&quot;), bem como os anti-soros específicos para s pneumocócicaserogroups (por exemplo, grupo 19), os serotipos individuais (por exemplo, o serotipo 5), e a antigénios específicos (&quot;factores&quot;, por exemplo., factor de 19c reconhecimento do serotipo 19A) para a definição mais serotipos dentro grupos estão disponíveis 16. Este manuscrito descreve os principais passos na produção de reagentes de látex utilizando ligação passiva de anti-soros disponíveis comercialmente a partículas de látex. O controlo de qualidade (QC) os aspectos deste método encontram-se descritos, e um protocolo para o uso de reagentes de látex para serotipagem pneumocócica está incluído.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Uma reacção positiva ocorre quando o látex de anticorpo específico de tipo ligado à partícula de látex liga-se a cápsula do pneumococo, e a aglutinação das partículas anticorpo marcado resulta 15. Figura 1A mostra uma reacção positiva, que é caracterizada por aglutinação e de limpeza de fundo suspensão. Uma reacção negativa é caracterizado por a suspensão reagente de aglutinação em látex remanescente suave e branco (Figura 1B). Os reagentes são optimizados de modo a que uma reacção positiva deve ser observada antes do fim do intervalo de tempo de um minuto (geralmente detectáveis ​​em cerca de 20 seg). Nós não recomendamos a leitura reações após o intervalo de tempo de 1 min. Muito ocasionalmente, exibir reacções de aglutinação fracas em torno da borda da gota que não é acompanhada por compensação da suspensão de fundo, ou aparecem &quot;fibroso&quot;, sem compensação de fundo (dados não mostrados). Estes são mais como<html> reações negativas ly. Em tais casos, é recomendável um novo ensaio e / ou investigação adicional utilizando outro método serotipagem (por exemplo, a reacção de Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. reações de aglutinação de látex positivos e negativos. Preparações dos pneumocócica isolar misturado com o reagente de aglutinação em látex, mostrando uma reação positiva (A) ou uma reação negativa (B). Aglutinação acompanhada por compensação do fundo é visto na reacção positiva (A) .há nenhuma aglutinação de látex com o reagente de controlo negativo ou de uma reacção de teste negativo (B). Fotografias 8 usada com permissão.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica.

Capsular sorotipagem de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por aglutinação em látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K visualizações.  Murdoch Childrens Research Institute.  Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica. 

Vídeo: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando corantes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...