Este trabalho foi financiado pela concessão do Projeto Discovery do Conselho de Pesquisa Australiano #1096623.

1. Criando o Vetor de Recombinação
<ol><li>Identificar regiões de ladeamento de 150 bp de longa mente (conhecidas como braços esquerdos e de direita) necessárias para rotular o gene de interesse viral (Ver Figura 1b).</li>
	<li>Projete uma sequência de oligonucleotídeos que compõe os braços esquerdo e direito de 150 bp separados por um par de locais de restrição de escolha. Toda essa sequência também deve ser flanqueada por um segundo par de sites de restrição (diferentes do primeiro par) para permitir a incorporação no vetor TDS uma vez sintetizado. Tome cuidado ao projetar o oligonucleotídeo com locais de restrição que as sequências estão em quadro com o local de inserção desejado.</li>
	<li>Incorpore os locais de restrição entre os braços esquerdo e direito ao projetar o oligonucleotídeo para síntese, que deve coincidir com aqueles que flanqueiam o quadro de leitura aberto da tag fluorescente de escolha (ver Figura 1b). É possível usar um local de restrição NotI como um linker de três aminoácidos entre o braço esquerdo e o início da tag fluorescente.</li>
	<li>Incorpore esses mesmos locais de restrição em ambos os lados da tag fluorescente por PCR (ver Figura 1c).</li>
	<li>Clone o fragmento sintetizado no vetor TDS.</li>
	<li>Clone a tag fluorescente no vetor de recombinação resultante usando os locais de restrição entre as regiões do braço esquerdo e direito da homologia (ver Figura 1d).</li>
</ol>2. Geração de vírus recombinantes
<ol><li>De acordo com a Figura 2,infecte uma monocamada de células BS-C-1 com vírus de vaccinia em mídia livre de soro em uma Multiplicidade de Infecção (MOI) > 1.</li>
	<li>1 hora pós-infecção, células de resgate com O Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco e transfecção com uma mistura de plasmídeo vetorial de recombinação e reagente transfecção em uma proporção de 3:1 em mídia livre de soro.</li>
	<li>Após 24 horas, raspe e recupere células no DMEM sem soro bovino fetal (FBS) e realize três ciclos de congelamento para quebrar células abertas e liberar partículas de vírus.</li>
	<li>Realize um ensaio de placa com uma sobreposição líquida de 10% FBS DMEM e reagentes de seleção GPT ácido micfenólico (25 μg/ml) e xanthine (250 μg/ml) da seguinte forma:<ol>
<li>Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.</li>
		<li>Infecte moncamas celulares 100% confluentes com diluições seriais das células congelantes contendo partículas de vírus para garantir a separação adequada de placas individuais.</li>
		<li>Sobreposição com FBS líquido 10% contendo DMEM contendo os reagentes de seleção GPT - ácido mycofenólico e xanthine nas concentrações finais de 25 μg/ml e 250 μg/ml, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Após uma incubação de 24 horas, remova a sobreposição líquida e use um microscópio fluorescente para procurar placas que expuseram fluorescência vermelha difusa correspondente à incorporação de mCherry do vetor TDS no vírus. Dependendo do gene alvo e da tag fluorescente escolhida, a fluorescência localizada do gene marcado também pode ser observada na mesma placa vermelha.</li>
	<li>Escolha várias placas para cada vírus recombinante por raspagem localizada com uma ponta de pipeta e 100 μl de 5% de FBS contendo DMEM para transferir células para um tubo Eppendorf, seguido por três rodadas de congelamento de células raspadas para liberar vírus recombinantes.</li>
	<li>Adicione o DMEM contendo vírus descongelado por congelamento a uma monocamada de células em uma placa de 12 poços para amplificar vírus recombinantes com reagentes de seleção de GPT na mídia de crescimento. Raspe amplificações bem sucedidas 24 horas após a infecção.</li>
	<li>Realize um ensaio de placas com sucesso amplificadas exibindo fluorescência vermelha, desta vez com uma sobreposição de ágarose e seleção gpt, da seguinte forma:<ol>
<li>Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.</li>
		<li>Realize uma diluição serial dos vírus recombinantes e infecte poços com uma diluição crescente de vírus no DMEM livre de FBS.</li>
		<li>1 hora pós-infecção, remova a mídia líquida e sobreponha cada poço com 0,5% de agarose em meio essencial mínimo (MEM) contendo 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamina, 100 penicilina U/ml e 100 μg/ml estreptomicina, juntamente com os reagentes de seleção GPT.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 dias após a infecção, escolha placas exibindo fluorescência que é tanto vermelha quanto a cor da tag fluorescente escolhida para amplificar novamente, desta vez sem seleção gpt.</li>
	<li>Realize o próximo ensaio da placa com uma sobreposição de agarose sem seleção.</li>
	<li>Escolha placas que perderam sua fluorescência vermelha difusa, mas mantenham a fluorescência localizada correspondente à tag de escolha.</li>
	<li>Continue a purificar a placa sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que perderam os genes de seleção mCherry e gpt, mas mantêm a fluorescência localizada correspondente à tag escolhida. Os estoques de verificação são puros por ensaio de placa, todas as placas devem ter um fenótipo de placa semelhante.</li>
	<li>Use a triagem PCR de DNA genômico para garantir que os estoques virais sejam puros.<ol>
<li>Projete primers que flanqueiam o local de inserção de genes fluorescentes e primers que amplificam o próprio gene fluorescente inserido. Diferentes combinações desses primers produzirão amplicons PCR que detectarão a inserção genética e indicarão pureza.</li>
		<li>Amplie as ações virais para serem rastreadas em um poço de uma monocamada de placa de 12 poços de células BS-C-1.</li>
		<li>24 horas após a infecção, raspe as células infectadas em 250 μl de DMEM.</li>
		<li>Centrífugas infectadas (18.000 x g por 10 min, 4 °C), removem pelotas de células supernascidas e resusgaspendas em 500 μl TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8) com 0,1% (v/v) SDS. Vórtice para células de lise.</li>
		<li>Adicione 500 μl de fenol-clorofórmio-isoamil acohol, inverter para misturar. Centrífuga (18.000 x g para 4 min, 4 °C). Pegue o supernatante e repita.</li>
		<li>Realize uma precipitação de etanol no supernasal adicionando 1 ml 100% etanol (refrigerado) e acetato de sódio de 50 μl, inverter para misturar.</li>
		<li>Deixe a -20 °C durante a noite ou -80 °C por 1 hora. Centrífuga (18.000 x g por 30 min, 4 °C), remova todo o líquido e permita que o DNA precipitado seque. Resuspend em 50 μl TE.</li>
		<li>Use isso como um modelo para a triagem genômica de DNA PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Geração de vírus recombinantes carregando mais de uma tag
<ol><li>Coinfecte a mesma monocamada celular com vírus recombinantes fluorescentes para criar vírus duplos ou triplos ou repetir o procedimento do Protocolo 1) com uma tag diferente.</li>
	<li>Purificar vírus com base no fenótipo de placa ou na triagem pcr do DNA genômico do vírus isolado.</li>
</ol>

<ol>
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Nenhum conflito de interesses declarado.

Esta técnica descreve um protocolo eficiente e modular para a criação de vírus recombinantes que expressam proteínas virais marcadas fluorescentemente. O método garante que a única mudança no genoma viral é a adição de uma tag ou marcador, deixando para trás nenhum marcador de seleção. O curto comprimento do braço necessário para a recombinação homólogoa permite sua síntese direta, eliminando várias rodadas demoradas de PCR e clonagem, enquanto a fluorescência de mCherry e seleção de GPT metabólico são usadas para isolar intermediários de recombinação viral. Esses intermediários podem ser resolvidos, após a remoção da seleção, para um vírus com um gene marcado ou de volta ao tipo parental. Método semelhante envolvendo o uso de seleção fluorescente e metabólica foi descrito anteriormente27, embora o método utilizado neste estudo utilize regiões mais curtas e sintetizadas da homologia, permitindo a identificação do vírus recombinante desejado por meio da imagem da fluorescência do gene de interesse marcado. Esta seleção secundária só é aplicável para marcar genes virais altamente expressos que produzem fluorescência suficiente em um ensaio de placa. Alternativamente, pode-se imaginar a inserção de um de expressão completa, por exemplo, uma proteína fluorescente sob um forte promotor viral. Neste caso, os braços esquerdo e direito definiriam o ponto de inserção em vez do gene viral a ser marcado.
Existem algumas etapas-chave que se mostraram úteis durante o procedimento experimental. A sobreposição líquida na etapa 2.3.3 descrita acima mostrou-se crucial para a detecção e isolamento de placas fluorescentes vermelhas/verdes. Acreditamos que a combinação dos reagentes de seleção de GPT e a sobreposição de agarose dissuadiu o crescimento de vírus recombinantes e, portanto, mudou para uma sobreposição líquida para o primeiro passo de amplificação de vírus após a transfecção. Também é importante escolher placas fluorescentes mostrando fluorescência de cores localizadas para enriquecimento e purificação, pois intermediários resultantes da recombinação do braço esquerdo podem resultar em fluorescência difusa observada em placas se o braço esquerdo também contiver uma sequência de promotores. O gene marcador mCherry no vetor TDS também pode ser substituído por gfp, por exemplo, para permitir a fácil incorporação e seleção de mCherry como uma tag fluorescente.
Algumas técnicas descritas acima variam ligeiramente de métodos estabelecidos de criação do vírus da vaccinia recombinante. Por exemplo, o MOI do vírus usado para criar recombinantes é normalmente inferior a128, no entanto, o uso de MOIs mais elevados tem sido suficiente para a criação de vírus recombinantes de vaccinia por este método. O uso de reagentes de seleção de GPT normalmente requer a pré-insubtação das células com reagentes de seleção18,porém adicioná-los durante a fase de resgate pós-infecção ainda forneceu seleção suficiente de recombinantes desejados, particularmente devido à presença de um marcador de seleção fluorescente também.
Como mencionado anteriormente, uma das limitações dessa técnica é que a etapa de seleção de fluorescência secundária depende da proteína marcada de interesse ser altamente expressa, em um nível que permite sua detecção de olho em um ensaio de placa. Sem isso, seria possível purificar vírus que apenas exibiam fluorescência mCherry, dos quais pelo menos 50% conteriam os vírus recombinantes desejados, que poderiam ser identificados por estratégias moleculares como a PCR descrita na etapa 2.12 acima. Outra limitação pode ser a inativação de certas proteínas como resultado de sua marcação. A tag fluorescente pode sofrer mutações ou ser excisada pelo vírus recombinante com a passagem ao longo do tempo. Portanto, recomenda-se a amostragem regular de estoques de vírus recombinantes por microscopia e PCR. Finalmente, pode haver um limite para o número de proteínas fluorescentes marcadas que podem ser incorporadas em um único vírus. Um aspecto disso é a capacidade de visualizá-los simultaneamente; dada a natureza sobreposta dos espectros de emissões das etiquetas fluorescentes disponíveis, é importante selecioná-las cuidadosamente para garantir o sangramento espectral mínimo. Além disso, o uso de tags intimamente relacionadas, como GFP e Cerulean, abre a possibilidade de recombinação entre os dois, dependendo de suas localizações no genoma recombinante.
A natureza modular desta técnica permite a simples substituição de tags fluorescentes com base na compatibilidade com outras opções de coloração e/ou tag. Ao extirer marcadores selecionáveis, o método TDS permite a adição serial de várias proteínas fluorescentes ou a combinação de marcação baseada em TDS com exclusões genéticas baseadas em TDS para análises fenotípicas29. Como exemplo para a utilidade dessa abordagem, foi gerado um vírus fluorescente de marca dupla que rotula núcleos de vírus e a membrana WV. Estudos de imagem com esse vírus podem ser usados para estudar movimento, morfogênese e embrulho de vírus durante a replicação do vírus. Ainda não caracterizadas, as proteínas virais de vacina também podem ser marcadas e estudadas por essa técnica.
O vírus da vaccinia tem sido amplamente utilizado em estudos de imagem devido a muitas características do vírus que são favoráveis à microscopia de células vivas. As etiquetas fluorescentes são expressas a partir do genoma viral, eliminando a necessidade de transfecção, permitindo que células primárias derivadas de animais infectados ou células não transmissíveis sejam facilmente analisadas. Inicialmente, foram utilizados VACVs fluorescentes para rastreamento subcelular simples do movimento do vírus30, mas abordagens mais recentes expandiram sua utilidade para incluir estudos FRET31, FRAP em partículas de vírus únicos32,repórterespromotores 33,imagens intravitais34e estudos estruturais35-37. Todas essas técnicas poderiam estar cada vez mais próximas, juntamente com este método de criação de vírus fluorescentes recombinantes.

O vírus da vaccinia (VACV) é o varívido prototípico e altamente relacionado ao vírus variola, o agente causador da varíola. Ambos os vírus são membros do gênero ortopéxi que inclui outros patógenos notáveis, como o macacopox e o vírus ectromélia (mousepox)1. Ortooxivírus têm grandes genomas de DNA de dupla vertente (180-220 kb) que codificam acima de 200 quadros de leitura aberto previstos2,3. A replicação desses vírus envolve a formação de uma fábrica de vírus perinucleares, onde são feitos vírus maduros (MV), e a rede trans-Golgi, onde um subconjunto de MV adquire duas membranas adicionais para gerar vírus embrulhados (WV) (revisados por Roberts e Smith4). Os genomas ortoxixos são altamente favoráveis à manipulação genética devido ao alto grau de recombinação genética que é uma característica da replicação do genoma VACV e é mediado pela polimerase de DNA viral5. A geração de vírus recombinantes baseia-se na recombinação homóloga e moléculas de DNA lineares com homólogos de até 12 bps sendo suficientes para mediar a recombinação em células infectadas pelo vírus da vaccinia6. A rotulagem fluorescente do vírus da vaccinia pode produzir partículas de vírus extremamente brilhantes devido ao grande tamanho das partículas de ortopócio, o que permite a incorporação de muitas proteínas fluorescentes por virion7. A vaccinia tem a capacidade de transportar grandes fragmentos de DNA estrangeiro8 e, além disso, a falta de simetria rígida de capsídeos pode permitir um grau de flexibilidade ao expressar fusões genéticas de proteínas virais de seu loci endógeno9. A marcação fluorescente das proteínas VACV tem se mostrado inestimável para o estudo das interações hospedeiro-patógeno no nível subcelular, particularmente no campo da entrada do vírus10, transporte11-13, e morfogênese, particularmente de virions embrulhados7.
Os vírus recombinantes podem ser selecionados pelo resgate de um fenótipo de crescimento atenuado14,15, seleção metabólica16-18, ou pela expressão de um gene marcador (por exemplo, X-gal19 ou proteína fluorescente13,20). Aqui descrevemos a seleção de vírus fluorescentes usando uma poderosa combinação de seleção fluorescente e metabólica. Os vetores de seleção dominante transitória (TDS), desenvolvidos por Faulkner e Moss (1990)21,permitem que os marcadores sejam integrados juntamente com o gene de interesse fluorescente desejado. Quando a seleção metabólica é removida, pode ocorrer um evento secundário de recombinação que excise os genes de seleção, mas deixa a proteína do vírus fluorescente intacta. A Figura 2 abaixo fornece uma visão geral do procedimento experimental. Os genes de seleção utilizados neste estudo são o gene mCherry e o gene Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase(gpt),ambos expressos de um promotor viral sintético precoce/tardio e utilizado anteriormente por Cordeiro et al. 22 Além disso, há fluorescência da proteína de fusão marcada de interesse. Quando a seleção metabólica é removida, os marcadores selecionáveis(mCherry e gpt) são extirpados, restando apenas a fluorescência do gene marcado, que permite a identificação dos vírus recombinantes corretos. A excisão dos marcadores de seleção oferece a possibilidade de combinar múltiplas tags fluorescentes, permitindo-nos criar vírus com a capacidade de rotular fluorescentemente várias proteínas virais simultaneamente. Estudos anteriores determinaram os requisitos mínimos de homologia para a recombinação da vaccinia de moléculas de DNA lineares e circulares transfectadas em células infectadas pelo vírus da vaccinia6. Queríamos determinar a eficiência de recombinação de diferentes comprimentos de ritologia de braços flanqueados no vetor GPT-mCherry TDS através de sua incorporação ao genoma viral da vaccinia. Foi determinado que regiões homólogas de 100 bp no vetor TDS são suficientes para atingir e mediar a inserção de DNA recombinante no genoma vacv por recombinação hologous(Figura 4). Enquanto comprimentos de emologia menores também permitiriam a recombinação, os comprimentos de 100 bp de homologia forneceram vírus recombinantes suficientes que poderiam ser facilmente identificados com a seleção metabólica e fluorescente. Fragmentos de DNA deste tamanho podem ser sintetizados comercialmente a um custo relativamente baixo e facilita muito a produção de múltiplos vetores para a criação de vírus recombinantes. Optamos por aumentar o comprimento da homologia para 150 bp para proporcionar maior frequência de recombinação, mantendo os custos de síntese da sequência de oligonucleotídeos de regiões de flanqueamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

A marcação de proteínas virais com proteínas fluorescentes provou ser uma abordagem indispensável para promover nossa compreensão das interações vírus-hospedeiros. O vírus da vaccinia (VACV), a vacina viva usada na erradicação da varíola, é particularmente favorável à microscopia de células vivas fluorescentes devido ao seu grande tamanho de virion e à facilidade com que pode ser projetada no nível do genoma. Informamos aqui um protocolo otimizado para a geração de vírus recombinantes. Foram determinados os requisitos mínimos para recombinação homóloga direcionada durante a replicação da vaccinia, o que permite a simplificação da geração de construções. Isso permitiu que a aliança de seleção dominante transitória (TDS) com um repórter fluorescente e seleção metabólica fornecesse uma abordagem rápida e modular para rotular fluorescentemente proteínas virais. Ao simplificar a geração de vírus recombinantes fluorescentes, somos capazes de facilitar aplicações a jusante, como análise avançada de imagem de muitos aspectos da interação entre vírus-host que ocorre durante a replicação do vírus.

A Figura 1 lista os vários construtos necessários para este procedimento, que são sintetizados(Figuras 1b e 1c) ou criados por etapas de clonagem(Figura 1d). A Figura 2 fornece um esboço do procedimento experimental com imagens representativas de placa fluorescente de um VACV recombinante A3-GFP retratado para cada etapa do processo seletivo. Na Figura 3,vírus recombinantes da vaccinia expressando proteínas marcadas com marcadores fluorescentes direcionados às proteínas estruturais virais A3 e F13, que fazem parte do núcleo do vírus interno23 e envelope externo24, respectivamente,são mostrados. Observações de placas virais e células infectadas para cada um dos vírus recombinantes criados são retratadas. A eficiência da recombinação homóloga de vetores com o genoma VACV, contendo até 70 bp regiões de homologia, foi testada e os resultados são retratados na Figura 4. O relativo sucesso da identificação de placas virais feitas a partir da recombinação com vetores contendo 100 bp de homologia foi o raciocínio por trás da escolha de sintetizar 150 bp de comprimento braços esquerdo e direito da homologia ao gene alvo.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Figura 1. Vetor de recombinação transitória (TDS). (a) Vetor TDS com marcadores de seleção gpt e mCherry. (b) Os braços esquerdo e direito da homologia são projetados com locais de restrição específicos entre e flanqueando os braços da homologia. Os locais de restrição entre os braços esquerdo e direito utilizados neste método foram NotI e BamHI, o site NotI também sendo usado como um linker entre o gene e a tag fluorescente. (c) As tags fluorescentes compatíveis com este método são flanqueadas por locais de restrição correspondentes. Algumas tags empregadas são GFP (proteína fluorescente verde), RFP (proteína fluorescente vermelha), Cerulean (uma melhoria no ECFP, uma proteína fluorescente ciano, por mutagênese25) e mini-SOG, uma proteína fluorescente projetada a partir de GFP que cria um produto solucionável pela EM na iluminação26. dEtapas de clonagem envolvidas na geração do vetor final de recombinação TDS. O oligonucleotídeo sintetizado contendo os braços de flanco esquerdo e direito é primeiro clonado no vetor TDS. Isso fornece um vetor de recombinação no qual qualquer tag de escolha pode ser transportada para dentro e para fora, clonando nos locais de restrição incorporados entre os braços esquerdo e direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Figura 2. Esboço do procedimento experimental para criar um vírus de vaccinia recombinante. Eventos ocorridos nos níveis genético e celular são retratados, juntamente com imagens representativas de placas delineando os passos após a criação de um vírus de vaccinia fluorescente rotulado a3-GFP. (A) As células infectadas com o vírus da vaccinia são transfeinadas com o vetor de recombinação TDS. (B) Nesta figura, apenas o resultado da recombinação da mão esquerda é retratado e o exemplo usa GFP como a tag fluorescente de escolha. A recombinação da mão direita resultaria em todo o plasmídeo TDS sendo incorporado ao genoma de forma semelhante, exceto que a tag seria fundida a todo o gene alvo na etapa intermediária, ou seja, passo C. Um ensaio de placa é realizado em uma monocamada celular com a mistura de recombinação e submetido à seleção gpt. (C) Placas que exibem fluorescência vermelha e verde, correspondentes à expressão mCherry e GFP, respectivamente, são colhidas e amplificadas. Uma vez removida a seleção, haverá perda de fluorescência vermelha correspondente à perda dos genes gpt e mCherry (D)e placas que exibem fluorescência exclusivamente verde são colhidas e amplificadas(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Figura 3. Resultados representativos do sistema de recombinação TDS. As imagens mostram placas inteiras de VACV recombinante infectando células após 48 horas (a, c, e; barra de escala 100 μm), acompanhadas por uma imagem de uma única célula infectada pelo vírus recombinante correspondente após 8 horas (b, d, f; barra de escala 10 μm). Genes correspondentes a proteínas localizadas em virion foram selecionados para visualizar partículas de vírus. A3 é uma proteína central da vaccinia virion (a, b) e F13 (c, d) é uma proteína envelope viral. Um vírus de marca dupla com ambos fluorescente rotulados A3 e F13 (e, f) também é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Figura 4. Análise quantitativa das eficiências de recombinação entre vetores recombinantes e o genoma VACV. As monocamadas BS-C-1 foram infectadas com VACV e transfeinadas de 1 hora pós-infecção com três vetores de recombinação contendo regiões de homologia de 500 bp, 100 bp ou 70 bp para o genoma do VACV. Cada vetor também continha o TDS composto por genes de seleção gpt e mCherry. As células foram recuperadas 24 horas após a infecção e liberadas para a liberação dos vírus recombinantes formados. Ensaios de placa foram realizados em lises celulares com mídia de seleção de GPT e placas mostrando fluorescência mCherry foram contados como recombinantes bem sucedidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Figura 5. Mapa do vetor GPT-mCherry TDS mostrando o local de clonagem múltipla. O vetor foi descrito anteriormente22 e o mapa vetorial foi criado com a ajuda do EZ Plasmid Map v1.9 do Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.

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Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Um protocolo rápido e modular para a geração de vírus recombinantes de vaccinia expressando proteínas fluorescentes marcadas simultaneamente usando o método de seleção dominante transitória é descrito aqui.

Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K visualizações.  University of Sydney. Um protocolo rápido e modular para a geração de vírus recombinantes de vaccinia expressando proteínas fluorescentes marcadas simultaneamente usando o método de seleção dominante transitória é descrito aqui.

Vídeo: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...