Nosso método usa seleção de intervalo de hospedeiro e marcadores fluorescentes para a geração eficiente e perfeita do vírus da vacina recombinante em uma variedade de tipos de células. Esta técnica combina a velocidade da recombinação homóloga com a natureza sem cicatrizes da seleção dominante transitória. Além disso, hospedamos a seleção de intervalo para eliminar a possibilidade de alterações quimicamente induzidas.
Este método também pode ser usado para modificar o vírus da vaccinia ou outros vírus da varíola para expressar genes estrangeiros, por exemplo, para gerar vacinas. Se você está executando este protocolo apenas com seleção de fluorescência, você deve garantir que você está rastreando vírus suficientes para detectar um recombinante relativamente raro sem pressão seletiva PKR. Este método se baseia no ganho e perda de marcadores fluorescentes para selecionar com sucesso vírus que adquiriram as fitas de recombinação e para detectar vírus que têm recombinado sem cicatrizes.
Para gerar um vetor de recombinação, adicione primeiro 17 microliters de água livre DNase, 1,2 microliters de cada primer, cinco microliters de 5x pcr tampão de reação, DNA de modelo e 0,5 microliters de polimerase de DNA a um tubo PCR por amplicon. Adicione água livre de DNase adicional para trazer o volume final em cada tubo para 50 microliters. E coloque os tubos em um termociclador.
Derreta o DNA a 98 graus Celsius por 30 segundos antes de usar 25 cartuchos de um protocolo PCR de três etapas, conforme indicado. Para visualizar os produtos de amplificação em um gel de 1% de agarose, adicione 10 microlitros de cada produto de DNA e 2 microlitros de tampão de carga para cada poço. Execute o gel por uma hora a oito volts por centímetro.
No final da corrida, use um kit de extração de gel de DNA de acordo com o protocolo do fabricante para purificar cada amplicon. Elute os amputados da coluna com 50 microliters de dNase água livre e centrifugação imediata. Para linearizar um vetor de clonagem, primeiro adicione um micrograma do vetor, 17 microliters de água livre de DNase, 2 microliters de tampão de reação e 1 microliter de EcoRI a um tubo para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius.
Ao final da incubação, adicione 0,2 picomoles do vetor linearizado 10 microliters de água livre DNase, e 10 microliters de montagem de DNA misturam-se a cada amplicon isolado. Incubar amostras a 50 graus Celsius por uma hora. Ao final da incubação, transforme e.coli quimicamente competente com dois microliters do produto montado de acordo com os protocolos padrão.
Placa 100 microliters de células transformadas em placas de agarose LB suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicillina. Após a incubação durante a noite a 37 graus Celsius, selecione colônias bem isoladas para inoculação no caldo luria complementada com 100 microgramas por mililitro de ampicilina durante a noite a 37 graus Celsius e 225 revoluções por minuto. Na manhã seguinte, use um kit de miniprep plasmídeo para isolar os plasmídeos.
E verifique a concentração e pureza do DNA em um espectotômetro. Para a geração de vírus recombinantes, infecte uma monocamada confluente de células adequadas com o vírus a ser recombinado em uma multiplicidade de infecção de um em uma placa de seis poços. E incubar as células infectadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora.
No final da incubação, substitua o supernaente em cada poço por DMEM fresco e use um reagente de transfecção comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione três microgramas do vetor de recombinação de interesse a cada poço. Coloque a placa na incubadora por mais 48 horas.
Antes de agrupar as células de cada condição de transfecção em tubos individuais de 1,5 mililitros. Em seguida, congele as células agrupadas três vezes antes de sonicar os lises resultantes por 15 segundos a uma amplitude de 50%. Em seguida, diluir em série 10 vezes o liseto sônico, colhido de um 10 para o primeiro ao 10 para o sexto concentração em DMEM fresco e adicionar um mililitro de cada diluição a poços confluentes individuais de uma linha celular competente proteína quinase R.
Coloque as células na incubadora de cultura celular por uma hora antes de substituir os supernantes por meio fresco e devolver as células à incubadora de cultura celular. Após 24 a 48 horas, identifique os vírus recombinantes por microscopia de fluorescência. Placas de vírus recombinantes expressam fluorescência vermelha devido à integração do gene de fusão mCherry-E3L.
A placa purifica os vírus recombinantes três vezes em células RK13 tipo selvagem. Após três rodadas de purificação da placa, infecte células RK13+E3L+K3L com diluições seriais do lysate da placa. Para identificar os vírus colapsados, por microscopia de fluorescência utilizando um sistema de imagem adequado equipado com cubos de filtro GFP e RFP.
Em seguida, a placa purificar placas VC-R4 apenas verde ou incolor três vezes nas células RK13+E3L+K3L. Garantindo que não haja placas fluoresce vermelhas. Infecte as células com pelo menos 100 unidades formadoras de placas para aumentar suas chances de identificar uma placa incolor.
Em casos raros, podem ser necessárias várias rodadas de infecção. Placas fluorescentes vermelhas em proteínas quinase R células RK13 competentes são indicativas de expressão viral de mCherry-E3L. E placas ou placas incolores expressando apenas eGFP em células RK13+E3L+K3L confirmam o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L.
O vírus recombinante VC-R4, que não possui ambos os antagonistas da proteína quinase R não podem se replicar em proteínas quinase R células RK13 competentes enquanto o vírus aparente VP872, que expressa E3L é competente para a replicação. Para confirmar que essa incapacidade de se replicar em células RK13 foi apenas devido à perda de E3L, o GFP aprimorado foi substituído por E3L no vírus VC-R4. Gerou um vírus relevante usando o mesmo protocolo de seleção.
Curiosamente, ao fazer esse vírus, placas incolores consistentes com o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L foram identificadas antes da seleção em células RK13+E3L+K3L que são geralmente necessárias para selecionar recombinantes sem cicatrizes. Provavelmente devido à sequência estendida entre o de recombinação mCherry-E3L e o gene E3L sendo inserido no VC-R4. Em média, 12,6% dos virions progêneres foram submetidos à recombinação com o plasmídeo transfectado, semelhante às frequências relatadas anteriormente.
Aqui, mostra-se a frequência de placas incolores em relação às placas totais RK13+E3L+K3L, demonstrando que a taxa de colapso e a perda do marcador de seleção mCherry-E3L ocorreram em aproximadamente 1,8%. No primeiro estágio, o uso de células competentes PKR garante que todas as placas com vírus recombinante contido. No segundo estágio, o uso de células deficientes PKR permite a detecção de vírus recombinantes com um lócus de colapso mCherry-E3L.
Essa abordagem nos permite gerar rapidamente vírus contendo genes exógenos, por exemplo, para a produção de vacinas oferecer a expressão de diferentes antagonistas virais do PKR. para facilitar a análise de interações específicas de espécies com PKR de vários hospedeiros.
