Agradecemos Melissa Griffin e Jenna Rozacky para seu especialista em cuidados de peixe. PDM graças EGN para escrever assistência, generosidade e paciência. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01DE020884 para JKE.

1. Pecuária e Mutant alelos <ol><li> Levantar e produzir peixe-zebra como descrito 21. </li><li> Alelos mutantes Zebrafish utilizados neste estudo foram PDGFRA b1059 16, B1100 smad5 22, e b577 smo 23. Fontes para essas cepas zebrafish incluem Zirc. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e Implementos Nota: Todas as soluções e as ferramentas podem ser feitas com antecedência e armazenado para uso futuro. <ol><li> Adicione mídia embrião (EM) como descrito anteriormente 21. </li><li> Adicione 4 g / L de MS-222 (tricaina). Dissolve-se 4 g de fosfato dissódico (Na 2 HPO 4) em 450 ml de água estéril. Adicionar 2 g MS-222 à solução. Ajustar o pH para dentro de 7,0-7,2. Adicionar água estéril para um volume total de 500 ml. </li><li> Opcional: Faça 4 g / L de óleo de cravo. Pesar 0,2 g óleo de cravo puro em um tubo de 50 ml. Adicionar EM para um volume total de 50 ml. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Faça 3% methylcellulosi. Traga 50 ml de EM + 0,1 M HEPES para ferver. Retire do fogo. Misture em 1,5 g de metilcelulose até que a solução é homogênea. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione 0,2% de agarose. Adicionar 0,1 g de agarose com 50 ml de EM. Traga EM para ferver no microondas ou numa placa de aquecimento e verifique se a agarose se dissolva. Alíquota em 500 volumes ul em tubos de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C. Nota: Os volumes podem ser ajustados conforme necessário. </li><li> Faça pokers capilares. Coloque uma gota de super-cola dentro de um tubo capilar 0,9 milímetros ID. Inserir um comprimento de 4-5 cm de 6 £ de teste de linha de pesca monofilamento no interior do tubo capilar de tal modo que, aproximadamente, 3-4 mm de linha estende-se para além da extremidade do tubo. </li><li> Faça duas lamelas em ponte por espécime. Super-cola 22 x 22-1 tampa de vidro em cada extremidade de uma tampa de vidro de 24 x 60-1 deixando o meio livre. Faça singles (1 pequena tampa de vidro por fim) para os embriões com menos de um dia de idade, duplos (dois copos pequenos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para os embriões de um a quatro days de idade, ou triplos (três pequenos copos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para embriões cinco dias ou mais. </li><li> Encha uma seringa de 10 ml, com alta graxa de vácuo. Nota: Vácuo graxa serve como um vedante para evitar a desidratação de espécimes durante longos períodos de tempo, e tem um baixo potencial de toxicidade em comparação com os selantes mais voláteis. </li></ol> 3. Montagem embriões Zebrafish por microscopia confocal (veja a Figura 1) <ol><li> Prepare médio anestésico. Derreter-se uma alíquota de 0,2% de agarose por microondas em intervalos de 20 seg até completamente líquido. Misturar 8 ul de MS-222 em 192 uL de 0,2% de agarose ou 5 ul de 4 g / L de óleo de cravo em 195 ul de 0,2% de agarose. Manter em um bloco de aquecimento de 42 ° C. Nota: A exposição longa a MS-222 provoca atrasos de desenvolvimento mais fortes do que o óleo de cravo faz no peixe-zebra embrionária 24. </li><li> Se necessário: dechorionate manualmente embriões transgénicos não eclodidos para ser analisada imediatamente antes da análise. Utilizando uma pinça, lentamente tear o córion aberto até o embrião é liberado. </li><li> Anestesiar os embriões de peixe-zebra. Adicionar 1 ml de uma unidade de 4 g / L de MS-222-24 ml de meio de embrião. Alternativamente, adicione 390 mL de 4 g / L de óleo de cravo a 24 ml de água de peixe 24. Nota: atos óleo de cravo lentamente para realizar esta etapa, pelo menos, 15-20 minutos antes de microscopia de lapso de tempo. </li><li> Coloque uma gota de graxa de vácuo em torno do espaço centro de uma lamela de ponte para cima virada. Empurrar lentamente a gordura vácuo para fora da seringa, fazendo com que um talão suave, contínua, que é adjacente e no interior das pontes e a extremidade da lamela. </li><li> Espalhe um círculo de 4% de metilcelulose em meio da lamela em ponte usando um aplicador de madeira. </li><li> Transferência do embrião a ser trabalhada. Quando o embrião é anestesiado desenhar-lo em uma pipeta de vidro. Manter a pipeta-se verticalmente para permitir que o embrião se afundam para o fundo do líquido na pipeta. Mover a pipeta para dentro da solução de agarose e permitir que o embrião a cairem que a agarose. Não expulsar o líquido. </li><li> Colocar a amostra. Desenhar uma solução de agarose e o embrião para a pipeta. Expelir o embrião de uma gota da solução de agarose no topo da metilcelulose. Use um atiçador capilar para empurrar o embrião para baixo na metilcelulose e orientar o embrião como desejado para a imagem latente. </li><li> Selar o espécime. <ol><li> Coloque uma lamela em ponte na parte superior da montagem de um, virado para baixo. Aplique pressão uniforme para ambos os lados das lamelas imprensado até as pontes fazer contato direto e os selos gota de agarose a ambos lamelas. Verifique se o embrião está orientado corretamente. </li><li> Esfregue um aplicador de madeira ao longo do vidro para suavizar rachaduras e falhas no talão de graxa de vácuo. Limpe o excesso de graxa das bordas. </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse confocal de Transgênicos Zebrafish embriões (Este protocolo foi otimizado para uma Zeiss LSM 710 microscópio confocal nosing software de imagem ZEN, e pode ser modificado para ser utilizado com outros sistemas.) <ol><li> Ative equipamento. Ligue o microscópio confocal a laser e todos os dispositivos externos. Ligue o computador conectado ao microscópio confocal. Abra o software de imagem confocal e selecione &quot;Sistema Start&quot; para ativar os controles de aquisição de imagem. </li><li> Prepare palco aquecida. Abaixe a plataforma de teste do microscópio confocal e mover as lentes objetivas fora de posição. Substitua o estágio padrão com uma fase aquecida eletrônico. Ligue o controlador para a fase aquecida e ajustar a temperatura para 29,5 ° C. </li><li> Coloque a amostra no campo de visão. Coloque as amostras montadas no palco. Mova a lente objetiva de 20X para a posição e elevar a plataforma de teste. Ative o emissor de luz visível e olhar através das oculares. Centralize a cabeça do embrião no campo de visão. </li><li> Definir configurações da experiência. <ol><li> Ative canais de fluorescência, selecionandoo comprimento de onda fluorescente para ser detectado e escolher tabelas de pesquisa de cores (LUT) para cada canal. Se necessário, use os controles manuais no software para ligar os lasers necessárias (por exemplo, 561 nm para RFP). Para cada canal de fluorescência, a intensidade do laser definido para 10,0 e a voltagem do fotomultiplicador (HV ou ganho) entre 600-700. Defina a média a 4 e a profundidade de bits para 16 bits. </li><li> Ative os módulos da série Z-stack e time. Defina o pinhole para uma resolução Z-5 mm ou menor, e definir o Z-intervalo para a distância ideal sugerido. Nota: Geralmente, 5 mm Z-resolução permite que cada imagem Z-stack a recolher rapidamente o suficiente para um &quot;instantâneo&quot; do embrião em um ponto de tempo específico e ao mesmo tempo resolver células individuais. Baixando a média também reduz a quantidade de tempo por imagem. </li><li> Definir o intervalo de tempo desejado entre imagens (geralmente 10-20 minutos) e o comprimento total do experimento. </li></ol></li><li> Definir posicionalinformações. <ol><li> Ligue a câmera para o modo de viver. Ajuste o foco e aumentar a intensidade do laser se necessário, para ver a fluorescência. Defina o zoom digital de 0,6 para uma visão mais ampla, se desejar. </li><li> Posicione o palco de tal forma que todas as estruturas de interesse são visíveis e há espaço no campo de visão para dorsal conseqüência e anteriormente. Concentre-se através do embrião para os limites superiores e inferiores de fluorescência. Defina as primeiras e últimas posições fatia Z-stack, no mínimo, 100 mm ou mais para além destes limites. </li></ol></li><li> Otimizar intensidade de fluorescência. <ol><li> Defina a LUT exibição para variar indicador. Estruturas fluorescentes agora deve aparecer branco, e no resto do campo de visão deve ser azul (sem detecção) ou preto. </li><li> Aumentar HV / ganho para um nível logo abaixo de onde saturada (vermelho) pixels aparecer. Se necessário, ajuste compensar assim a maior parte do fundo não é detectado (azul). Nota: diâmetro pinhole menor e aumento da intensidade do laser, tanto melhorar a imagem defrial, mas a intensidade do laser deve ser mantida baixa para preservar os tecidos vivos. Aumento HV / ganho e diâmetro do furo de pino (&lt;5 mm) são geralmente preferidas para o aumento da intensidade do laser. </li><li> Mantenha o diâmetro pinhole grande o suficiente para coletar imagens em tempo hábil, com média de sets a 4. O intervalo de-Z deve sempre ser definida para a distância ideal sugerido para o diâmetro pinhole. Realizar exames de curta duração (média = 1) com configurações diferentes, e usar a intensidade mínima de laser que atinge resolução desejada. </li></ol></li><li> Executar o experimento para o período de tempo desejado. Depois, retire do embrião a partir da fase aquecida e lentamente separar as lamelas. Mergulhe a lamela e embrião em EM em um 30 milímetros placa de Petri. Usando uma pipeta de vidro lavar cuidadosamente o embrião fora da lamela e remover as lamelas da placa de Petri. Coloque o embrião para uma incubadora de 28,5 ° C para continuar a desenvolver-se. </li><li> Comparar crescimento. No fim do experimento, tomar Zs indivíduotack imagens de embriões irmão montado na agarose que foram similarmente encenadas para a amostra no início da experiência, mas foram levantadas em EM numa incubadora 28,5 ° C. </li><li> Meça arcos faríngeos, conforme necessário. As medições podem ser realizadas em alguns conjuntos de software confocal. Medidas encontrados aqui foram realizadas utilizando Fiji25 importando e Z-projetando arquivos. LSM de quadros individuais. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Microscopia confocal Time-lapse é uma ferramenta poderosa para a análise do desenvolvimento. Aqui, nós demonstramos a utilidade do método no estudo da faringe arco morfogênese no peixe-zebra, que são mutantes por vias de sinalização importantes usando um transgênico que rotula células da crista neural. Além do nível de tecido análises, análises de lapso de tempo também são aplicáveis ​​para análises de uma escala celular 28. Muitos métodos de peixe-zebra amplamente utilizados também po...

Morfogênese craniofacial é um processo multi-passo complexo que requer interações coordenadas entre vários tipos de células. A maior parte do esqueleto craniofacial é derivada a partir de células da crista neural, muitas das quais devem migrar a partir do tubo neural dorsal em estruturas transientes chamados arcos faringe 1. Tal como acontece com muitos tecidos, morfogênese do esqueleto craniofacial é mais complicado do que pode ser entendido por imagens estáticas de embriões em pontos específicos de tempo de desenvolvimento. Embora seja para realizar demorado, in vivo, a microscopia de lapso de tempo proporciona uma aparência contínua em células e tecidos de um embrião em desenvolvimento. Cada imagem em uma série de lapso de tempo dá contexto para os outros, e ajuda a um movimento em direção investigador deduzir por que um fenômeno ocorre, em vez de deduzir o que está ocorrendo naquele momento. Na imagem in vivo é, portanto, uma poderosa ferramenta descritiva de abordagens experimentais paradesconstruir os caminhos que guiam morfogênese. O Danio rerio peixe-zebra é um modelo genético popular de desenvolvimento embrionário dos vertebrados, e é particularmente bem adaptado para imagiologia in vivo de morfogénese. Modern, métodos convenientes para transgenia e genômica modificação estão avançando rapidamente o número de ferramentas disponíveis para pesquisadores peixe-zebra. Estas ferramentas de melhorar os métodos já robustos para manipulação genética e microscopia. Imagem in vivo de praticamente qualquer tecido em quase qualquer contexto genético desejado é mais próximo da realidade do que a fantasia. Movimentos morfogenéticos dos arcos faríngeos são guiados por sinalização interações entre a crista neural e do epitélio adjacente, tanto ectoderma e endoderma. Existem inúmeras moléculas sinalizadoras expressas pelo epitélio que são necessários para accionar a morfogénese dos elementos esqueléticos craniofaciais. Entre essas moléculas sinalizadoras, Sonic Hedgehog (Shh) é extremamente importante fou desenvolvimento craniofacial 2-8. Shh é expressa tanto pelo ectoderma oral e faringe endoderme 2,6,9,10. A expressão de Shh em endoderme regula movimentos morfogenéticas dos arcos 10, padronização de crista neural dentro dos arcos 10, e o crescimento do esqueleto craniofacial 11. Bmp sinalização também é extremamente importante para o desenvolvimento craniofacial 12 e pode alterar a morfogênese dos arcos faríngeos. Sinalização Bmp regula dorsal / ventral padronização de crista dentro dos arcos faríngeos 13,14. Rompimento de smad5 em zebrafish provoca graves defeitos palatais e um fracasso das cartilagens de Meckel para fundir de forma adequada na linha média 15. Além disso, os mutantes também exibem reduções e fusão dos elementos de cartilagem ventrais, com o 2 o, 3 o, e, por vezes, os elementos do arco 4 º faringe fundidos na linha média 15. Estas fusões sugerem fortemente que a sinalização BMP dirige a morfogênese destes elementos da faringe. Sinalização PDGF é necessário para o desenvolvimento craniofacial, mas tem papéis desconhecidos em arco faríngeo morfogênese. Ambos rato e mutantes PDGFRA peixe-zebra tem profunda clefting terço médio da face 16-18. Pelo menos, no peixe-zebra este clefting média facial é devido a uma falha de migração de células da crista neural apropriado 16. Células da crista neural continuam a expressar PDGFRA depois de terem entrado os arcos faríngeos. Além disso, os ligandos de PDGF são expressos por epitélios facial e dentro dos arcos da faringe 16,19,20, assim sinalização PDGF pode também desempenhar um papel importante na morfogénese dos arcos da faringe após a migração. No entanto, as análises da morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes PDGFRA não foram realizadas. Aqui, nós demonstramos em microscopia confocal in vivo de pharyngulum estágio zebrafish transgênicos e descrever a morfogênese dos arcos faríngeos dentro deste período. Demonstramos mais comportamentos de tecido que são afetados por mutações que perturbam a BMP, PDGF, e Shh vias de sinalização.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

Imagiologia de lapso de tempo é uma técnica que permite a observação directa do processo de morfogénese, ou a geração de forma. Devido à sua claridade óptica e responsabilidade para com a manipulação genética, o embrião de peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular com a qual para realizar a análise de lapso de tempo de morfogênese em embriões vivos. Imagem confocal de um embrião do peixe-zebra vivos exige que um tecido de interesse é persistentemente marcado com um marcador fluorescente, tal como um transgene ou corante injectado. O processo exige que o embrião é anestesiado e mantido no lugar, de tal maneira que o desenvolvimento prossegue normalmente saudável. Parâmetros para a imagem deve ser ajustado para ter em conta o crescimento tridimensional e para equilibrar as exigências da resolução de células individuais ao obter fotos rápidas de desenvolvimento. Os nossos resultados demonstram a capacidade de executar a longo prazo in vivo de imagens de embriões de peixes-zebra marcados com fluorescência para detectar e comportamentos de tecidos em variadasda crista neural cranial que causam anomalias craniofaciais. Atrasos de desenvolvimento causados ​​pela anestesia e montagem são mínimos, e os embriões são ileso pelo processo. Embriões temporizadoP fotografada pode ser devolvido ao meio líquido e subsequentemente visualizados ou fixado em pontos mais tarde no desenvolvimento. Com um aumento da abundância de linhas de peixes-zebra transgénicos e mapeamento de destino bem caracterizados e as técnicas de transplante, imagiologia qualquer tecido desejado é possível. Como tal, de lapso de tempo em imagem in vivo combina poderosamente com métodos genéticos peixe-zebra, incluindo análises de embriões mutantes e microinjetados.

Em embriões do tipo selvagem, seguindo população crista neural, os arcos da faringe alongar ao longo dos anterior / posterior e dorsal / ventral eixos enquanto se move em uma direção rostral (Filme 1). Aos 30 horas após a fertilização (hpf), a duração anterior / posterior do primeiro arco faríngeo é entre 1,8-1,9 vezes o seu dorsal / altura ventral. Dorsal / alongamento ventral procede de forma constante, mais rápido do que a extensão anterior / posterior até 36,5 hpf. A partir daqui, dor...

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Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K visualizações.  The University of Texas at Austin.  Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes. 

Vídeo: Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D microscopia de levedura

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Analisando a rede de α-Actinin em Cardiomiócitos derivados do iPSC humano usando microscopia de localização de molécula única

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...