Este método rastreia estruturas em células de leveduras em três dimensões ao longo de muitos minutos, permitindo-nos estudar a dinâmica das organelas e compartimentos intracelulares. A imagem 4D garante que podemos tirar conclusões confiáveis sobre a dinâmica intracelular, particularmente para estruturas ou marcadores que podem ser transitórios. Demonstrando o procedimento será Natalie Johnson, uma pós-doutora do meu laboratório.
Comece cultivando uma cultura noturna da variedade de leveduras de interesse em cinco mililitros de sintéticos não fluorescentes definidos, ou NSD, médio, em um frasco de 15 mililitros perplexos com boa aeração, a 23 graus Celsius. Três a quatro horas antes da análise, diluir a cultura de levedura fase logarítmica em meio NSD fresco, de modo que a densidade óptica final em 600 nanômetros, ou OD600, será de 0,5 a 0,8 no momento da imagem. Pelo menos uma hora antes da cultura estar pronta, centrífugue uma alíquota de dois miligramas por mililitro Concanavalin Uma solução por cinco minutos a toda velocidade, para pelotar quaisquer partículas, e adicionar 250 microlitres do supernatante em um prato de microscopia de vidro limpo de 35 milímetros.
Após 15 minutos, lave o prato duas a três vezes com dois mililitros de água destilada por lavagem, adicionando 250 microliters da cultura da levedura ao prato revestido de Concanavalina A depois de seco. Aguarde 10 minutos para permitir que as células aderam, antes de lavar suavemente o prato mais duas ou três vezes com dois mililitros de meio NSD fresco. Em seguida, cubra as células com dois mililitros de NSD fresco.
Para imaginar as células de levedura, selecione uma lente de imersão em óleo 63X com uma abertura numérica de pelo menos 1,4 em um microscópio de luz confocal. Aqui, uma lente objetiva de 100X também pode ser usada em vez de uma lente objetiva 63X. Em seguida, coloque o prato na lente objetiva, manchado com óleo de imersão.
No menu suspenso da guia Modo de Aquisição, selecione xyzt. Sob a aba XY, formata o tamanho do quadro para 256 largura por 128 de altura. Use a velocidade máxima de varredura, que normalmente está na ordem de oito quilohertz.
Ligue a varredura X bidirecional se estiver disponível e ajuste o fator de zoom para nove, o que resultará em um tamanho de pixel de aproximadamente 80 nanômetros. Se um objetivo de 100X for usado, ajuste o fator de zoom de acordo para manter um tamanho de pixel de aproximadamente 80 nanômetros. Em seguida, definir o acúmulo de linha para quatro ou seis.
Coloque o orifício em 1.2 Unidades arejadas e ligue o laser de luz branca, se disponível. Em seguida, defina o comprimento de onda de excitação e porcentagem de potência laser para cada canal de fluorescência. Se estiver disponível, habilite o uso do modo de contagem de fótons na guia de configuração, desmarcando o tempo máximo de integração.
Para cada canal de fluorescência, atribua um detector de alta sensibilidade, defina o intervalo de comprimento de onda de emissão e ligue o modo de contagem de fótons, se disponível. Defina a janela de gating de tempo para 0,6 a 10 nanossegundos para cada canal de fluorescência, para evitar capturar a luz refletida do prato de vidro. Em seguida, adique imagens de campo brilhante e selecione detector de baixa sensibilidade para a coleta de dados.
Ligue o modo de imagem ao vivo e apareçam o ganho no canal de campo brilhante até que as células estejam claramente visíveis. Se no modo de contagem de fótons, altere a faixa de valores cinzas de manual para automático para visualizar o sinal fluorescente. Defina a pilha Z para a imagem de todo o volume de células de levedura e especifique a direcionalidade da imagem de tal forma que para baixo se move em direção ao deslizamento da tampa.
Defina o intervalo de passo Z para 0,25 a 0,35 micrômetros para obter cerca de 20 a 25 seções ópticas por pilha Z e ligue o Galvo Flow se estiver disponível. Para um filme típico, defina o intervalo de tempo entre z-stacks para dois segundos, e definir a duração do filme para cinco a 10 minutos. Em seguida, salve o filme como um arquivo LIF.
Para a desconvolução de filmes, lance um programa de software de desconvolução apropriado que usa o clássico algoritmo de estimativa de probabilidade máxima e abra a série de dados. Selecione o assistente de desconvolução e o editor de parâmetros para confirmar que os parâmetros de imagem são detectados e exibidos corretamente. Altere o valor do índice de refração média de incorporação para 1,4 para aproximar o citoplasma da levedura.
Em seguida, use o editor para estimar a posição de deslizamento de cobertura. Selecione Definir todos verificados e clique em Aceitar e selecione Entrar no assistente. Clique na próxima seta para contornar a seleção da função de spread de ponto e etapas de pré-processamento de corte, e proceda através do assistente de desconvolução para cada canal de fluorescência.
Selecione a função de mapeamento vertical logarítmico de computação e inspecione o perfil de intensidade de fluorescência de dados brutos. Defina manual como o modo para a estimativa de fundo, digite um valor de fundo e clique em Aceitar. Deixe o valor máximo das iterações em 40 e digite uma relação sinal-ruído estimado.
Em seguida, desligue a correção do alvejante e clique em Desconvolver. Selecione Aceitar o próximo canal na janela de resultados de desconvolução, se o ruído for suficientemente removido sem eliminar a fluorescência genuína das estruturas fracas. Uma vez que todos os canais fluorescentes tenham sido satisfatoriamente desconvolvizados, clique em Tudo feito e organize o canal vermelho primeiro, seguido pelos canais de campo verde, azul e brilhante, para posterior edição no ImageJ.
Em seguida, salve a sequência de imagem como um arquivo TIF de oito bits e selecione um arquivo por canal e o estiramento de contraste como o modo de conversão. Para correção de alvejante, importe as sequências de imagens desconvolved em ImageJ e clique em Image, Hyperstacks e Stack to Hyperstack para converter as imagens em um hyperstack. Selecione xyzct no menu suspenso e digite o número de canais, fatias de pilha Z e prazos.
Para corrigir os canais de fluorescência para branqueamento de fotos, selecione Imagem, Cor, Canais Divididos e para canais fluorescentes, selecione Plugins, EMBLtools, Bleach Correction e Exponential Fit. Em seguida, selecione Canais de imagem, cor e mesclagem para mesclar os canais de fluorescência corrigidos por campo brilhante e branqueamento em um hipersedor, e salvar o hipersedor corrigido e desconvolvado para a geração e edição de filme subsequentes como um arquivo TIF de oito bits. Para converter o conjunto de dados corrigidos desconvolved e branqueamento em uma montagem dimensionada, selecione Plugins, IJ_Plugins e Make Montage Series e selecione o hipersedor de oito bits relevante.
Clique em Abrir e OK para aceitar que todas as fatias serão usadas para criar a montagem e clique em OK novamente para aceitar o valor do fator de escala sugerido. Salve a montagem original como um arquivo TIF de oito bits e selecione Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack e OK, para criar um hiperstack 4D da montagem original que inclui todos os prazos. Para gerar o filme original médio projetado, selecione primeiro Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack e OK, para aceitar os parâmetros padrão ZProjection.
Salve o filme projetado médio como um arquivo TIF de oito bits e inspecione o filme para identificar estruturas individuais que podem ser rastreadas durante o período de rotulagem. Identificar uma estrutura que pode ser rastreada de forma confiável durante a duração do filme, e isolar essa estrutura para análise, são as etapas mais críticas do procedimento. Em seguida, siga as instruções no guia do usuário do plugin, para isolar estruturas de interesse editando a montagem.
Crie um hiperseto 4D a partir da montagem editada para o período, incluindo as estruturas de interesse, e salve o hiperseco editado. Para quantificar a intensidade da fluorescência ao longo do tempo para a estrutura isolada no hipersepa 4D editado, selecione Plugins, IJ_Plugins e Analyze Edited Movie, insira o intervalo de tempo entre pilhas Z e clique em OK. Para criar um filme final da estrutura isolada, selecione Plugins, IJ_Plugins e Project Hyperstack, especifique as fatias de pilha Z que devem ser incluídas, selecione Intensidade Média como o tipo De projeção e clique em OK. Para criar um hipersepilado 4D com os dados originais sobre os dados editados, selecione plugins, IJ_Plugins, Mescla Dois Hyperstacks e Coloque em primeiro lugar acima do segundo. Para gerar um filme a partir do hipersedor 4D com os dados originais sobre os dados editados, selecione Plugins, IJ_Plugins e Project Hyperstack, especifique as fatias de pilha Z que devem ser incluídas, selecione Intensidade Média como o tipo de projeção e clique em OK. Aqui, o primeiro quadro de uma projeção de pilha de Z de dados brutos pode ser comparado com os mesmos dados corrigidos desconvolvados e branqueados.
Estes quadros do mesmo filme desconvolvado e branqueado corrigido mostram duas cisternas que foram analisadas, que primeiro rótulo com a proteína de glicoslação de resistência vanadate verde 4 ou marcador Vrg4, e mais tarde com o marcador de proteína de transporte genético Secretory 7 ou Sec7 vermelho. Esta montagem, criada a partir de um hipersedor corrigido desconvolved e branqueamento, mostra todas as seções ópticas em um único ponto de tempo antes e depois da edição, para permitir o isolamento do sinal de uma das cisternas escolhidas. Nesta figura, vários quadros do filme final das pilhas Z projetadas são mostrados com as projeções originais no topo da figura e projeções editadas na parte inferior.
A quantificação dos sinais fluorescentes verde e vermelho da cisternae Golgi escolhida revela que o marcador Vrg4 verde chega e persiste por cerca de 80 segundos, depois disso, o marcador Sec7 vermelho chega e persiste por cerca de 60 segundos, com uma breve sobreposição entre os dois marcadores. Ao realizar esse procedimento, é importante identificar estruturas que podem ser inequivocamente rastreadas ao longo de suas vidas. O mesmo tipo de análise pode ser realizada após fazer uma mutação ou algum outro tipo de perturbação específica.
Esta técnica abriu caminho para estudar o comportamento dinâmico dos locais de saída de cisternae golgi e endoplasmáticos usando levedura como sistema modelo.
