Este protocolo microscópico confocal permitirá a interpretação do comportamento ecológico e adaptações de microalgas de ambientes extremos com crescimento lento em laboratório utilizando a autofluorescência de seus pigmentos. Esta técnica não é invasiva e minimiza os artefatos, pois os compostos químicos não são usados. Conhecer o desempenho dos pigmentos dos autótrofos e o crescimento correspondente permitirá a concepção dos métodos de controle, que é o maior interesse para cavernas turísticas e monumentos arquitetônicos.
Comece a preparar o inóculo de Chroothece mobilis transferindo-o da cultura em ágar para o meio de água do mar ou meio líquido SWES. Manter todas as culturas por duas semanas com um período fotográfico escuro de 16 a 8 a 20 graus Celsius sob uma baixa intensidade de luz branca e sem tremer até que a densidade celular desejada seja obtida. Use um mililitro da cultura de fase exponencial com cinco vezes 10 a terceira célula por mililitro de densidade celular para inocular em uma placa de 24 poços para diferentes experimentos.
Para reproduzir o efeito de luz monocromática, use o filtro verde que permite que a luz verde passe de 470 a 570 nanômetros com um pico no comprimento de onda de 506 nanômetros e para a luz vermelha ajustada usando um filtro entre 590 e 720 nanômetros e picos em 678 nanômetros. Exponha as culturas celulares a essa luz por duas semanas. Ligue todos os componentes do microscópio de varredura a laser confocal invertido, incluindo o laser.
Monte as células no meio de crescimento SWES de cada poço experimental da placa de 24 poços em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros para geração de imagens. Escolha a abertura numérica 63X ou 1,30 ou a objetiva de imersão de glicerol NA e coloque o glicerol sobre a lente. Em seguida, coloque a placa do poço no estágio do microscópio, garantindo que a amostra não se mova durante a aquisição da imagem.
Centralize a amostra no caminho da luz e concentre-se no centro da célula, selecionando o plano com a maior intensidade de fluorescência. Uma vez feito, abra o software de aquisição de imagem e escolha XY lambda na lista suspensa no modo de aquisição. Selecione a linha de excitação do laser de 561 nanômetros, oito bits de faixa dinâmica e 1024 por 1024 pixels.
Coletar os espectros de emissão de fluorescência na largura de banda de 10 nanômetros e o tamanho do passo lambda de quatro nanômetros dentro da faixa de 570 a 760 nanômetros. Coloque o orifício em uma unidade de ar e execute a aquisição da varredura lambda. Depois de repetir este processo em diferentes campos de visão e sob as diferentes condições de luzes vermelhas e verdes, salve todos os dados.
Uma vez que a varredura lambda é adquirida, clique na janela quantificar na parte superior do software para avaliar os espectros de emissão de fluorescência coletados. Vá para a janela de projeto aberta e selecione um arquivo lambda XY. Selecione a análise de perfil empilhado no software de imagem e defina uma região de interesse de quatro micrômetros quadrados no centro de uma célula para analisar a intensidade média de fluorescência.
Exporte os dados e o CSV antes de repetir o processo com células diferentes em condições diferentes. Em seguida, abra os arquivos CSV para selecionar os diferentes picos de emissão de fluorescência de todas as regiões de interesse medidas, selecionando os dados de fluorescência máxima de ficoeritrina ficocianobilina, C.ficocianina, aloficocianina e clorofila A, respectivamente, no arquivo CSV. Uma vez feito, crie uma nova tabela com todos os valores máximos de fluorescência obtidos de cada pico de ficobiliproteína e clorofila e plote os dados em um gráfico.
Foram observadas diferenças significativas na intensidade média de fluorescência. A intensidade média de fluorescência da ficoeritrina ficocianobilina diminuiu significativamente quando as células foram expostas à luz verde monocromática. Em contraste, nenhuma diferença foi observada na luz vermelha em relação ao controle.
A luz verde teve o efeito oposto sobre a aloficocianina e a clorofila A, em que a intensidade média de fluorescência aumentou significativamente devido à adaptação dos complexos de antenas devido ao aumento da quantidade ou à melhoria da conectividade dos complexos de antenas, entre outros. A luz vermelha produziu um aumento não significativo na fluorescência de aloficocianina e clorofila. Para estudar o efeito de diferentes condições de crescimento em células em cultura, é crucial realizar as medições exatamente com as mesmas configurações de microscópio.
É possível analisar outros parâmetros ambientais relevantes para a cultura de organismos de autofluorescência, bem como o sinal de fluorescência dentro do espectro visível. Esta técnica é uma abordagem muito poderosa para um estudo de organismos de vida com vários pigmentos de autofluorescência.
