Os receptores imunológicos NLR desempenham um papel crucial na mediação da defesa vegetal contra vários patógenos. Descrevemos um método de rotulagem de proximidade baseado em TurboID para a identificação de parceiros de interação do domínio receptor Toll/interleukin-1 contendo NLRs, como receptores imunológicos em plantas nicotiana benthamiana. Este protocolo fornece uma referência importante para investigar interações proteína-proteína em outras espécies vegetais e pode ser estendido a qualquer proteína de interesse em Nicotiana benthamiana.
A abordagem de rotulagem de proximidade baseada em TurboID tem uma vantagem distinta sobre as abordagens tradicionais porque pode ser usada para capturar interações transitórias ou fracas proteína-proteína in vivo. Comece cultivando sementes de N.benthamiana em solo molhado em alta densidade. Mantenha-os em uma câmara climática com uma luz de 18 horas e oito horas de foto escura a 23 a 25 graus Celsius.
Mantenha as plantas na câmara por cerca de quatro semanas até que elas cresçam para uma fase de folha de quatro a oito para a agroinfiltração subsequente. Construa fusões TurboID e transforme os plasmídeos em células competentes de Agrobacterium, conforme descrito no protocolo de texto. Use uma seringa sem agulha de um mililitro para se infiltrar no inóculo da epiderme abaxial das folhas n.benthamiana totalmente maduras.
Às 36 horas após a filtragem, infiltre 200 biotinas micromolar nas folhas e mantenha a planta por mais três a 12 horas antes de colher o tecido da folha. Para coletar a amostra da folha, corte as folhas infiltradas na base da petiole, remova a veia da folha e congele o tecido em nitrogênio líquido. Triture o tecido da folha com um pilão e argamassa e armazene o pó em tubos Falcon de 15 ou 50 mililitros a menos 80 graus Celsius.
Para extrair a proteína total, transfira cerca de 0,35 gramas de pó de folha para um tubo de dois mililitros. Certifique-se de manter o tecido em baixa temperatura no nitrogênio líquido durante este processo. Adicione 700 microliters de tampão de lise RIPA ao pó.
Vórtice do tubo por 10 minutos e deixe a amostra no gelo por 30 minutos, misturando o conteúdo a cada quatro a cinco minutos invertendo os tubos. Centrifugar os tubos a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Então pegue o supernatante.
Remova a biotina livre executando a amostra através de uma coluna de desalamento. Remova o selador na parte inferior da coluna e coloque-o em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, solte a tampa e centrifugar a coluna a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos.
Coloque a coluna de desalização em um tubo fresco de 50 mililitros e equilibre a coluna três vezes com cinco mililitros de tampão de lise RIPA. Centrifuá-lo a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos e descartar o fluxo de cada vez. Adicione 1,5 mililitros de extrato de proteína ao topo da resina na coluna equilibrada.
E quando o extrato entrar na resina, adicione mais 100 microliters de tampão de lise RIPA. Centrifugar a coluna por dois minutos e deixar as amostras desaladas no gelo até que usem mais. Para quantificar os extratos de proteínas salgadas, meça o OD595 usando um espectrômetro Bio-Rad.
Desenhe a curva padrão com base no valor da solução BSA gradiente e calcule a concentração das amostras de proteínas desseladas. Equilibre as contas magnéticas conjugadas streptavidin C1 com um mililitro de tampão de lise RIPA por um minuto a temperatura ambiente. Use o rack magnético para absorver as contas por três minutos e aspirar suavemente a solução.
Em seguida, repita a lavagem mais uma vez. Transfira o extrato de proteína para as contas magnéticas equilibradas e incubar o tubo a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador para a afinidade purificar as proteínas. No dia seguinte, capture as contas com um rack magnético e aspire o supernatante.
Em seguida, lave as contas com 1,7 mililitros de tampão de lavagem um, adicionando-o ao tubo e incubando-as no rotor por oito minutos. Remova o supernatante como descrito anteriormente e repita a lavagem com 1,7 mililitros de tampão de lavagem dois e lave o tampão três. Adicione 1,7 mililitros de 50 mililitros Tris HCL para remover o detergente.
Em seguida, coloque o tubo no rack magnético e remova o sobrenatário. Repita a lavagem com um mililitro de 50 mililitros Tris HCL e transfira as contas para um novo tubo de 1,5 mililitro. Por fim, lave as contas seis vezes com 50 mililitros de tampão de bicarbonato de amônio por cinco minutos por lavagem.
Use 100 microliters de contas para análise de imunoblot para confirmar o enriquecimento das proteínas biotiniladas e congelar o resto da amostra a ser armazenada a menos 80 graus Celsius. Manchas ocidentais foram utilizadas para analisar expressão proteica e biotinilação nas folhas de N.benthamiana agroinfiladas. As proteínas biotiniladas nas folhas infiltradas foram eficientemente enriquecidas com contas magnéticas conjugadas streptavidin C1 para análise subsequente de espectrometria de massa.
Diferentes proteínas com tamanhos variados foram capturadas e a análise ocidental das proteínas enriquecidas mostrou bandas manchadas. Ao tentar este procedimento, lembre-se de remover o selador na parte inferior da coluna de desalagem e afrouxar as tampas antes de cada centrifugação. Este protocolo é facilmente adaptável a outras proteínas de interesse em Nicotiana benthamiana e também pode ser usado para estender o TurboID PL em outras espécies vegetais.
