O trabalho é parcialmente apoiado pelo Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students e uma bolsa NWO-VIDI 12378.

1. Condições de cultivo e teste de plantas
<ol><li>Cultivar e manter plantas em estufas controladas ou câmaras climáticas dentro da faixa de temperatura de 18-22 °C e sob regime de luz natural ou com um regime dia/noite de 16 horas/8 horas. Remova os ramos axilares para tornar as plantas mais gerenciáveis.</li>
	<li>Para batata, mantenha plantlets in vitro em frascos plásticos estéreis contendo meio Murashige-Skoog (MS) (20 g/L sacarose, 5 g/L MS sais com vitaminas, 8 g/L agar, pH 5.8) em condições controladas em câmaras climáticas a 18 °C com regime dia/noite de 16 horas/8 por duas semanas e depois transferi-los para potes de solo esterilizado em compartimentos de estufa regulados.</li>
</ol>2. Agroinfiltração
<ol><li>Material vegetal: Para Nicotiana benthamiana,use cerca de 4-5 semanas de plantas cultivadas com sementes. Para batata, use em torno de 4-5 semanas de transplantes de in vitro. Escolha folhas jovens, saudáveis e totalmente desenvolvidas para infiltrações.</li>
	<li>
Cultura de agrobacterium:<ol>
<li>Prepare o meio YEB com antecedência(Tabela 1). Encha os tubos de 50 ml com 10 ml de yeb médio suplementado com acetossiingona de 1 μl (200 mM), 100 μl de tampão MES (2-(N-morpholino)-ácido sulfônico de etano, 1 M) e os antibióticos apropriados. Pipeta 20 μl de glicerol das cepas desejadas(Tabela 2) (contendo o gene de interesse) no YEB. Inicie culturas para todas as cepas de Agrobacterium neste ensaio ao mesmo tempo. Incubar células agitando por 1-2 dias a 28 °C e 200 rpm a um OD600 de aproximadamente 1.0.</li>
		<li>Células de colheita por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. Despeje o supernasce e resuspenda a pelota em meio MMA recém-feito(Tabela 3) a um OD600 de 0,3. Células de vórtice suavemente para resuspensá-las. Para a coinfiltração de duas cepas bacterianas, misture a cultura em uma proporção de 1:1.</li>
		<li>Deixe a cultura no banco em temperatura ambiente por 1-6 horas antes das infiltrações. Enquanto isso, rotule as plantas para serem infiltradas e a data do experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrações: Use uma seringa sem agulha de 1 ml para se infiltrar nas suspensões agrobacterium. Injete cuidadosamente e lentamente os painéis de folha com as suspensões da seringa (por razões de saúde e segurança, a proteção dos olhos deve ser usada durante este processo). Infiltrar-se em pelo menos três plantas para cada cepa. Use três folhas por planta para servir como triplicados. Nota: Normalmente, 1 ml de suspensão de Agrobacterium pode ser suficiente para 3 plantas de N. benthamiana. Para a batata, mais suspensão é necessária porque as folhas das espécies de Solanum são mais difíceis de se infiltrar. Os volumes necessários de suspensões dependem da espécie Solanum. Evite a contaminação cruzada trocando luvas ou esterilizando luvas com etanol entre infiltrações e não regando as plantas até o dia seguinte à inoculação.</li>
	<li>Marcar: Respostas macroscópicas de pontuação cerca de 3 dias após a infiltração quando o fenótipo de morte celular é claro(Figura 1). Se o fenótipo de morte celular for quantitativo, utilize os critérios determinados(Figura 2). Resumidamente, as escalas para pontuação macroscópica da morte celular dependem principalmente dos percentuais de morte celular da área infiltrada. Os percentuais de morte celular são retratados em uma escala de 0% (sem sintomas) a 100% (morte celular confluente). As respostas intermediárias variam de respostas fracas, como clorose, a níveis crescentes de morte celular. Se desejar, a pontuação macroscópica também pode ser avaliada quantitativamente usando equipamentos modernos de fotodesfotografia.</li>
</ol>3. Agroinfecção PVX
<ol><li>Material vegetal: Para N. benthamiana,use cerca de 2-3 semanas de plantas cultivadas com sementes. Para batata, use cerca de 2-3 semanas de transplantes de in vitro. Para testes em larga escala, use plantas ligeiramente mais antigas (4-5 semanas), pois essas plantas têm folhas cada vez maiores para acomodar um número maior de pontos de inoculação de Agrobacterium.</li>
	<li>
Cultivo de agrobacteria: <ol>
<li>Prepare o meio YEB com antecedência. Encha os tubos de 10 ml com 3 ml de YEB complementados com os antibióticos apropriados. Pipeta 20 μl de glicerol das cepas desejadas(Tabela 2) (contendo o gene de interesse) no YEB. Inicie culturas para todas as cepas de Agrobacterium neste ensaio ao mesmo tempo. Incubar células agitando por 1-2 dias a 28 °C e 200 rpm a um OD600 de aproximadamente 1.0.</li>
		<li>Pipeta cerca de 300 μl de cada cepa agrobacterium e espalhá-los em placas médias de ágar sólido LB complementadas com os antibióticos apropriados e incubar células a 28 °C por 1-2 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infecções: Use uma espátula para coletar a cultura Agrobacterium na placa. Mergulhe um palito de madeira na cultura Agrobacterium na espátula e fure as folhas para inocular grande quantidade de bactérias. Inocular pelo menos três plantas para cada cepa. Use três folhas por planta para servir como triplicados. Em cada folha, faça vários locais de inoculação para cada cepa.</li>
	<li>Marcar: Respostas macroscópicas de pontuação cerca de duas semanas após a inoculação(Figura 3). Para telas de alta produtividade, regis qualitativos (sim/não) para cada ponto de inoculação. Em seguida, calcule a porcentagem de sites de resposta e compare-os com controles.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ensaios transitórios como agroinfiltração e agroinfecção são métodos eficientes que são vitais para a pesquisa moderna de patologia molecular vegetal. Apesar de algumas limitações, esses métodos atendem à demanda por análises funcionais eficientes e robustas de alto rendimento nas plantas.
O sistema de agroinfiltração é um ensaio funcional amplamente utilizado em uma variedade de espécies vegetais. A agroinfiltração facilita a entrega de vários transgenes na mesma célula com expressão simultânea de proteínas interativas. Isso é vantajoso para recapitular as relações R-AVR, por cunhar cepas de Agrobacterium que expressam genes Avr com cepas que expressam os genes R correspondentes. Além disso, para pares R-AVR conhecidos, tais coinfiltrações podem ser usadas como controles positivos. Incluir tais controles é importante porque em alguns genótipos de plantas, a eficiência de transformação pode estar abaixo do limiar para detectar respostas. A inclusão de controles negativos, por exemplo, uma cepa de Agrobacterium contendo um vetor sem uma inserção genética, também é essencial para determinar se um determinado genótipo vegetal levanta respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium. Essa característica ocorre em uma certa frequência no germoplasma da batata, e nem todas as espécies de Solanum são adequadas para este sistema de expressão baseado em Agrobacterium. Geralmente, o ensaio de agroinfiltração funciona muito bem em N. benthamiana e na maioria dos genótipos de batata. Além da efetivação da biodinâmica, existem várias outras aplicações potenciais para a técnica de agroinfiltração, como a produção de proteínas a partir de transgenes e localização de proteínas em células vegetais por microscopia confocal.
A agroinfecção PVX é um sistema de triagem altamente sensível e tipicamente mais adequado para triagens de alto rendimento. Uma vez que o Agrobacterium está agora apenas localmente presente, as respostas inespecíficas a esta bactéria não são agora muito perturbadoras, uma vez que o vírus PVX assume uma maior disseminação do transgene. No entanto, as plantas podem ser resistentes ao PVX, ou montar respostas de resistência extrema (ER), e nesse caso o método de agroinfecção não é adequado. Outra limitação do método de agroinfecção PVX é o tamanho da inserção do gene de interesse. Fenótipos observados de respostas podem variar de uma intensa necrose negra ao redor da ferida até necrose fraca perto do ponto de inoculação. Tanto nas espécies N. benthamiana quanto solanum, a agroinfecção PVX é reconhecida como mais sensível do que a agroinfiltração.
Mantendo em conta que o fundo genético dos diversos genótipos vegetais testados pode ter algumas restrições (veja acima), geralmente obtemos conclusões semelhantes por agroinfecção pvx e agroinfiltração. Esses resultados também são comparáveis como obtidos em outros ensaios, como infiltrações proteicas29 e ELISA3. Considerando as vantagens e limitações de ambos os sistemas, recomendamos usar ambos os métodos para complementar um ao outro ou confirmar resultados independentes.

Effectoromics, uma abordagem genômica funcional de alto rendimento surgiu recentemente como uma poderosa ferramenta para identificar genes de resistência (R) em plantas de cultura e avirulência correspondente(Avr) genes de patógenos1-4. Em contraste com a transformação estável mais demorada com genes R, a estratégia de efeitosomómicas é baseada em ensaios transitórios de sequências genéticas patógenas.
Desde a era genômica, genomas de patógenos vegetais têm sido amplamente explorados. Por exemplo, para oomycetes, que incluem os patógenos vegetais mais devastadores, grandes coleções de sequências foram geradas e analisadas para genes que desempenham um papel durante a interação com a planta5-10. Uma classe de proteínas patógenas representa os efeitos, que manipulam a estrutura e a função das células hospedeiras, seja para facilitar a infecção (fatores de virulência) ou para desencadear respostas de defesa (fatores de avirulência)11-13. Expressão de genes Avr em células vegetais contendo genes R geralmente resulta na resposta de morte celular hipersensível (HR)14,15. Na expressão de planta de genes R e Avr pode ser realizada utilizando sistemas de expressão transitória, como tumefaciens agrobacterium -transformação transitória baseada (agroinfiltração)16. Essa transformação transitória também pode ser aplicada em combinação com sistemas de expressão viral (agroinfecção)17,18.
Para a agroinfiltração, o agente mais usado é a A . tumefaciens, um amplo patógeno de gama hospedeira de plantas dicot. A . tumefaciens contém um plasmídeo indutor de tumor (Ti). Transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo ti será translocado para as células vegetais depois que o maquinário de virulência da bactéria for ativado. Isso pode ser desencadeado em células vegetais feridas, pelos compostos fenólicos de baixo peso molecular e monossacaraides em um ambiente ligeiramente ácido19. O gene da virulência é ativado após a infiltração de suspensões de Agrobacterium em painéis de folhas definidos por veias principais. Em seguida, as células vegetais nos painéis das folhas serão transformadas e expressarão os transgenes contidos na região do T-DNA.
A agroinfecção é baseada no Agrobacteriuminoculado de feridas, que media a translocação de um vírus para células vegetais. O vírus então se espalha ainda mais para tecidos vegetais adjacentes, na ausência de Agrobacterium. Para a agroinfecção, vários vírus vegetais podem ser usados. Os vírus RNA são vetores ideais para a expressão genética porque podem se multiplicar a níveis muito altos em plantas infectadas. Entre os vírus do RNA vegetal, o Vírus da Batata X (PVX) é amplamente utilizado para telas de efeitosomómicos. Para facilitar testes funcionais para um gene inserido, vetores binários que contêm o genoma PVX ladeado pelo promotor do vírus mosaico de couve-flor 35S e o exterminador de synthase nopaline, foram clonados no T-DNA de A. tumefaciens20. Depois que o T-DNA é transferido para células vegetais, o genoma PVX contido no T-DNA é transcrito pelo promotor do 35S. Em seguida, as partículas de vírus se espalham sistemicamente nas plantas infectadas, resultando na expressão do gene inserido. Este método baseado tanto na Agrobacterium quanto no PVX é chamado de agroinfecção PVX.
Aqui mostramos exemplos tanto para os ensaios de agroinfiltração quanto de agroinfecção PVX. Como plantas hospedeiras usamos germoplasma de batata ( seçãode solanum Petota),para a qual as abordagens de efeitos foram pioneiras e comprovadamente bem sucedidas3,4. Também utilizamos Nicotiana benthamiana, que é reconhecida como uma planta modelo em plantas solanáceas 14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são dois ensaios eficientes de expressão transitória para análise funcional de genes candidatos em plantas. O agente mais usado para a agroinfiltração é o Agrobacterium tumefaciens, um patógeno de muitas espécies de plantas dicot. Isso implica que a agroinfiltração pode ser aplicada a muitas espécies vegetais. Aqui, apresentamos nossos protocolos e resultados esperados ao aplicar esses métodos à batata (Solanum tuberosum),suas espécies de Solanum com tubos selvagens relacionados (seçãode Solanum Petota) e a planta modelo Nicotiana benthamiana. Além da análise funcional de genes únicos, como genes de resistência (R) ou avirulência(Avr),o ensaio de agroinfiltração é muito adequado para recapitular as interações R-AVR associadas a interações específicas de patógenos hospedeiros, simplesmente fornecendo transgenes R e Avr na mesma célula. No entanto, alguns genótipos vegetais podem aumentar as respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium,como observamos, por exemplo, para vários genótipos de batata. Em comparação com a agroinfiltração, a detecção da atividade de AVR com agroinfecção PVX é mais sensível, mais elevada em telas funcionais e menos sensível às respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium. No entanto, a defesa inespecífica ao PVX pode ocorrer e há o risco de perder respostas devido à resistência extrema induzida pelo vírus. Apesar dessas limitações, em nossa experiência, a agroinfiltração e a agroinfecção PVX são ensaios adequados e complementares que podem ser usados simultaneamente para confirmar os resultados uns dos outros.

A Figura 1 mostra um experimento representativo de agroinfiltração com 7 efeitos diferentes (E1-E7) na batata e N. benthamiana. A morte celular aparece nos painéis de folhas infiltrados cerca de 3 dias após a infiltração. A extensão do fenótipo da morte celular precisa ser comparada com os controles. Uma mistura da cepa Agrobacterium AGL1(pVirG)23 contendo pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a foi utilizada como controle positivo24,25, enquanto a AGL1(pVirG) foi utilizada como controle negativo. As figuras 1A e 1B mostram bons exemplos de agroinfiltração no genótipo de batata MaR8 (Mastenbroek R8)26 e N. benthamiana,respectivamente, que são muito favoráveis à agroinfiltração. Há morte celular confluente no painel de folhas coinfiltilhado com controle positivo, enquanto nenhuma resposta de morte celular ocorre com controle negativo ou pBINplus-R3a. Em MaR8, dois efeitos AVR3a (E2) e AVR4 (E3) induzem uma morte celular, enquanto os outros efeitos (E1 e E4-E7) não. Em N. benthamiana, nenhum dos efeitos testados induz uma resposta de morte celular. As figuras 1C e 1D mostram exemplos de agroinfiltração na batata selvagem Solanum berthaultii 483-1 e Solanum rechei 210-5, que não são bem agradáveis para a técnica de agroinfiltração. Em S. berthaultii 483-1, o tecido da folha mostra uma necrose inespecífica para controles negativos, bem como para todos os efeitos testados. Em S. rechei 210-5, painéis de folhas infiltrados mostram uma resposta de morte celular muito fraca ao controle positivo.
A Figura 2 mostra uma gama de escalas de pontuação que podem ser usadas para quantificar a resposta ao Agroinfilado Agrobacterium. Os percentuais de morte celular são retratados em uma escala de 0-100%. Os fenótipos observados variam de sintomas macroscopicamente não visíveis (0%), através de uma série de respostas intermediárias que apresentam clorose e níveis crescentes de morte celular, até morte celular confluente (100%).
A Figura 3 mostra um experimento representativo após a agroinfecção pvx na batata. Normalmente, a morte celular em expansão pode ser encontrada nos locais cerca de duas semanas após a inoculação da escolha do dente. Como mostrado em ambos os painéis de figuras, a expansão da morte celular está presente nos locais que foram inoculados com pGR106-CRN2 (controle positivo usando o efeito crinkler Crn2), que é um gene geral de morte celular indutor de P. infestans27. Além da pequena resposta ao ferimento, não é observada morte celular em expansão nos locais que foram inoculados com o pGR106-vazio (controle negativo). Na Figura 3A, representando o genótipo de batata MaR3 (Mastenbroek R3), dois efeitos pGR106 (E1 e E2) não induziram a morte celular. Na Figura 3B, é apresentado um resultado positivo da triagem de efeitos no solanum huancabambense selvagem 354-1; a resposta à morte celular foi observada em dois efeitos pGR106 (E1-E3, representando as provocações)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figura 1. Exemplos de agroinfiltração na batata e N. benthamiana. Plantas incluindo (A) um genótipo de batata MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana,(C) Solanum berthaultii 483-1 e (D) Solanum rechei 210-5 foram infiltrados com uma mistura da cepa Agrobacterium AGL1(pVirG) 23 contendo pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a (controle positivo), AGL1(pvirG) (controle negativo), pBINplus-R3a, e sete efeitos (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figura 2. Quantificação das respostas de agroinfiltração. A fotografia mostra escalas representativas de pontuação para morte celular, variando de 0% (sem sintomas) a 100% (morte celular confluente). As respostas intermediárias variam de respostas fracas, como clorose, a níveis crescentes de morte celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figura 3. Exemplos de agroinfecção PVX na batata. O genótipo de batata MaR3 (Mastenbroek R3) (A) e Solanum huancabambense 354-1 (B) dente-pick inoculado com pGR106-CRN2 (controle positivo), pGR106-vazio (controle negativo) e pGR106-E1-2 (efeitores), ou pGR106-E1-E3, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
Mesa 1. Meio YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>destilado H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>sacarose</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>extrato de carne bovina</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>peptone bacteriológico</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>extrato de levedura</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 2. Vetores e cepas utilizadas para agroinfiltração e agroinfecção PVX. Vários vetores binários podem ser usados. Vetores na lista abaixo permitem alta expressão dos genes candidatos e têm trabalhado bem em nossas mãos. Preferimos usar a cepa Agrobacterium GV3101(pMP90)29 em N. benthamiana e encontrar AGL130 contendo o pVirG plasmid auxiliar (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 mais adequado na batata31. Cepas adicionais foram analisadas em outros grupos em várias plantas modelo, incluindo N. benthamiana, mas não na batata32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway versão36
Mesa 3. Meio MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Ajuste o pH para 5,6.

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Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K visualizações.  Wageningen University. Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biologia

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Quantificando o início da morte celular por meio de imagens contínuas

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

Autor em destaque: uma abordagem simplificada para estudar a iniciação da morte celular na resposta de hipersensibilidade 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

Estudando a iniciação da morte celular usando um microscópio digital

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

Estudo experimental da hibernação do besouro da batata Colorado em condições naturais

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

Análise de resiliência da batata sob estresses relacionados ao clima

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

Autor em destaque: Desvendando as respostas das plantas a estresses abióticos usando a plataforma robótica PlantScreen

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

Fenotipagem baseada em imagem de alto rendimento para determinar respostas morfológicas e fisiológicas a estresses únicos e combinados em batata

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...