Os autores gostariam de agradecer a você Kim Yates, Eileen Franklin, e Rebecca Tjepkema (cuidados de animais e veterinários Serviços, Universidade de Ottawa) para assistência em cirurgias de animais. Lee Tai-Hwa é apoiado por uma Fonds de recherche santé Quebec Fellowship. Este trabalho foi apoiado por subvenções de funcionamento do Instituto de Pesquisa Canadian Cancer Society Inovação Grant, Ontario Ministry of Award Pesquisa e Desenvolvimento Pesquisador precoce e Fundação Canadense para Inovação - Líder do Opportunity Grant para Rebecca Auer.

1. Mantendo 4T1 Células Tumorais in vitro <ol><li> Cultura de células tumorais modificadas 4T1 em DMEM completo (DMEM, 10% FBS, 1x penicilina / estreptomicina), em placas de cultura de tecidos de 10 cm. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 de cultura de tecidos incubadora. </li><li> Culturas Dividir 2-3 vezes / semana. Para manter a viabilidade das células óptimas não deve exceder 80% de confluência. Não use pilhas para o estabelecimento in vivo tumores primários se as culturas foram repicadas in vitro por&gt; 1 mês, pois isso diminui a malignidade e potencial metastático de células anteriormente subculturas. </li></ol> 2. Colheita 4T1 Células Tumorais para Injeção <ol><li> Aspirar o meio de cultura a partir da placa de cultura de tecido utilizando uma pipeta de Pasteur. </li><li> Adicionar 10 ml de 1x PBS estéril contendo 2 ml de EDTA. Deixe a solução de PBS incubar na placa a 37 ° C, 5% de CO 2 de tecido de cultura incubadora durante 5-7 min. </li><li> Colheita solução PBS a partir de chapa, rinsing a placa 2-3x com solução, a transferência para 15 ml de tubo cónica. </li><li> Centrifugar células durante 5 min a 500 xg, a 4 ° C, numa centrífuga de bancada. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em MEMD isento de soro. </li><li> Determinar a concentração de células utilizando um contador de células. </li><li> Diluir as células em meio isento de soro para 1x10 6 cells/500 ul (1x10 5 células/50 ul (para injecção e colocar as células em gelo. </li></ol> 3. Injetando Ratos com 4T1 Células Tumorais Todos os estudos com animais realizados foram de acordo com as diretrizes institucionais nos Serviços Veterinários Cuidados Animais da Universidade de Ottawa recomendações para todos os animais que receberam injeções ortotópico ou implantes tumorais. <ol><li> Trate os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 hora antes da cirurgia para tratamento da dor. </li><li> Induzir e manter o mouse sob anestesia com isoflurano 2,5% durante o período de duração do injeçãoção. Aperte a pata do rato para detectar resposta reflexa. Se nenhuma for detectada, os níveis eficazes de anestesia são atingidos. Lubrificante ocular esterilizada é então aplicado, para evitar a secagem da córnea. </li><li> Coloque um 30 G ½ na seringa &quot;Ultra-fino&quot; com exatamente 50 mL de células suspensão. Certifique-se de que todas as bolhas de ar são removidas da seringa coluna tocando no lado da seringa para retirar as bolhas de ar. </li><li> Coloque o mouse (sob anestesia) ventral voltada para cima. </li><li> Limpe o local da injecção com um algodão embebido em álcool e introduzir a agulha na horizontal e diretamente para o quarto bloco de gordura mamária, dispensar lentamente o volume de seringa. </li><li> Utilize um cotonete para limpar qualquer vazamento possível. </li><li> Permitir que os ratos recuperar da anestesia. </li><li> Manter buprenorfina (0,05 mg / kg) para o manejo da dor administrada sc cada 8 horas, durante 2 dias. </li></ol> 4. Administrando Tratamento Perioperatória em 4T1 Tumor Tendo BALB / c Mice <ol><li> Aos 13 dias de injeção de células pós-tumor, medir o tumor primário usando um paquímetro externo. Meça o maior diâmetro longitudinal (comprimento) eo maior diâmetro transversal (largura) com a pinça. A fórmula elipsoidal modificado é usado para calcular o volume do tumor (volume do tumor = 1/2 (comprimento de uma largura de 2) </li><li> Aos 13 dias de injeção de células pós-tumor, o tumor primário deve medir cerca de 1 cm 3. Quando esta medida do tumor é atingido, preparar reagente terapia perioperatória. </li><li> Vírus oncolítico é uma terapêutica inovadora que se pode administrar no período perioperatório. Prepare vírus oncolítico (1x10 9 UFP / 1 ml) em 1x PBS estéril e colocar em gelo, antes da injecção. </li><li> Rato Seguro e lugarem limitador para injecção intravenosa veia da cauda. </li><li> Gentilmente aqueça cauda do rato na água quente da torneira para visualizar veias da cauda laterais. </li><li> Coloque um 27 G ½ em &quot;seringa de insulina&quot;, com precisão de 100 l de terapia vírus oncolítico. Certifique-se de que todas as bolhas de ar são removidas da seringa coluna. </li><li> Injetar o mouse com 1x10 8 PFU/100 mL / rato para uma das veias da cauda laterais. Se a agulha está adequadamente inserido na veia lateral, sem resistência deve ser sentida quando pressionando a seringa. </li></ol> 5. A ressecção completa do tumor primário e abdominal Esquerda Nephrectomy <ol><li> Aos 14 dias de injeção de células pós-tumor, iniciar cuidados perioperatórios rotina seguinte Universidade de Ottawa Animal Care e Serviço Veterinário aprovado protocolos. Trate os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 hora antes da cirurgia para tratamento da dor. Induzir e manter a anestesia utilizando 2,5% de isoflurano durante a cirurgia. Under condições e utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis esterilizados, local da cirurgia é raspado e limpo. Animais são administrados fluidos subcutâneos e lubrificante ocular antes da cirurgia. </li><li> Fazer uma pequena incisão (1-2 cm de comprimento) para suavemente e remover completamente o tumor primário 4T1 de almofada de gordura mamaria. </li><li> Feche a incisão com 2-3 9 milímetros grampos. </li><li> Exponha o abdômen, cortando através da pele e tecido subcutâneo ao longo da linha média ventral do rato. </li><li> Faça uma incisão na linha alba (3-4 cm) para acessar o mouse peritônio. </li><li> Exponha o lado interior esquerdo do abdômen, movendo as entranhas sobrejacentes para o lado. Certifique-se que os intestinos são mantidos úmido com uma solução salina embebido gaze estéril. </li><li> Usando um par sem corte de pinça cirúrgica, segure suavemente o rim esquerdo. </li><li> Usando um fio de seda trançada revestida 3-0 cera amarrado em um laço, ligadura do hilo do rim esquerdo e prenda com 3 nós cirúrgicos. Retire o rim esquerdo com Surgitesoura cal. </li><li> Inspecione o empate sutura cuidadosamente para garantir que hemostasia adequada seja alcançada. </li><li> Feche a camada subcutânea com uma sutura loop contínuo usando 5-0 trançado camada de pele absorvível, em seguida, usando grampo 9 milímetros grampos. Passos 5,2-5,10 deve exigir 10 min / animal. </li><li> Manter buprenorfina (0,05 mg / kg) para o manejo da dor administrada sc cada 8 horas, durante 2 dias. </li></ol> 6. Eutanásia Ratos e Processamento e Quantificação de pulmão Tumor Burden <ol><li> Aos 28 dias pós-injeção 4T1 tumor, eutanásia camundongos de acordo com a Animal Care e Serviços Veterinários protocolo da Universidade de Ottawa. </li><li> Spray para baixo do mouse com etanol 70%. </li><li> Fazer incisão inicial com uma tesoura, logo abaixo da caixa torácica. </li><li> Expor o tórax, cortando através da pele e na camada subcutânea na linha média ventral da cavidade torácica do rato. </li><li> Faça incisões laterais através da pele e do tecido de cada lado até o neck do mouse. </li><li> Dissecar os pulmões agarrando suavemente o pulmão, enquanto cortando fora o tecido conjuntivo acima e abaixo dos pulmões. </li><li> Presoak extraído pulmões em PBS frio para remover o sangue residual, em seguida, coloque em 10% de formalina tamponada a. </li><li> Fotografia cada pulmão para avaliação de metástases tumorais. Pesar pulmões para carga tumoral quantificação. </li></ol>

<ol>
	<li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+postoperative+metastatic+disease+by+inhibiting+surgery-induced+dysfunction+in+natural+killer+cells.">Preventing postoperative metastatic disease by inhibiting surgery-induced dysfunction in natural killer cells.</a> Cancer Res. 73, 97-107 (2013).</li><li>Seth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Stress+Promotes+the+Development+of+Cancer+Metastases+by+a+Coagulation-Dependent+Mechanism+Involving+Natural+Killer+Cells+in+a+Murine+Model.">Surgical Stress Promotes the Development of Cancer Metastases by a Coagulation-Dependent Mechanism Involving Natural Killer Cells in a Murine Model.</a> Ann. Surg. , (2012).</li><li>Shakhar, G., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+prophylactic+measures+against+postoperative+immunosuppression:+could+they+reduce+recurrence+rates+in+oncological+patients.">Potential prophylactic measures against postoperative immunosuppression: could they reduce recurrence rates in oncological patients.</a> Ann. Surg. Oncol. 10, 972-992 (2003).</li><li>Shiromizu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+laparotomy+and+laparoscopy+on+the+establishment+of+lung+metastasis+in+a+murine+model.">Effect of laparotomy and laparoscopy on the establishment of lung metastasis in a murine model.</a> Surgery. 128, 799-805 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+surgical+stress+promotes+tumor+metastasis.">Increased surgical stress promotes tumor metastasis.</a> Surgery. 133, 547-555 (2003).</li><li>Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+recognition.">NK cell recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 225-274 (2005).</li><li>Espi, A., Arenas, J., Garcia-Granero, E., Marti, E., Lledo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+curative+surgery+on+natural+killer+cell+activity+in+colorectal+cancer.">Relationship of curative surgery on natural killer cell activity in colorectal cancer.</a> Dis. Colon Rectum. 39, 429-434 (1996).</li><li>Pollock, R. E., Lotzova, E., Stanford, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+surgical+stress+impairment+of+human+perioperative+natural+killer+cell+cytotoxicity.">Mechanism of surgical stress impairment of human perioperative natural killer cell cytotoxicity.</a> Arch. Surg. 126, 338-342 (1991).</li><li>Pollock, R. E., Lotzova, E., Stanford, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+stress+impairs+natural+killer+cell+programming+of+tumor+for+lysis+in+patients+with+sarcomas+and+other+solid+tumors.">Surgical stress impairs natural killer cell programming of tumor for lysis in patients with sarcomas and other solid tumors.</a> Cancer. 70, 2192-2202 (1992).</li><li>Ben-Eliyahu, S., Page, G. G., Yirmiya, R., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+stress+and+surgical+interventions+promote+tumor+development+by+suppressing+natural+killer+cell+activity.">Evidence that stress and surgical interventions promote tumor development by suppressing natural killer cell activity.</a> Int. J. Cancer. 80, 880-888 (1999).</li><li>Page, G. G., Blakely, W. P., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+postoperative+pain+is+a+mediator+of+the+tumor-promoting+effects+of+surgery+in+rats.">Evidence that postoperative pain is a mediator of the tumor-promoting effects of surgery in rats.</a> Pain. 90, 191-199 (2001).</li><li>Glasner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+survival+rates+in+two+models+of+spontaneous+postoperative+metastasis+in+mice+by+combined+administration+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+cyclooxygenase-2+inhibitor.">Improving survival rates in two models of spontaneous postoperative metastasis in mice by combined administration of a beta-adrenergic antagonist and a cyclooxygenase-2 inhibitor.</a> J. Immunol. 184, 2449-2457 (2010).</li><li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+use+of+beta-blockers+and+COX-2+inhibitors+may+improve+immune+competence+and+reduce+the+risk+of+tumor+metastasis.">Perioperative use of beta-blockers and COX-2 inhibitors may improve immune competence and reduce the risk of tumor metastasis.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 2042-2052 (2008).</li><li>Goldfarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+postoperative+immune+status+and+resistance+to+cancer+metastasis:+a+combined+perioperative+approach+of+immunostimulation+and+prevention+of+excessive+surgical+stress+responses.">Improving postoperative immune status and resistance to cancer metastasis: a combined perioperative approach of immunostimulation and prevention of excessive surgical stress responses.</a> Ann. Surg. 253, 798-810 (2011).</li><li>Tartter, P. I., Steinberg, B., Barron, D. M., Martinelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prognostic+significance+of+natural+killer+cytotoxicity+in+patients+with+colorectal+cancer.">The prognostic significance of natural killer cytotoxicity in patients with colorectal cancer.</a> Arch. Surg. 122, 1264-1268 (1987).</li><li>Fujisawa, T., Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+tumor+killing+activity+as+a+prognostic+factor+in+primary+resected+nonsmall+cell+carcinoma+of+the+lung.">Autologous tumor killing activity as a prognostic factor in primary resected nonsmall cell carcinoma of the lung.</a> Cancer. 79, 474-481 (1997).</li><li>Guillot, B., Bessis, D., Dereure, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucocutaneous+side+effects+of+antineoplastic+chemotherapy.">Mucocutaneous side effects of antineoplastic chemotherapy.</a> Expert Opin. Drug Saf. 3, 579-587 (2004).</li><li>Deehan, D. J., Heys, S. D., Ashby, J., Eremin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-2+(IL-2)+augments+host+cellular+immune+reactivity+in+the+perioperative+period+in+patients+with+malignant+disease.">Interleukin-2 (IL-2) augments host cellular immune reactivity in the perioperative period in patients with malignant disease.</a> Eur. J. Surg. Oncol. 21, 16-22 (1995).</li><li>Houvenaeghel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+feasibility+of+perioperative+treatment+with+interferon-alpha+2a+in+advanced+cancers.">Tolerance and feasibility of perioperative treatment with interferon-alpha 2a in advanced cancers.</a> Int. Surg. 82, 165-169 (1997).</li><li>Klatte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+immunomodulation+with+interleukin-2+in+patients+with+renal+cell+carcinoma:+results+of+a+controlled+phase+II+trial.">Perioperative immunomodulation with interleukin-2 in patients with renal cell carcinoma: results of a controlled phase II trial.</a> Br. J. Cancer. 95, 1167-1173 (2006).</li><li>Oosterling, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+IFN-alpha+to+avoid+surgically+induced+immune+suppression+in+colorectal+cancer+patients.">Perioperative IFN-alpha to avoid surgically induced immune suppression in colorectal cancer patients.</a> Histol. Histopathol. 21, 753-760 (2006).</li><li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+influenza+vaccination+reduces+post-operative+metastatic+disease+by+reversing+surgery-induced+dysfunction+in+natural+killer+cells.">Perioperative influenza vaccination reduces post-operative metastatic disease by reversing surgery-induced dysfunction in natural killer cells.</a> Clin Cancer Res. , (2013).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A ressecção cirúrgica é o esteio da terapia para pacientes com tumores sólidos localizados. Mesmo com a ressecção completa, muitos pacientes desenvolvem uma recorrência metastática e, finalmente, morrer de sua doença. O período pós-operatório imediato fornece um ambiente ideal para a formação de metástases de cancro, modulada, em grande parte, pela supressão das células NK pós-operatório. Apesar disso, continua a ser uma janela terapêutica, que é largamente ignorado. Atualmente não há terapias anti-câncer perioperatórios padrão destinadas a prevenir metástases pós-operatórias. O desafio atual é identificar terapias seguras e promissoras que ativarão as células NK no período perioperatório impedindo assim o estabelecimento da doença micrometastática. Estas terapias devem ser rigorosamente caracterizados para a segurança e eficácia em modelos animais pré-clínicos e, em seguida, traduzido em ensaios clínicos cuidadosamente concebido. A relação primárianale de desenvolver um modelo de tumor do rato do estresse cirúrgico é explorar mecanismos de supressão imunológica e metástase após a cirurgia e avaliar immunotherapies inovadores com potencial para uso futuro em pacientes com câncer submetidos a cirurgia para remover o tumor primário. Para alcançar este objetivo, foi desenvolvido um modelo de carcinoma mamário murino 4T1 juntamente com o estresse cirúrgico. Enquanto a linha celular 4T1 de murino é um &quot;carcinoma mamário&quot;, a razão para utilizar esta linha de células é a reprodutibilidade das metástases espontâneas que nos permite avaliar os efeitos de trauma cirúrgico em um modelo de cancro realista. Neste contexto, a origem real da malignidade é menos importante do que a biologia do tumor e o potencial metastático. O segundo componente fundamental do nosso modelo é o desenvolvimento de um procedimento cirúrgico de animais para se assemelhar de perto a cirurgia de câncer humano. Neste modelo estresse cirúrgico animal, o principal 4T1 tumor de mama é retirado após atingir 1 cm3. Porquecirurgias de câncer em pacientes humanos envolvem supressão imunológica significativa, uma nefrectomia-abdômen aberto em grupos de tratamento &quot;estresse cirúrgico&quot; é adicionalmente realizada. Como ele se compara com a ressecção do tumor mais convencional em humanos, a natureza invasiva de uma nefrectomia esquerda completo é muito comparável a vários tipos de tratamentos cirúrgicos para tumores sólidos, incluindo a cirurgia para o câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de rim, câncer de pâncreas, pulmão e esôfago câncer. Além disso, argumentam que as profundas mudanças fisiológicas que ocorrem no período perioperatório, devido à laparotomia + nefrectomia, reproduz adequadamente as mudanças fisiológicas que ocorrem esmagadora seguinte cirurgia invasiva para a maioria dos tumores sólidos. Para controlar fatores perioperatórios que podem levar ao estresse excessivo cirúrgico e mortalidade, a duração da anestesia e cirurgia e manter a temperatura do corpo durante a cirurgia é precisamente definido. Todos estes parâmetros são precisamente executado umd definido em nosso protocolo de cirurgia para espelhar cuidados perioperatórios de rotina em pacientes com câncer humanos. O momento dos tratamentos perioperatória é um componente crítico adicional para o modelo de resgate perioperatória. Ratinhos portadores do tumor 4T1 tenham sido previamente tratados com 3 regimes de vacina contra a gripe: neoadjuvante (dada 5 dias antes da cirurgia), peri-operatória (dada no mesmo dia de cirurgia) e perioperatória + multidose (dada no dia da cirurgia, seguida por 2 doses adicionais dado 5 dias de intervalo). Notavelmente, todos os três modos de tratamento com a vacina diminuiu significativamente as metástases do pulmão 22. No entanto, a vacina contra a gripe administradas no período perioperatório em dose única metástases reduzidos de forma mais eficaz. Coletivamente, estas experiências destacar a importância do período perioperatório imediato como uma janela terapêutica estreita para intervir no processo metastático. Uso perioperatório de imunoterapias inovadoras, tais como oncolytic vírus e vacinas foi exclusivamente limitada a nosso grupo de pesquisa. Nós demonstramos pela primeira vez que a administração perioperatória de vírus novo ORF oncolitico e vaccinia pode reverter a supressão das células NK após cirurgia em modelos animais 1. Mais importante ainda, este resgate da função imune correlaciona com uma diminuição da formação de metástases de pós-operatório. Em estudos humanos, os pacientes no pós-operatório de cirurgia de câncer tinham reduzido citotoxicidade das células NK e perioperatória OV aumenta significativamente a atividade das células NK em pacientes com câncer 1. Usando vacinas profiláticas disponíveis comercialmente, foi demonstrado que a administração da vacina da gripe perioperatória reduziu significativamente as metástases tumorais e melhorou a citotoxicidade das células NK em modelos de tumores pré-clínicos. Em estudos em humanos, a vacina contra influenza aumentou significativamente a atividade das células NK em doadores humanos saudáveis ​​e pacientes de cirurgia de câncer 22. Muitas abordagens são usadas para reduzir cancrecorrência er, incluindo quimioterapia e radioterapia, mas estas terapias são normalmente administrados semanas a meses antes (neoadjuvante) ou após (adjuvante) cirurgia. A investigação neste domínio mostra que o pós-operatório imediato é fundamental para determinar as taxas de recorrência do tumor a longo prazo. Assim, as intervenções clínicas em forma de imunoterapias durante este período crítico pode ter benefícios substanciais de longo prazo. Os nossos estudos usando um mouse modelo de metástase pulmonar espontânea e estresse cirúrgico oferecem uma oportunidade única para explorar novas terapias e determinar seu potencial para prevenir a imunossupressão perioperatório em pacientes de cirurgia de câncer e assim também reduzir as taxas de recorrência do câncer.

A cirurgia é um componente crítico no tratamento do cancro curativo de tumores sólidos, mas apesar da ressecção completa, muitos pacientes desenvolvem uma recidiva metastática e por fim a morte da sua doença. Cada vez mais, o período pós-operatório, como um resultado da resposta ao stress fisiológico para a cirurgia, incluindo a coagulação do sangue, a libertação de factores de crescimento, e a supressão imunitária, é reconhecido que o tempo crítico para o desenvolvimento de metástases. O nosso grupo 1,2 e 3-5 outros têm mostrado que o período pós-operatório imediato é um tempo excepcionalmente susceptíveis para a formação de metástases. Um dos principais mecanismos responsáveis ​​pelos efeitos prometastatic da cirurgia é a disfunção pós-operatória de células natural killer (NK), as células 1-3. As células NK são linfócitos citotóxicos do sistema imune inato envolvida no controle do crescimento de tumores e metástases 6. A disfunção de células NK após a cirurgia tenha sido documentada in tanto pacientes humanos 1,7-9 e modelos animais 1,10,11. Supressão de células NK no pós-operatório se correlaciona com o aumento das metástases em modelos animais de metástases espontâneas e implantados 1,11-14, enquanto que em estudos com humanos, baixa atividade NK durante o período perioperatório está associada a uma maior taxa de recorrência e mortalidade 15,16 câncer. Apesar disso, não existem actualmente terapias contra o câncer que abordam especificamente as alterações prometastatic que ocorrem imediatamente após a cirurgia de câncer. O período perioperatório representa uma janela terapêutica de oportunidade em que para intervir no processo metastático. Enquanto as terapias do cancro tradicionais, tais como a quimioterapia citotóxica, são consideradas demasiado tóxico para ser administrado a doentes em recuperação de uma cirurgia 17, terapias imunológicas são candidatos ideais para a administração perioperatória. Utilização perioperatória de recombinante IL-2 e IFN-y foram exploradas in fase inicial de ensaios clínicos que demonstram seu potencial para evitar a supressão de células NK no pós-operatório e melhorar a sobrevida livre de progressão 18-21. Infelizmente, o desenvolvimento tem sido dificultada pela tolerabilidade desta terapia citocina inespecífica combinado com grande cirurgia 17. Os vírus também são potentes ativadores inespecíficos das células NK. A nossa investigação tem demonstrado previamente que a administração pré-operatória de vírus em replicação, como novos medicamentos anti-cancro Oncolíticos Vírus (OV) e nonreplicating vacinas virais, tais como a vacina da gripe, pode inibir a disfunção das células NK induzido pela cirurgia e atenuar a doença metastática 1,22. O modelo cirúrgico descrito neste trabalho tem facilitado a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na propagação e crescimento de células tumorais após a cirurgia e nos permitiu explorar novas terapias alvo que podem ser administradas no período perioperatório. Para atingir esta meta, um animalmodelo de estresse cirúrgico e espontânea maço metástase desenvolvidos. O modelo faz uso de tumores de carcinoma da mama do rato (Balb / c 4T1) - que são capazes de formar metástases espontaneamente a partir da glândula mamaria primária para múltiplos locais distantes, em particular os pulmões. No dia 0, as células de cancro da mama são implantadas no rato almofada de gordura da mama. No dia 14 pós implantação do tumor, a ressecção completa do tumor mamário primário é realizada em todos os animais. Um subconjunto de animais recebe estresse cirúrgico adicional sob a forma de uma nefrectomia abdominal. No dia 28 de nódulos tumorais de pulmão em salientou cirurgicamente e sem controle camundongos cirurgia comparação são isolados e quantificados. Neste modelo animal de cancro e a cirurgia, os efeitos da cirurgia em metástases do cancro são estudadas e a eficácia da administração perioperatória de imunoterapias inovadoras, incluindo a replicação e nonreplicating imunes-estimulantes baseados viralmente são testados para o primeiro tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:111px;">Corning Cell-Gro</td>
			<td style="width:153px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:153px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:111px;">Corning cell gro</td>
			<td style="width:153px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:111px;">Chiron, Guelph</td>
			<td style="width:153px;">RXN309968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:111px;">Baxter Corp</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/2 ultra-fine syringe</td>
			<td style="width:111px;">Terumo</td>
			<td>30 Gauge, SS05M3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">9mm staples</td>
			<td style="width:111px;">Braintree</td>
			<td style="width:153px;">ACS BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 braided absorbable suture</td>
			<td style="width:111px;">Covidien</td>
			<td style="width:153px;">UL-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3-0 wax braided silk suture</td>
			<td style="width:111px;">Covidien</td>
			<td style="width:153px;">S-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formalin</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">SF100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4T1 tumor cells</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:153px;">CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BALB/c</td>
			<td style="width:111px;">Charles Rivers Labs</td>
			<td style="width:153px;">Strain Code:028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies

A ressecção cirúrgica é um tratamento fundamental para a maioria dos pacientes de cancro, mas a cirurgia induz disfunção do sistema imune e isto tem sido associada ao desenvolvimento da doença metastática em modelos animais e em doentes com cancro. Trabalho pré-clínico do nosso grupo e outros demonstraram uma profunda supressão da função imune inata, especificamente células NK no período pós-operatório e este desempenha um papel importante no desenvolvimento de metástases reforçada após a cirurgia. Relativamente poucos estudos com animais e ensaios clínicos têm-se centrado na caracterização e reverter os efeitos negativos da cirurgia de câncer. Utilizando um modelo animal rigorosa de metastização espontânea tumores e estresse cirúrgico, foi demonstrado o aumento da cirurgia do cancro no desenvolvimento de metástases do pulmão. Neste modelo, as células de cancro da mama 4T1 são implantados na almofada de gordura mamaria do rato. No dia 14 pós implantação do tumor, a ressecção completa do tumor mamário primário é performed em todos os animais. Um subconjunto de animais recebe estresse cirúrgico adicional sob a forma de uma nefrectomia abdominal. No dia 28 de nódulos tumorais de pulmão são quantificados. Quando a imunoterapia foi determinada imediatamente antes da cirurgia, uma profunda activação das células imunes, que inibem o desenvolvimento de metástases após cirurgia foi detectado. Enquanto o modelo de cirurgia do tumor da mama 4T1 permite a simulação dos efeitos de estresse cirúrgico abdominal em metástases de tumores, a sua aplicabilidade a outros tipos de tumor deve ser testado. O desafio atual é identificar immunotherapies seguros e promissores em modelos pré-clínicos de mouse e traduzi-los em terapias perioperatórios viáveis ​​para ser dado aos pacientes de cirurgia de câncer para prevenir a recorrência da doença metastática.

Um modelo reprodutível rato de estresse cirúrgico, que resulta no aumento dramático de metástases pulmonares foi desenvolvido. No dia 28 após a inoculação do tumor 4T1 (e 14 dias após a ressecção do tumor + / - nefrectomia abdominal), os pulmões foram retirados e visualizados por metástases. Cirurgia aumenta claramente a quantidade de metástases pulmonares em comparação com ratos não tratados, como demonstrado por meio de fotografias de pulmão (Figura 1A), contagem de nódulos de pulmão (Figura 1B) e o peso do pulmão (Figura 1C). Administração pré-operatória de replicação do vírus oncolítico e vacina inativada contra influenza resgata significativamente os efeitos prometastatic de cirurgia de câncer (Figuras 1A-C). Para determinar se as células NK desempenham um papel mediador na prevenção de metástases do tratamento pós-vacina, as células NK foram farmacologicamente esgotados usando anti-asialo GM-1 no modelo de metástases de tumores. Na ausência de NKcélulas, observou-se uma anulação do efeito terapêutico de imunoterapias perioperatórios (Figuras 2A e 2B). Estes dados sugerem que a remoção de metástases tumorais em nosso modelo estresse cirúrgico é mediada principalmente por meio de vírus e vacina contra a gripe ativação oncolítico das células NK e NK subseqüente lise tumoral mediada. Para melhor caracterizar a função das células NK após a administração perioperatória de vírus oncolítico e vacina contra a gripe, ex vivo NK morte celular foi avaliada. Resumidamente, agrupados e ordenados DX5 + células NK foram isolados a partir de esplenócitos de cirurgicamente forçado e ratinhos de controlo. Foram co-cultivadas durante 4 horas com crómio marcado YAC-1 de células alvo, em Effector diferentes para atingir proporções, seguido por medição da libertação de crómio sobrenadante com um contador gama. Um defeito significativo cirurgia induzida em citotoxicidade das células NK, juntamente com uma recuperação significativa da NK morte após a administração perioperatória de vírus oncolítico e influenza vacina em comparação com a cirurgia por si só foi observada (Figuras 2C e 2D). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a supressão das células NK perioperatória podem ser tratados com sucesso e doença metastática reduzida com terapias imunoestimulantes novos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> Figura 1. Vacina de vírus influenza e Novel anti-câncer oncolítico como terapia perioperatória contra aumento induzido por cirurgia de metástases pulmonares. Avaliação da 4T1 metástases tumorais de pulmão no dia 28 de grupos de tratamento indicado pela (a) fotografias de pulmões representativos, (B) enumeração de tumor de pulmão nódulos e (C) pesos pulmonares. Os dados são representativos de três experiências semelhantes com n = 5-10/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,0001;<html> ns, não significativo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> Figura 2. Estresse cirúrgico aumenta metástases tumorais pulmonares, ao alterar as células NK. (A, B) Quantificação de metástases de tumores pulmonares em ratinhos salientou cirurgicamente tratados com terapia perioperatória romance. (C, D) A capacidade de DX5 + purificada a partir de células NK cirurgicamente forçado e controlos não tratados, para matar células tumorais. Os dados são apresentados como a percentagem média (+ / - SD) de libertação de crómio de poços triplicados para o E indicada: rácios t. Os dados são representativos de três experiências semelhantes em que n = 4-5/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,005; ns, não significativa)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Um modelo de tumor do rato do estresse cirúrgico é usado para explorar como a imunossupressão pós-operatória promove a doença metastática e avaliar terapias perioperatórios immunostimulatory.

Um tumor modelo de estresse cirúrgico para explorar os mecanismos de pós-operatório Imunossupressão e Avaliar Novel perioperatórios Imunoterapias Rato

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

29.8K visualizações.  Ottawa Hospital Research Institute.  Um modelo de tumor do rato do estresse cirúrgico é usado para explorar como a imunossupressão pós-operatória promove a doença metastática e avaliar terapias perioperatórios immunostimulatory. 

Vídeo: A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Medicina

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused by whole-body hypoperfusion.5,6 Successful reproduction of whole-body hypoperfusion in rodent models has been fraught with 
difficulty.7-9,9,10 Models which employ focal ischemia have repeatedly demonstrated results which do not translate to the clinical setting, and larger 
animal models which allow for whole body hypoperfusion lack access to the full toolset of genetic manipulation possible in the mouse.11,12 However, in recent 
years a mouse model of cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation has emerged which can be adapted to model AKI.13 This model reliably reproduces 
physiologic, functional, anatomic, and histologic outcomes seen in clinical AKI, is rapidly repeatable, and offers all of the significant advantages of a murine surgical 
model, including access to genetic manipulative techniques, low cost relative to large animals, and ease of use. Our group has developed extensive experience 
with use of this model to assess a number of organ-specific outcomes in AKI.14,15

A powerful model for perioperative and critical care related acute kidney injury is presented. Using whole body hypoperfusion induced by cardiac arrest it is possible to nearly replicate the histologic and functional changes of clinical AKI.

Cardiac Arrest normotérmica e Ressuscitação Cardiopulmonar: um modelo do rato de isquemia-reperfusão

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Desenvolvimento de um Unilateralmente-lesionadas modelo de rato 6-OHDA da Doença de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

Um Modelo murino Novel de Fístula Arteriovenosa Falha: O procedimento cirúrgico em Detalhe

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...