A American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / A Associação Americana do tumor cerebral, ea Família Khan Fundação para eu Nakano.

1. Preparação dos meios de comunicação <ol><li> A mídia foi preparado com 10% FBS (16140-071 - GIBCO) em DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) com solução de Agar 0,6% purificada, Granulado (1.01614.1000-EMD ). Condições estéreis foram mantidos durante todo o experimento. </li><li> Para a preparação dos meios de comunicação 5mL de FBS (16140-071 - GIBCO) foi adicionado em 45ml de DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen), tornando volume final de 50ml. A mídia preparado foi mantido em banho-maria a 37 ° C de temperatura. </li><li> A solução de ágar foi preparado pelo método de micro-ondas de calor. 0,3 gramas de ágar granulado foi dissolvido em 50 mL de água destilada usando microondas. A solução de ágar foi esfriar a 37 ° C de temperatura, mantendo-o em banho-maria. </li><li> Usamos volume igual de mídia a partir do passo 1.2 e 1.3 e solução estoque preparada. A proporção de agar 0,6% (0,5 ml) e 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 mL) foi de 1:1, fazendo o volume total de 1 mL em cada poço de 6 placas bem. </li></ol> 2. Processamento de tecidos <ol><li> Glioblastoma multiforme (GBM) os tecidos foram recebidos imediatamente após a cirurgia do Departamento de Patologia. O tecido foi classificada como GBM do Departamento de Patologia. </li><li> O tecido foi transferido para o patri-placa com a pinça com cuidado e lavados com 1XPBS gelada 5mL por 3 vezes. </li><li> Cortes seriados dos espécimes foram cortados a partir das amostras dissecadas para criar blocos de tumor (aproximadamente 10 mm de diâmetro) com uma lâmina cirúrgica (Feather-2976 # 10) e fórceps (Fisher Scientific). </li><li> Blocos foram transferidos para uma placa de 6 bem. Cada poço foi 1mL contendo de mídia mencionar no passo 1.4. O tecido tinha exposição suficiente para o ar para manter o tecido viável. </li><li> Blocos de tumor foram injectados com ou DMSO (5%) ou TMZ (2,5 nM) e incubados por 16 horas a 37 ° C no ar umidificado contendo 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) ou TMZ foi injetada três vezes em blocos de tumor em lugares diferentes para o tratamento consistente. A droga foi injetada com seringas de insulina 1mL 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort ponto 26.027). </li><li> Após 16 horas blocos foram lavados com 5 mL 1XPBS por 3 vezes. Depois de lavar os blocos foram fixados com 10ml de 10% v / v de formalina por 24 horas (Ricca empresa de produtos químicos) em tubos de 50 ml (Basix-5539802) e processados ​​para inclusão em parafina 4μm seções. </li><li> A seção de formol fixa foi colocada em copo sobre a placa de mexer com o &quot;HEAT NO&quot; e processadas através das seguintes soluções por 30 minutos em cada solução. Etanol 30%, etanol a 50%, etanol 75%, etanol 80%, 95% de etanol, o etanol 100%, e xileno. </li><li> O tecido foi apagado em toalhas de papel e colocados em parafina derretida (58 a 60 ° C, Fisher parafina Paraplast) por 30 minutos. </li><li> O tecido foi incluso em moldes de parafina usando Surgipath Blue Ribbon, o tecido embutida foi resfriado a temperatura ambiente. </li><li> Incluídos em parafina secções de tecido 4μm foram tomadas e colocadas em lâminas de Fisher Plus. </li></ol> 3. Imuno-histoquímica Imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente 1. <ol><li> Desparafinização e reidratação Coloque os slides em um rack e executar os passos seguintes. Xileno por 3x5 minutos (3 vezes por 5 minutos), etanol 100% por alguns minutos 3x5, o etanol 95% por alguns minutos 1x5, o etanol 70% por alguns minutos 1x5, enxágüe em água corrente por 3 minutos. </li><li> Recuperação antigênica com calor induzido epítopo slides recuperação Mergulhe em tampão citrato 1X (Thermo científico-AP9003-500) diluído em água destilada num copo de vidro. Ferver durante 15 minutos em um prato quente (certifique-se seções don &quot;t cair do slide). Solução esfriar por 30 minutos em temperatura ambiente. Lavar as lâminas com PBS 1X para 3x5 minutos. </li><li> Inibição de peróxido interna Mergulhar as lâminas em metanol (Fisher Scientific-A-452-4) com peróxido de hidrogênio 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluído em água destilada) em um copo de vidro durante 15 minutos. Enxágüe em 1X PBS para 3x5 minutos. </li><li> Cubra o bloqueio tecidos com soro de cabra 10% normal. Transferir os slides em uma caixa úmida e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lavar as lâminas com PBS 1X para 3x5 minutos. </li><li> Seções anticorpo primário foram incubadas overnight a 4 ° C com o anticorpo primário em concentrações seguintes: caspase-3 humana específica (1:1.000, R &amp; D de sistemas, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluído com PBS 1X. Enxágüe as lâminas em PBS 1X minutos 3x10 no dia seguinte. </li><li> Reação anticorpo secundário Cubra os tecidos com 2-3 gotas de HRP anticorpo marcado secundário (envision sistemas). Colocar slides em uma caixa úmido e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lavar com PBS 1X para 3x10 minutos. </li><li> Detecção de desenvolver para o DAB cromógeno kit (Vector laboratórios-SK-4100) para detecção do anticorpo primário seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Mergulhe a coloração contra slides com hematoxilina (10-15 s<html> egundos, certifique-don &quot;t overrun DAB sinal). Lavar com água corrente por 3 minutos. </li><li> Mergulhe a desidratação os slides em ordem a seguir, o etanol 70% por 5 minutos, etanol 95% por 5 minutos, o etanol 100% por alguns minutos 3x5, 3x5 para Xileno minutos. </li><li> Tampa de deslizamento das lâminas com o reagente de montagem Permount (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Imagens foram obtidas utilizando microscópio de fluorescência Olympus (DP-72) .3.11). Em todos os experimentos, rotulagem específica foi confirmada pelo controle negativo, sem o anticorpo primário. </li></ol> 4. Resultados representativos: Foram coletados espécimes cirúrgicos de glioblastoma multiforme (GBM). Os pacientes foram submetidos a primeira cirurgia sem quimioterapia prévia, incluindo temozolomida (TMZ). A imagem ponderada em T1 da RM com contraste gadolíneo na figura-1a demonstrou um tumor reforçada no lobo frontal direito antes da cirurgia. A imagem no pós-operatório (Figura 1b) confirmou a remoção subtotal da lesão após a cirurgia. Os tecidos cirúrgicos foram enviados para o Departamento de Patologia para o propósito diagnóstico clínico, e as amostras restantes foram processadas para a colheita de tecidos sob o Conselho de Revisão aprovada Institucional (IRB) protocolo na Ohio State University Medical Center. Hematoxilina e eosina (H &amp; E) demonstraram a presença de necrose, células pseudopallisading e microvascular proliferação (Figura 1-c). Assim, esses tumores foram diagnosticados como histopatologicamente GBM. De nota, explantes tumor após incubação sem TMZ até 48 horas manteve a citoarquitetura do GBM. Em contraste, com incubação por 72 horas ou mais, percebemos o aumento do número de núcleos de condensação na amostra, sugerindo algumas das células do tumor de partida para apoptose. Como resultado, os tecidos do tumor após mais de incubação continha regiões irregulares que perdeu as células tumorais, que foram observadas preferencialmente e em torno de áreas de necrose (dados não mostrados). A fim de investigar se estas amostras explante do tumor pode ser utilizado de forma confiável com a finalidade de testar a eficácia da droga, testamos o efeito do tratamento TMZ. A Figura 2 representa o fluxo das experiências neste estudo. Um estudo recente indicou que a injeção intratumoral de TMZ tem um efeito mais potente no controle de crescimento de glioma maligno do que a administração sistêmica da droga 2. Após a incubação por 16 horas, esses explantes foram incorporados com parafina e cortes seriados foram preparados para a coloração. Imuno-histoquímica dos tecidos tratados com TMZ GBM demonstrado uma redução substancial de células Ki-67 positivo tumor em comparação com as amostras de controle. Por sua vez, imuno-histoquímica com um marcador de apoptose, Caspase-3, não deu qualquer diferença significativa entre os espécimes tratados com TMZ glioma e as amostras controle (Figura-3). Efeito do tratamento com TMZ foi ainda caracterizada pela combinação explante este ensaio em conjunto com qualquer cultura in vitro ou citometria de fluxo. Especificamente, buscou-se determinar o efeito sobre células-tronco como as células do tumor (SCLTC). Portanto, após o tratamento intratumoral com TMZ, foi realizado ensaio de esfera formando e citometria de fluxo destes explantes tumor. Os espécimes foram tratados com TMZ dissociada em células individuais única e estas células isoladas foram semeadas em uma densidade baixa (uma células por microlitro ou menos) em placas de 96 poços no soro livre de meio suplementado com bFGF e EGF. No grupo controle, a formação de esferas de tumor do tumor explantes foi observada após sete dias de incubação. Dado que a formação de esfera é uma propriedade da SCLTC 3 4, alterações no número de esferas por um tumor de tratamento da toxicodependência indica o efeito sobre SCLTC. Da mesma forma, a citometria de fluxo dos explantes tumor dissociado com um marcador de superfície celular, CD133, foi realizado para verificar o efeito sobre SCLTC. Se SCLTC nas células tumorais em GBM heterogêneos são seletivamente erradicados por um tratamento medicamentoso, pode-se prever que a citometria de fluxo deve detectar diminuição da fração CD133 positivo pelo tratamento (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura.1 imagens de ressonância magnética (MRI) de um GBM paciente. Figuras representativas de pré-operação Figura 1a-e pós-operação Figura 1b. Figura 1c é H &amp; E de coloração de amostra fresca GBM tecido. Ampliação original, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura. 2 O fluxo experimental do experimento cultura bloco. Figura 2a. Imagem do GBM cirúrgica fresca recebeu do departamento de patologia. Figura 2b mostra Dissecção do bloco de tumor em 10 milímetros pequenos pedaços com a lâmina ajuda cirúrgico. Figura-2c é a droga de tratamento (TMZ) de blocos de tumor usando seringa de insulina. e 3 &quot;/&gt; Figura. 3 Imunohistoquímica. Imunohistoquímica de blocos de tecido GBM injetados com DMSO ou TMZ com ativadas Caspase-3 e Ki67. Hematoxilina foi usado para a coloração nuclear. Ampliação original, 40X.

<ol>
	<li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors.">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li><li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats.">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li><li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors,+including+brain+tumor+stem+cells.">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li><li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma.">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis,+delineate+a+pattern+of+disease+progression,+and+resemble+stages+in+neurogenesis.">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li><li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation.">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li><li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines].">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li><li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions.">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li><li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells.">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li><li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab:+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice.">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existe uma lacuna entre a eficácia da droga na corrente modelos pré-clínicos e experimentais a eficácia em pacientes. Mais especificamente, no campo da pesquisa de tumor cerebral, novos métodos e confiáveis ​​são necessárias que ajudariam preencher a lacuna existente entre a avaliação de drogas com os métodos atuais ea eficácia em pacientes. O ensaio descrito neste estudo é um recurso adicional, se não uma solução, para facilitar o preenchimento da discrepância dos dados experimentais e os resultados dos pacientes acometidos. Em culturas de células in vitro preferencialmente expandir certos tipos de células tumorais independentemente das condições de cultura, e representam apenas uma subpopulação de todo o tumor. 5 Além disso, transformação genética e fenotípica da célula artificial de expansão ocorre e é inevitável com as culturas de longo prazo de células . Um dos principais obstáculos para o tratamento de glioma maligno é a heterogeneidade das células tumorais, tanto dentro de um único tumor e entre amostras de tumor 6, 7. Portanto, o enriquecimento seletivo de uma determinada população de células tumorais, independentemente de um tipo ou outro, não pode ser um meio adequado para determinar a eficácia de quaisquer agentes quimioterápicos sobre células tumorais heterogêneos. 8 9 modelo Qualquer animal de tumores cerebrais derivadas de uma subpopulação de células tumorais lançar luzes sobre a eficácia da droga em uma subpopulação, mas não todo o tumor. Várias limitações, por outro lado, ainda permanecem neste método explante tumor. Uma tal limitação é o período relativamente curto de tratamento. Uma vez que células de tumores malignos são considerados para adquirir resistência para a maioria, senão todas, as terapias ao longo do tempo, o controle inicial do crescimento de células tumorais de curto prazo pode não ser reflectida pelo prognóstico do paciente a longo prazo, como foi relatado recentemente com um anti- angiogênico agente, 10 bevacizumab. Assim, a melhoria do protocolo para este ensaio explante para preservar tecidos por um longo período é necessário com outras investigações. Outra questão é um efeito específico de um medicamento testado em SCLTC no tumor. Dado que SCLTC são relativamente resistentes às terapias atuais para glioma maligno, identificação de novos medicamentos anti-cancerígenos que potently erradicar SCLTC se justifica. A este respeito, que atualmente procuram combinar este ensaio explante com a subseqüente em experimentos in vitro, tais como ensaio formando neurosphere (dados não mostrados). Esperamos para saber mais sobre os efeitos, se houver, de um candidato de drogas em SCLTC através destes ensaios combinados. Por fim, usando pequenos blocos de amostras de tumor pode não refletir a população de células inteiras tumor, como é o caso com as linhas convencionais tumor de células ou culturas primárias de espécimes cirúrgicos. Estas questões de lado, preservando estroma tumoral, incluindo o nicho vascular, é útil na caracterização dos fatores ambientais para as células do tumor. Portanto, este ensaio pode ter potencial para avaliar qualquer estratégias terapêuticas sob uma condição mais fisiologicamente relevantes. Aqui, nós estabelecemos um ensaio para testes de drogas com eficácia explantes de espécimes cirúrgicos de GBM. Na verdade, com os espécimes testados cirúrgica, descobrimos que uma injeção direta de TMZ reduz a proliferação nas amostras de GBM. Este método de explantes de tecido é teoricamente aplicável a outros tumores sólidos e fornece ativo para determinar a eficácia da droga sobre o tumor de um paciente, que esperamos nos ajudar a evitar um novo fracasso em ensaios clínicos para o câncer.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino, qualificados, inativado pelo calor </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Líquido 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar Agar-purificada, Granulado </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS para a coloração </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Richalrd allan sci </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% Caspase-3 w / v formol </td><td> Ricca empresa química </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspase-3 </td><td> R &amp; D de sistemas </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-rato </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-coelho </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabela 1. Materiais. <table border="1"><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 6 Placa Bem </td><td> Greiner bio-um </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Placa de Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Sorológicos pipeta </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Pontas com filtro </td><td> EUA científica </td><td></td></tr><tr><td> 500 mm de malha de poliéster NetWell inserir </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml BD </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Hipodérmica Hub alumínio agulha. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecidos </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Finos tubos de parede </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Lâmina de aço inoxidável cirúrgico </td><td> Pena </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Seringa de insulina </td><td> Ponto de conforto </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50mL tubo de tampa plana tampa de rosca </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Pinça </td><td> Fisher Sci </td><td></td></tr></table> Equipamentos tabela 2..

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

As terapias atuais para glioma maligno têm apenas efeito paliativo. Para o desenvolvimento de terapêuticas, um obstáculo é a discrepância de eficácia determinada por testes de drogas atual eficácia ea eficácia em pacientes. Assim, novos métodos e confiável para avaliar a eficácia da droga estão garantidos na fase pré-clínica. Na cultura in vitro de tecidos tumorais, incluindo linhagens de células, tem substanciais alterações fenotípicas, genéticas e epigenéticas de células de câncer causado pelo ambiente artificial de cultura de células, que podem não refletir a biologia dos tumores originais in situ. Modelos de xenoenxerto com os ratos imunodeficientes também têm limitações, isto é, a falta de sistema imunológico e interespécies discrepâncias genéticas e epigenéticas no microambiente. Aqui, nós demonstramos um novo método usando a espécimes cirúrgicos de glioma maligno como blocos de tumor não dissociado para avaliar os efeitos do tratamento. Para validar este método, os dados com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida (TMZ), são descritos. Utilizou-se o espécime recém-removido cirúrgico de gliomas malignos para nossos experimentos. Realizamos a injeção intratumoral de TMZ ou candidatos de outras drogas, seguido de incubação e análises sobre espécimes cirúrgicos. Aqui, procurou-se estabelecer um método de explante tumor de tecido como uma plataforma para determinar a eficácia de novas terapias anti-câncer para que possamos ser capazes de superar, pelo menos, algumas das limitações atuais e preencher o hiato existente entre o experimental atual dados ea eficácia em tumor de um paciente real. Este método pode ter o potencial de acelerar a identificação novos agentes quimioterápicos para tratamento de câncer sólido.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Aqui, nós estabelecemos um método para testar a eficácia de drogas com espécimes cirúrgicos dos tumores cerebrais, denominado &quot;método de explante tumor&quot;. Com este método, podemos avaliar a eficácia da droga, sem quebrar o microambiente de tumores sólidos. Para validar a confiabilidade deste método, descrevemos dados representativos com nosso exemplar glioma tratadas com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida.

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K visualizações.  The Ohio State University Medical Center. Aqui, nós estabelecemos um método para testar a eficácia de drogas com espécimes cirúrgicos dos tumores cerebrais, denominado "método de explante tumor". Com este método, podemos avaliar a eficácia da droga, sem quebrar o microambiente de tumores sólidos. Para validar a confiabilidade deste método, descrevemos dados representativos com nosso exemplar glioma tratadas com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida.

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Medicina

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

Análise de Transcriptoma Humanos espécimes cirúrgicos retina utilizando Jornal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Um tumor modelo de estresse cirúrgico para explorar os mecanismos de pós-operatório Imunossupressão e Avaliar Novel perioperatórios Imunoterapias Rato

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

Um Modelo murino Novel de Fístula Arteriovenosa Falha: O procedimento cirúrgico em Detalhe

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Um tumor cerebral / Slice organotípicas Co-cultura Sistema de Estudos de Tumor Microenvironment e alvejado droga Terapias

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.