We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

Protocolos experimentais foram realizados em ratos fêmeas Long Evans (250-350 g), em conformidade com as orientações de cuidados de animais e utilização federal prescritos e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Califórnia em San Diego. 1. Acclimating do Rato para o Corpo Restraint NOTA: Coloque o rato em uma dieta restrita. Alimente o rato uma vez por dia, imediatamente após cada sessão de manejo diário para aclimatar o rato para o sistema de retenção (descrito abaixo). Fornecer alimentação suficiente para manter o animal em 80% do seu peso inicial. Este montante é de aproximadamente 6 gramas de ração por dia para um 250 g feminino longo Evans rato. <ol><li> Aclimatar o rato a ser manuseados por humanos. Gentilmente conter o rato com a mão por períodos de cerca de 5 segundos a cada 30 seg. Faça isso por 15 min por dia em dois dias consecutivos. Monitorar os ratos diariamente para sinais de estresse durante o período de treinamento. Os sinais incluem lutando in resposta à contenção, vocalização e dente-vibração. </li><li> No dia 3 rd, colocar o rato em uma peúga pano de restrição do corpo (Figura 1), durante 15 minutos por dia em dois dias consecutivos. </li><li> No 5º dia, colocar o rato dentro da meia, e colocar a meia no interior de um tubo rígido no jig experimental (Figura 4). Deixe o rato no tubo durante 15 min por dia em dois dias consecutivos. </li><li> Alimente o rato imediatamente após cada sessão de treino. No final da última sessão (6 ° dia) dar acesso restrito ao alimento. Selecione para implantação apenas os ratos que não mostram sinais de estresse excessivo no último dia de treinamento. NOTA: Embora selecção de ratos para implantação é subjectiva, nas nossas mãos, mais de 90% dos ratos foram encontrados para ser responsivo a habituação e capaz de se submeter a implantação. </li></ol> 2. Implantação do Mecanismo de gravação Câmara e dos apoios de cabeça <ol><li> Adicione uma refio Conferência soldando fios de aço inoxidável nua para um conector de pino. Corte o fio de modo que 3-5 mm restos descobertos pelo pino. Autoclave o fio de referência, juntamente com todos os instrumentos cirúrgicos. </li><li> Administrar cetamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de cetamina misturados com 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente. A dose inicial dura 1½ a 2 horas. Suplemento da anestesia cada 30-45 min depois disso, quando necessário. Lubrificar os olhos do animal com uma pomada oftálmica. </li><li> Verifique o reflexo de retirada do dedo do pé para determinar o plano de anestesia, e manter a anestesia, se necessário. </li><li> Coloque o rato em uma armação de retenção estereotáxica com barras de ouvido (Figura 3A). Raspar o cabelo na cabeça e desinfectar o local do ferimento com iodopovidona (solução a 10%). Tome cuidado para inserir as barras de ouvido de forma apropriada para que eles não danificar o tímpano. Barras de ouvido com pontas contundentes são preferíveis. </li><li> Faça uma incisão com um bisturi aproximadamente ao longo da linha média do crânio a partir do nível rostro-caudal dos olhos para a parte de trás das orelhas. Utilize uma tesoura para cortar e remover uma tira de 2-3 mm de pele em ambos os lados da incisão. </li><li> Raspe o periósteo para expor a superfície do crânio até as nervuras laterais. Cubra o crânio exposto com fina camada de supercola. </li><li> Faça um furo pequeno, com um diâmetro ligeiramente menor do que 0-80 parafusos, usando uma broca burr ½ mm de diâmetro (ver secção de Materiais). Perfurar o furo imediatamente posterior ao bregma, onde a sutura se encontra com o cume lateral, e a um ângulo de 30-45 ° na cavidade craniana, de modo que o parafuso pode entrar com o topo mais lateral do que o fundo. </li><li> Parafuso em um parafuso 0-80 máquina de fundo plano para o buraco (aproximadamente 3 voltas), a 30-45 ° ângulo. Tenha cuidado para não enroscar muito profundamente para evitar danificar o tecido cerebral subjacente. </li><li> Repetir este procedimento para 6 parafusos adicionais na configuração mostrada <strong&gt; (Figura 3B). Aplicar supercola para a base de todos os parafusos. </li><li> Coloque uma agulha da seringa no manipulador stereotax. Medida a partir da sutura bregma, e fazer um dente no crânio com a agulha perto, mas fora do local de craniotomia desejado, como uma marca de referência. NOTA: Nesta demonstração, as coordenadas estereotáxica da marca são de 3 mm posterior e 1 mm de laterais à sutura bregma. </li><li> Marque o dente com um marcador permanente. Observe as coordenadas estereotáxica da marca, uma vez que irá servir como um ponto de referência estereotáxico (Figura 3B). </li><li> Adicione uma craniotomia centrada nas coordenadas desejadas (de 3 mm posterior e 3 mm lateral ao bregma, neste exemplo). Deixar a dura-máter intacta. Cobrir a craniotomia com fluido cerebrospinal artificial modificado (NaCl 125 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM de CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Corte um tubo de 0,2 ml de centrífuga de 4-5 mm de comprimento, e cortou a tampa. Colocar o tubo no crânio e centralizá-lo sobre a craniotomia. </li><li> Aplicar cimento dentário em torno da parte inferior do tubo, para vedar a base do tubo para o crânio. Tenha cuidado para não vazar cimento na craniotomia exposta (Figura 3D). </li><li> Perfurar um outro furo pequeno (cerca de ½ mm de diâmetro) na placa cranial contralateral e insira cuidadosamente o fio de referência. Construir o fio de soldar de referência por um pino que serve de interface com o amplificador de gravação para a extremidade do fio (ver secção Equipamento). Não mova o fio de referência, uma vez que está no cérebro, pois isso pode causar danos. </li><li> Aplicar supercola para o orifício em que o fio foi inserido. Isto irá selar o pino e fio no lugar temporariamente. </li><li> Misturar as duas partes do kit de gel de silicone (ver secção de Materiais) em porções aproximadamente iguais. Aguarde dois minutos para misturar e fill do tubo de centrifugação aproximadamente ⅓ completa com gel. </li><li> Anexar um direito braçadeira pós ângulo (ver secção de materiais) para a barra de apoio de cabeça. Fixar a placa de cabeça (Figura 2A) para a barra de retenção (Figura 2B) a um ângulo de 45 ° passo de modo que o fundo da placa está voltada para o nariz do animal. É útil utilizar um ângulo de inclinação para o ângulo de inclinação definido para coincidir com o dispositivo de montagem experimental (Figura 4). </li><li> Fixe o bar exploração para o braço stereotax manipulador para que a barra é paralela às barras de ouvido. Abaixe a barra e placa para que o prato é posterior da sutura lambda e anterior ao caudal-mais parafuso. </li><li> Segure a cabeça do parafuso da frente (8-32 um perno ou parafuso, consulte a secção de Materiais) a cerca de 45 ° de ângulo com um braço e mãos braçadeira de ajudar, de modo que a cabeça do parafuso está voltado para baixo e para a cauda do animal. Abaixe o parafuso para que ele toque a formigaerior 0-80 parafusos (Figura 3F, G). </li><li> Fixe o parafuso e placa no local com acrílico dental. Aplicar acrílico dental em torno das cabeças dos parafusos de osso, pinos de referência, e em torno dos lados do tubo de centrifugação. Espera aproximadamente 10 min para o acrílico dental para secar (Figura 3H). </li><li> Aplicar uma camada de cimento dentário em torno das bordas do acrílico dental, solidificando a pele para o implante. Aguarde até que o cimento secar. </li><li> Pique vários furos na tampa do tubo de centrifugação, e coloque a tampa sobre o tubo. </li><li> Retire a ajudar as mãos grampo. Em seguida, retire cuidadosamente o bar-segurando a cabeça do stereotax, e, em seguida, retire a placa de cabeça a partir da barra (Figura 3I). </li><li> Retirar o animal da stereotax e administrar cuidados pós-operatórios e controlo, em conformidade com todas as regras, regulamentos e leis aplicáveis ​​(por exemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, a cada 8-12 horas para um mínimo de 24h). Se a inflamação se desenvolve em torno das bordas do implante, aplica uma camada fina de pomada antibiótica ao local afectado diariamente até resolvido. </li></ol> 3. Monitoramento Juxtacellular de Unidades Neuronal <ol><li> Puxar quartzo tubo capilar sobre uma micropipeta laser de dióxido de carbono puxador (ver secção Equipment) com diâmetros de ponta inferior a 1 mm (Figura 5A). NOTA: os parâmetros de aquecimento irá variar de acordo com o instrumento em particular, e que o diâmetro do pescoço requerida irá variar dependendo da estrutura do cérebro de interesse. Para gravações em tálamo rato, micropipetas têm pescoços vão 5-7 mm. </li><li> Fixe a pipeta no lugar sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC), equipado com objetivos longa distância de trabalho. Use massa de modelar para segurar a pipeta no lugar no palco do microscópio. </li><li> Mover-se lentamente um bloco de vidro (0,5-1 cm de espessura; um pedaço de vidro usado para making facas ultra micrótomo é conveniente) para dentro do campo de visão com a ponta da pipeta. Usando o micromanipulador fase, tocar suavemente a ponta da pipeta para o vidro, quebrá-la. Repita quantas vezes for necessário até que o diâmetro externo da ponteira é entre 1-3 mm (Figura 5B, C). Certifique-se de que estes micropipettes têm impedâncias entre aproximadamente 5-15 mohms. </li><li> Preparar solução salina extracelular (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,2 com NaOH) e adicionar 2 8% (w / v) de Chicago céu azul. Usando uma seringa com uma agulha de 30 G ou menor, preencher a extremidade traseira da pipeta com a solução. Alternativamente, para rotulagem juxtacellular célula única adicionar 2% (w / v) Neurobiotin ou amina dextrano biotinilado (BDA-3000 ou BDA-10000) para a solução salina em vez de Chicago céu azul. </li><li> Coloque o rato dentro da meia pano dentro do tubo rígido em um jig experimental adequado ( <strong&gt; Figura 4) .Wait um mínimo de 72 horas após a cirurgia, antes de colocar o animal no gabarito dos apoios de cabeça. Apertar o cordão em torno do esterno superior, ao invés do pescoço, para evitar a obstrução das vias aéreas. Se a respiração parece ser trabalhado ou obstruída, solte o cordão ou movê-lo posteriormente. Realizar este procedimento enquanto o rato está alerta. </li><li> Fixar a placa de cabeça-de restrição sobre o rato para a peça correspondente no gabarito. Para fazer isso, primeiro pino da placa dos apoios de cabeça no lugar e, em seguida, prenda-o com um parafuso 4-40. Certifique-se de esperar até que o animal é calma, a fim de evitar a aplicação de força excessiva na cabeça. Em seguida, coloque uma porca 8-32 no parafuso de retenção da cabeça que é implantado no rato. Então parafuso em uma haste de aço inoxidável com rosca para a cabeça do parafuso. Apor a haste para o dispositivo de montagem experimental, de tal forma que ele pode ser apertado no lugar (Figura 4). NOTA: Protegendo o animal com a cabeça do parafuso, bem como o dos apoios de cabeça placa minimizes flexão do aparelho de gravação e melhora a estabilidade. Na maioria dos casos a gravação poderá ser iniciada no primeiro dia o animal está contido-cabeça. No entanto, se o animal fidgets excessivamente ou vocaliza, proporcionar um dia de treinamento de habituação dos apoios de cabeça antes de começar qualquer gravação. Neste caso, deixe o animal no gabarito durante 15 minutos e, em seguida, colocá-lo de volta em sua gaiola. Repita este passo o dia seguinte e continuar com o protocolo. </li><li> Abra a câmara de gravação e retire o gel de silicone. Limpe a craniotomia usando uma pinça fina se o tecido tem re-cultivadas na craniotomia. </li><li> Fixe a pipeta para o micromanipulator motorizado, e conecte o headstage pré-amplificador. NOTA: No presente demonstração, um pequeno circuito de relé da headstage é usado para alternar entre os fios amplificador de chumbo e uma fonte de corrente externa com alta conformidade (Figura 6A-C). Note que alguns amplificadores têm um adequado built-in fonte cumprimento alta(Ver secções de discussão e de Materiais). </li><li> Usar o micromanipulador motorizado para deslocar a ponta da pipeta para a marca estereotáxicamente identificado na câmara de gravação. Observe as coordenadas desse local. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da pipeta no crânio. </li><li> Mova a pipeta para o local de gravação desejado nos eixos ântero-posterior e médio-lateral. Em seguida, avançar o ventralmente pipeta através da dura até que ele é de aproximadamente 500 mm dorsal para o local de gravação pretendida. </li><li> Avance lentamente a pipeta enquanto escuta para spiking eventos em um monitor de áudio da tensão amplificada gravado entre a ponta da pipeta e o fio de referência. Uma vez que eventos spiking são identificados, continuam a mover-se a pipeta de 0-100 mm até desvios positivos de tensão vai superiores a cerca de 500 mV são observados. NOTA: A resistência do eletrodo vai aumentar em um fator de aproximadamente 1,5-10 when esta ocorre. </li><li> Começar a gravar uma vez por unidade foi isolado como segundo passo 3.11, junto com todas as outras medidas comportamentais e fisiológicas de interesse. No presente demonstração, movimentos Vibrissa auto-geradas são monitorados com videografia de alta velocidade (ver secção de Materiais). </li><li> Para marcar o local de gravação, mude o eletrodo leva para se conectar à fonte de corrente. Existem várias maneiras de fazer isso, usando um circuito de relê (Figura 6A - C), um built-in fonte de corrente no amplificador, ou manualmente (Figura 6D, veja o passo 3.8 e Discussão). Passe -4 mA com 2 pulsos seg a 50% ciclo de trabalho para 4 min para injetar iontoforéticamente Chicago céu azul através da pipeta. </li><li> Matar e aspergir o animal depois de vários procedimentos de rotulagem de acordo com a prática habitual. Seção do cérebro e counterstain como necessários para identificar a localização anatômica da gravação sentare. Contracorante o tecido para o citocromo-oxidase reatividade como por 14. Alternativamente, identificar os depósitos Chicago Sky azuis usando microscopia de fluorescência. NOTA: Para diferenciar com precisão entre as diferentes unidades etiquetadas, é importante que todos os rótulos são feitos com a mesma pipeta no mesmo dia, sem desclampeamento a pipeta entre as etiquetas. Neste caso, locais de gravação podem ser diferenciados por suas localizações relativas em histologia post-hoc, juntamente com as coordenadas do manipulador notáveis ​​de cada local (veja o passo 3.9). Para a identificação inequívoca, marcar os rótulos, pelo menos, 200 mm separados um do outro, e não mais de 3-5 etiquetas por região do cérebro. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A construção do gabarito experimental A descrição dos componentes mecânicos utilizados para construir o dispositivo de montagem experimental (Figura 4) é omitida a partir do protocolo, uma vez que pode ser construído numa variedade de maneiras. Neste padrão demonstração opto-mecânico peças e braçadeiras de apoio são usados ​​para montar o bar apoio de cabeça e do tubo de retenção corporal (ver secção de Materiais)...

Monitorando a atividade neuronal em um animal alerta ativamente engajados em uma tarefa comportamental é fundamental para a compreensão da função e organização do sistema nervoso. Gravação extracelular da atividade elétrica das unidades neuronais individuais tem sido um instrumento básico da neurociência sistemas e ainda é amplamente em uso no momento. Uma variedade de tipos de eletrodos e configurações estão disponíveis, dependendo das exigências científicas e técnicas de uma experiência particular. Cronicamente implantado microdrives ou conjuntos de eléctrodos são frequentemente utilizados em animais que se deslocam livremente, incluindo aves, roedores e primatas não-humanos 1-4. Alternativamente, penetrações agudos com metal ou vidro microeletrodos através de um micromanipulator externa são frequentemente usados ​​para gravar a partir de animais anestesiados ou restringido-cabeça. Eléctrodos de micropipeta de vidro tem a vantagem de que eles podem ser usados ​​na juxtacellular ou &quot;célula ligada&quot; configuração de isolar de forma inequívoca oatividade de neurônios individuais sem as complicações de pico post-hoc de classificação 5. Estes eléctrodos permitem gravar mais a partir de células ou locais identificados-anatomicamente, como elas podem ser usadas para injectar pequenos depósitos de corantes ou marcadores neuroanatómicos, ou ainda para preencher o indivíduo gravado célula. Esta configuração tem sido aplicado com sucesso em ratos, murganhos e aves 6-10. A técnica descrita atualmente se concentra em monitoramento juxtacellular e depósitos do corante extracelulares em alerta, ratos conteve-cabeça. Note-se que ao contrário única célula juxtacellular enche, esses depósitos de corante não fornecem informações sobre a morfologia celular ou projeções axonais 11, mas permitir a localização anatômica exata para cerca de 50 mm e, criticamente, têm um rendimento significativamente maior nos animais de alerta. Informações sobre unicelular juxtacellular enche não deixa de ser fornecido como uma estratégia alternativa para a rotulagem anatômica. Em breve, oprotocolo consiste em três grandes fases. Na primeira fase, o rato é aclimatados ao corpo de retenção de uma peúga pano (Figura 1) ao longo de um período de 6 dias. Na segunda fase, um aparelho de apoio de cabeça (Figura 2) e câmara de gravação são cirurgicamente implantado de modo a que o rato pode ser mantido no plano estereotáxica durante várias sessões de gravação subseqüentes (Figura 3); este procedimento permite que o experimentador para segmentar regiões sub-corticais específicas do cérebro para o estudo eletrofisiológico com base no padrão de referência de coordenadas 12. A terceira fase consiste em colocar o rato num gabarito adequado para a realização de experiências comportamentais e electrofisiológicos (Figura 4), ​​a construção do eléctrodo a partir de um tubo capilar de quartzo (Figura 5), fazer gravações neuronais juxtacellular inequivocamente que isolam as unidades individuais de 6-9, e marcando os locati anatômicasno do local de gravação com Chicago Sky azul corante (figuras 6 e 7). As gravações são realizadas com acompanhamento comportamental simultânea; no entanto, os detalhes técnicos do comportamento dependerá dos objetivos científicos de cada experiência e são, portanto, fora do âmbito de um protocolo único. Após a conclusão do procedimento experimental, o que pode ser repetido em vários dias, o animal é sacrificado. O cérebro é extraído e processado de acordo com as técnicas neuroanatomical padrão usando qualquer campo claro ou microscopia de fluorescência.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Ketaset (Ketamine HCl)</td>
			<td style="width:179px;">Fort Dodge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Anased (Xylazine solution)</td>
			<td style="width:179px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Betadyne (Povidone-Iodine)</td>
			<td style="width:179px;">CVS Pharmacy</td>
			<td align="right" style="width:175px;">269281</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Loctite 495</td>
			<td style="width:179px;">Grainger Industrial Supply</td>
			<td style="width:175px;">4KL86</td>
			<td style="width:315px;">20-40 cp cyanoacrylate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Vetbond</td>
			<td style="width:179px;">3M</td>
			<td style="width:175px;">1469SB</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement powder</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675571</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement liquid</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675572</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Silicone Gel</td>
			<td style="width:179px;">Dow Corning</td>
			<td align="right" style="width:175px;">Mar-80</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Jet denture repair acrylic powder</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Chicago sky blue</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C8679</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:175px;">158127</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">P3813</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C2506</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Diaminobenzidine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D5905</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Material Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Rat sock</td>
			<td style="width:179px;">Sew Elegant (San Diego, CA)</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 1, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">PVC tube 2 &#189;&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">U.S. Plastic Co.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">34108</td>
			<td style="width:315px;">Figure 4</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Subminiature D pins &#38; sockets</td>
			<td style="width:179px;">TE Connectivity</td>
			<td style="width:175px;">205089-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel music wire 0.010&#8221; diameter</td>
			<td style="width:179px;">Precision Brand Products, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">21010</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic holding frame</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 900</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic ear bars</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 957</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic manipulator</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 960</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">&#189; mm drill burr</td>
			<td style="width:179px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:175px;">100-3995</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quiet-Air dental drill&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Midwest Dental</td>
			<td style="width:175px;">393-1600</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel 0-80 1/8&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">247438</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">0.2mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">05-407-8A</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Custom head-holding bar</td>
			<td style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:191px;">Custom head-holding plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:315px;">Custom made, Figure 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Right angle post-clamp</td>
			<td style="width:179px;">Newport</td>
			<td style="width:175px;">MCA-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">8-32 3/4&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">240181</td>
			<td style="width:315px;">For head-restraint, Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">4-40 &#188;&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">239958</td>
			<td style="width:315px;">For head restraint, Figures 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quartz capillary tubing</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">QF-100-60-10</td>
			<td style="width:315px;">Figure 5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Carbon dioxide laser puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:175px;">P-2000</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">MP-285</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">Multiclamp 700B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier head stage</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">CV-7B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Isolated pulse stimulator</td>
			<td style="width:179px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:175px;">Model 2100</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Audio monitor</td>
			<td style="width:179px;">Radio Shack</td>
			<td style="width:175px;">32-2040</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:191px;">Pipette holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">Warner Instruments</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">#MEW-F10T</td>
			<td style="width:315px;">Alternate parts: see Discussion</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Figure 6A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Electrode lead wire</td>
			<td style="width:179px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:175px;">NEF34-1646</td>
			<td style="width:315px;">(optional), Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Relay for amplifier head-stage</td>
			<td style="width:179px;">COTO Technology</td>
			<td style="width:175px;">#2342-05-000</td>
			<td style="width:315px;">(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Digital video camera</td>
			<td style="width:179px;">Basler</td>
			<td style="width:175px;">A602fm</td>
			<td style="width:315px;">(optional) For behavioral monitoring, Figure 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html> Unidades neuronais em ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar a fase de circulação vibrissa durante o auto-gerado mexendo 15,16. Figura 7A mostra a atividade spiking amostra de uma unidade thalamic VPM como um rato está mexendo ativamente. Figura 7B mostra um histograma de spike vezes alinhado à fase instantânea de vibrissa movimento 17. Há mais pontos durante a fase de retração de bater. Depois da gravação, o local da unidade foi marcado a...

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Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K visualizações.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Neurociência

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Estimulação transcraniana de elétrica cerebral em roedores alertas

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

A Bedside, Single Burr Hole Approach to Multimodality Monitoring in Severe Brain Injury

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic brain injury. While elevations in ICP are common, data regarding the measurement and treatment of these ICP elevations are conflicting. There is increasing recognition that changes in the balance between supply and demand of brain tissue are critically important and therefore the measurement of multiple modalities is required. Approaches are not standard, and therefore this article provides a description of a bedside, single burr hole approach to multimodality monitoring that allows the passage of probes designed to measure not only ICP but brain tissue oxygen, blood flow, and intracranial electroencephalography. Patient selection criteria, operative procedures, and practical considerations for securing probes during critical care are described. This method is readily performed, safe, secure, and flexible for the adoption of a variety of multimodality monitoring approaches aimed at detecting or preventing secondary brain injuries.

A method of recording multimodality monitoring signals in patients with severe brain injuries using a bedside, single burr hole technique is described.

Uma abordagem de buraco Burr cabeceira, único a multimodalidade monitoramento em lesão cerebral grave

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modelagem e análise tridimensional da forma de estruturas do cérebro

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.