Os autores agradecem a Prof Eero Castren por seus valiosos comentários sobre o manuscrito. O trabalho é apoiado por subsídios da Academia da Finlândia, Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, eo finlandês Graduate School of Neuroscience (Mente Cérebro e Programa de Doutorado).

<ol>
	<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li><li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity.">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals.">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li><li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror.">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li><li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals.">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li><li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals.">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li><li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats.">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li><li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinforcing+operandum:+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents.">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li><li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint.">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li><li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization.">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog &amp; behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li><li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex.">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li><li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -. S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice.">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li><li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics:+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition.">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li><li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo,+low-resistance,+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain.">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li><li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice.">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li><li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex.">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li><li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice.">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li><li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake,+head-restrained+mice.">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li><li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific.">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li><li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements.">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li><li>St&#252;ttgen, M. C., R&#252;ter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents.">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li><li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity.">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li><li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O&#8217;Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code.">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li><li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task.">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window.">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li><li>Garaschuk, O., Milos, R. -. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo.">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JPCalc,+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp,+intracellular,+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements.">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li><li>Golshani, P., Gon&#231;alves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity.">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li><li>Polack, P. -. O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex.">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li><li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls.">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., &amp; motor research. 27, 131-148 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para entender melhor a fisiologia do cérebro e da patologia, a pesquisa deve ser realizada em uma variedade de níveis de complexidade de preparação, utilizando as técnicas mais adequadas para cada preparação. Neste momento, uma grande variedade de metodologias de neurociência (de corpo inteiro fMRI para microscopia STED sub-organela) são facilmente aplicada aos animais anestesiados, enquanto experiências em animais acordados e se comportando ter representado um desafio metodológico significativo. Aqui, uma nova abordagem é descrita em um animal de laboratório, apesar de ser firmemente cabeça-fixados, pode mover-se em torno de um homecage móvel levantada ao ar e explorar seu ambiente tangível em condições livres de estresse. A preparação de animais se comportando fixo-cabeça apresentado aqui fornece uma série de vantagens cruciais. Primeiro, os dados eletrofisiológicos ou de imagem obtidos com este método são descomprometido nem pela anestesia nem por estresse induzido por constrangimento. Posicionamento do mouse para a casa móvelgaiola é rápido e não requer anestesia do animal, mesmo transitoriamente. Em segundo lugar, o homecage levantou-air garante a estabilidade mecânica necessária para quantificar alterações na morfologia neuronal bem e para gravar a atividade eletrofisiológica de uma única célula em animais acordados. Finalmente, o design do homecage móvel é mais compacta em comparação com a esteira esférica, permitindo assim o posicionamento da homecage móvel sob um microscópio vertical padrão para imagens de dois fótons ou gravação de patch-clamp no cérebro acordado do mouse. Fixação Firm cabeça na homecage móvel requer a implantação de um suporte de metal de quatro asas especialmente projetado, com uma rodada de abertura no centro para acesso óptico ou elétrico para a região cerebral subjacente. Estes suportes metálicos são ligados ao crânio por meio de uma combinação de cola, cimento dentário e um pequeno parafuso aparafusado no osso do crânio. Este procedimento cirúrgico foi desenvolvido com base em um grande número de anteriormenteprocedimentos publicados, e verificou-se resultar em uma janela craniana preparação estável e reprodutível. Para experimentos in vivo eletrofisiológicos, uma janela em forma de lua 34, uma pequena craniotomia tamanho (menos de 0,5 mm) 32, e uma preparação coberto de vidro perfurado 35 têm sido utilizados. Aqui, a janela craniana &quot;invertido&quot; foi implantado com qualquer uma grande (3.5 mm de diâmetro) ou pequena (menos de 0,5 mm de diâmetro) a craniotomia. Minimizando movimento cérebro é fundamental para gravações unicelulares estáveis, o que é por isso que é aconselhável realizar pequenas craniotomias tamanho para experimentos eletrofisiológicos. Após a implantação da janela craniana para experiências de imagiologia óptica, os animais são deixados a recuperar durante pelo menos 2 ou 3 semanas, durante o qual período a janela primeiro transitoriamente perde a sua transparência e, em seguida, recupera-lo (com um rendimento de 50-70%, dependendo o fundo genético da estirpe do rato). Transparência da janela craniana e stabildade do cimento dental &quot;cap&quot; anexado ao crânio pode ser verificada por meio de um microscópio binocular regular e inspeção física durante o manuseio do animal. No final do período de recuperação de 2-3 semanas, os animais que apresentam sinais de inflamação pós-operatório residual ou defeitos mecânicos na cimento dental deve ser excluída dos experimentos e terminada. A idade ideal para iniciar o treinamento dos ratos é de 2-4 meses (correspondentes ao peso corporal de 20-40 g). Em animais jovens, a ancoragem do cimento dental &quot;cap&quot; no crânio podem não ser confiáveis, o que pode diminuir a sua resistência ao estresse mecânico que é imposta pela locomoção do mouse fixo-cabeça na homecage móvel. Embora os ratos machos e fêmeas parecem igualmente dispostos para navegar em homecage móvel, há uma tendência para atingir melhor percentagem de janelas cranianos recuperar a sua transparência nos ratinhos fêmea (dados não mostrados). Assim, a fim to assegurar uma combinação equilibrada de gêneros no grupo de animais selecionados para a imagem latente, implantando janelas cranianas em aproximadamente 30% os ratos mais macho é recomendado. As interações sociais são conhecidos por melhorar o bem-estar dos animais e reduzir o estresse, por isso é aconselhável que ninhada são operados e treinados em paralelo e mantidos juntos em gaiolas de estabulação. Em contraste com os processos publicados para a preparação esteira esférica 13, o método que utiliza o homecage móvel não requer anestesia no ratinho, no momento da fixação da cabeça. Esta diferença é importante porque permite a descartar quaisquer efeitos residuais que mesmo uma breve e &quot;light&quot; episódio anestesia é provável que tenha nas medições fisiológicas obtidas logo após. Na verdade, mesmo que nos estudos onde a fixação cabeça foi feito sob anestesia e os experimentos reais foram iniciados após um breve período de espera 13, não se podeexcluir possíveis efeitos de longa duração do episódio breve anestesia sobre os dados experimentais. Outros estudos têm contado com privação de água para habituação sistemática dos animais a cabeça de fixação e usado recompensa água como meio de motivar o animal a permanecer imóvel 36. No entanto, o método de fixação de cabeça à base de recompensa limita a escolha dos testes comportamentais aplicáveis ​​e, mais importante, ocupa uma das associações estímulo-recompensa bem estabelecidos. Em contraste, o método de rato habituação a cabeça fixação em homecage móvel não exige a privação de água e recompensa subseqüente. Completando o homecage móvel com um sistema de distribuição de água é recomendado para experimentos de longa duração. As sessões de treinamento de animais e experimentos apresentados aqui foram feitas durante o dia (oito horas - seis horas), o que corresponde ao período fisiologicamente passiva para aqueles ratos que são mantidos sob a luz padrão horário de 12 horas (liGHTS on às 6 da manhã e desligar às 6 da tarde). Uma vez que a ingestão de água está diretamente associada com a atividade do mouse, durante os ratos período passivo não necessitam de fornecimento de água, se a duração de uma sessão de formação / imagem / gravação não exceda 2 horas. Além do tempo e duração das sessões de treinamento, é preciso resolver a questão do número ideal de sessões necessárias para habituar os animais para homecage móvel. Para este fim, foram utilizados dois critérios para avaliar a tensão induzida por processos de fixação de cabeça: i) perda de peso, e ii) a nível da actividade locomotora. Como mostrado na Figura 6, a perda de peso atinge o nível médio de 6% no dia 2 de formação, e é completamente invertido por dia de formação 4 (Figura 6A). De forma consistente com a dinâmica de pesagem, o nível de animais fixo de cabeça actividade locomotora é suprimida no primeiro dia de treino, mas estabiliza por dia de formação 4 (Figura 6D). Com base nestas medições, sugestõest que a duração mínima do período de formação do rato em homecage móvel é de 4 dias, como descrito no protocolo ora. O uso do, homecage móvel plana com piso levantado ao ar permite adicionar tarefas complexas (sensório-motoras, de percepção, e cognitivos) para os paradigmas de formação para os ratos fixo-cabeça. No presente estudo, dois protocolos de testes comportamentais são apresentados. Ambos os protocolos utilizar pistas de odor e pode ser combinado com longitudinais de imagem / gravações no córtex mouse. Embora o homecage móvel é fabricado a partir de materiais não absorventes, ainda precisa levar em conta possíveis interferências entre o cheiro do dispositivo e odor (s) de teste. Outro fator que pode interferir com / dicas táteis visuais de um experimento comportamental é a junção entre a parede ea inserção, o que não é perfeita e pode, portanto, ser percebido pelo animal como um marco. É importante notar aqui que, a fim de minimizar o sofrimento do animal durante tal interventions como a colocação de um algodão que apresenta odor à parede homecage móvel, o experimentalista deve praticar para realizar este tipo de intervenções, tão rapidamente quanto possível e evitar manipulação prolongada da gaiola de carbono. As estratégias alternativas para nova apresentação cheiro / objecto são concebíveis, por exemplo, colocação de uma solução à base de hidrogel de gotas ou objectos (tais como chips de alimento) em pequenas prateleiras fixados à superfície interna da parede da gaiola de carbono na altura compatível com o posicionamento da cabeça do animal. Homecage Mobile permite animais fixo-cabeça para executar uma ampla gama de movimentos bidimensionais incluindo locomoção horizontal, situp, higiene, mexendo, lambendo, nariz-cutucando, os movimentos das patas dianteiras qualificados, e tocar parede com membros anteriores, como ilustrado no presente estudo . Usando homecage móvel e os protocolos aqui apresentados, os pesquisadores podem estudar o sistema sensório-motor neuronal com um alto nível de controle sobre tanto a condição estimulaçãos e as comportamentais de leitura-outs. Além disso, estudos de habilidades cognitivas em camundongos despertos pode ser realizada durante condicionado, navegação espacial e as tarefas de tomada de decisão. Existem várias limitações práticas deste método. Em primeiro lugar, uma quantidade significativa de ar pressurizado é necessário para atingir o poder de elevação homecage e para realizar experiências de longa duração. Em segundo lugar, o homecage móvel na sua actual aplicação é de apenas 18 cm de diâmetro, e, por conseguinte, fornece um relativamente pequeno e simples, em comparação com o espaço de realidade virtual, onde um ambiente experimental complexo pode ser concebido sem quaisquer restrições espaciais. Em terceiro lugar, durante a estimulação bigode e experimentos baseados em recompensa aqui apresentados, um dispositivo foi utilizado, que limita a possibilidade do contato de parede para o mouse. A adição de um canal de estimulação visual ou sensorial externo (como um projetor de luz olho-dirigida) exigiria a concepção de um dispositivo mais ergonômico e compacto em comparação comas soluções de ecrã múltiplo ou cúpula de projeção que foram utilizados nos experimentos de esteira esféricas. Em resumo, a utilização dos ratinhos fixo de cabeça que se deslocam no homecage móvel levantado ao ar facilita grandemente os estudos que combinam os níveis celulares, moleculares e comportamentais de observação e manipulação numa única experiência. As aplicações específicas ilustradas aqui incluem dois fótons de imagem microscópica, intrínseca sinal óptico de imagem e gravação de patch-clamp em camundongos comportando não anestesiados. Espera-se que esta abordagem irá abrir novos horizontes em experimentação sobre acordado, rato comportar e servir como uma ferramenta útil tanto para o desenvolvimento de medicamentos e pesquisa básica da função cerebral.

Uma tendência recente emocionante nas Neurociências é desenvolver abordagens experimentais para celular e molecular sondagem de redes neuronais no cérebro de acordado, comportando roedores. Tais abordagens promissoras para lançar uma nova luz sobre os processos neurofisiológicos subjacentes a função motora, a integração sensório-motora, percepção, aprendizagem, memória, bem como progressão lesão, neurodegeneração e doenças genéticas. Além disso, a gravação do cérebro acordado do animal é uma promessa para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos. Há uma consciência crescente de que a anestesia, o que tem sido comumente utilizados em experimentos neurofisiológicos, pode afetar os mecanismos básicos de funcionamento do cérebro, podendo levar a uma interpretação errônea dos resultados experimentais. Assim, o anestésico cetamina amplamente utilizado aumenta rapidamente a formação de novas espinhas dendríticas e melhora a função sináptica 1; outro anestésicos utilizadaic isoflurano em níveis anestesia cirúrgica suprime completamente a atividade cortical espontânea em ratos recém-nascidos e bloqueia oscilações do eixo-burst em animais adultos 2. Actualmente, apenas um número limitado de abordagens permitir experimentos em camundongos não anestesiados por meio de dois fótons de imagem microscópica ou gravações de patch-clamp. Estas abordagens podem ser divididas em preparações livremente móveis e fixas de cabeça. A atracção única de uma preparação de animais movimento livre é que ele permite a avaliação do comportamento natural, incluindo os movimentos do corpo inteiro durante a navegação. Uma forma de imagem dentro do cérebro de um roedor movendo-se livremente é anexar um microscópio montado na cabeça miniaturizada ou fiberscope 3-5. No entanto, os dispositivos miniaturizados tendem a ter um desempenho óptico limitada em comparação com a microscopia à base objectivo de dois fotões, e não pode ser facilmente combinado com as gravações de células inteiras de patch-clamp 6. A exisoluções picada para fixação de cabeça um roedor acordado têm se baseou principalmente na contenção física ou 7,8 ou em treinar o animal para exibir apoio de cabeça voluntária 9. Outra abordagem popular é o de permitir que membros do animal para se mover, colocando-o em, por exemplo, um tapete rolante esférica 10; esta abordagem é muitas vezes combinado com a realidade virtual gerado por computador. Experimentos eletrofisiológicos em ratos fixo-cabeça têm usado principalmente gravações extracelular e foram usados ​​para estudar regulação central da função cardiovascular 11, os efeitos da anestesia sobre a atividade neuronal 12, a resposta auditiva no tronco encefálico 13 e processamento de informação 14. As gravações pioneiras intracelulares / celulares totais em animais se comportando acordado foram realizados na década de 2000 e têm-se centrado sobre a atividade neural relacionada à percepção e movimento 15-20. Ao mesmo tempo, os primeiros estudos de imagem microscópica em ratos acordados foram pubcido, onde a microscopia de dois fótons foi usado no córtex sensorial de ratos fisicamente contido 7 e em ratos correndo em uma esteira esférica 21. Estudos in vivo de microscopia e de eletrofisiologia posteriores demonstraram que uma preparação de fixação da cabeça podem ser combinados com sucesso com paradigmas comportamentais baseados em movimentos de membros anteriores, o reconhecimento odor, mexendo, e lambendo 8,22-25. Ratos colocados na esteira esférica podem ser treinados para navegar no ambiente virtual visual gerada por um computador 10,26. Gravações intracelulares / extracelulares demonstraram que, em um animal fixo-cabeça navegar nesse ambiente virtual, a ativação de células lugar do hipocampo pode ser detectado 27. Em um ambiente virtual visual, ratos demonstram ritmo normal teta relacionados com o movimento no potencial de campo local e precessão da fase theta durante o movimento ativo 27. Recentemente, o activit espacial e temporalpadrões y de populações neuronais foram registrados opticamente em ratos durante as tarefas de decisão memória de trabalho em um ambiente virtual 28. Apesar de ter habilitado pesquisa da descoberta, o projeto esteira esférica tem várias limitações inerentes. Primeiro, o animal é necessária para mover sobre uma superfície ilimitada de uma bola levantada ao ar rotativo, que não coloca obstáculos tangíveis, tais como paredes ou barreiras. Essa limitação é apenas em parte compensada pela &quot;realidade virtual&quot; gerado por computador, porque input visual é sem dúvida menos eficaz em camundongos e ratos, em comparação com a entrada sensorial tátil (por exemplo, bigode de toque ou lamber), que estas espécies naturalmente confiar na. Em segundo lugar, a curvatura considerável da superfície da bola pode ser desconfortável para os ratos de laboratório usados ​​para caminhar sobre um piso liso em suas gaiolas. Finalmente, o diâmetro da esfera pura (pelo menos 200 mm para os ratos e 300 mm para os ratos) processa o tamanho vertical do esféricadispositivo esteira relativamente grande. Isso torna difícil para combinar esteira esférico com a maioria das configurações de microscopia disponíveis no mercado, e muitas vezes requer a construção de uma nova configuração em torno da esteira por meio de quadros de microscópio feitos sob medida. Aqui, um novo método é descrito em que um mouse fixo-cabeça podem se mover em torno de um homecage móvel levantou-ar que dispõe de um piso plano e paredes tangíveis, e explorar o ambiente físico em condições livres de estresse. Este artigo demonstra os procedimentos de treinamento do mouse e fixação cabeça, e fornece exemplos representativos onde as gravações de microscopia de dois fótons, de imagem óptico intrínseco e patch-clamp são realizadas no cérebro de ratos comportando acordado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="733">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tweezers&#160; Stainless Steel, 115mm</td>
			<td style="width:161px;">XYtronic</td>
			<td style="width:141px;">XY-2A-SA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal trimmer, shaving machine</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">Isis GT420</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Binocular Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td>
			<td style="width:161px;">Supertech</td>
			<td style="width:141px;">TMP-5b</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Blunt microsurgical blade</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:141px;">REF 374769</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Borosilicate tube with filament</td>
			<td style="width:161px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:141px;">BF120-69-10</td>
			<td style="width:173px;">For patch pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Foscam</td>
			<td style="width:141px;">FI8903W</td>
			<td style="width:173px;">Night visibility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Carprofen</td>
			<td style="width:161px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">Rimadyl vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dental cement</td>
			<td style="width:161px;">DrguDent, Dentsply</td>
			<td style="width:141px;">REF 640 200 271</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:161px;">FaunaPharma</td>
			<td style="width:141px;">Rapidexon vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable drills</td>
			<td style="width:161px;">Meisinger</td>
			<td style="width:141px;">HP 310104001001008</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbeco&#8217;s PBS 10X</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">D1408</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumont #5 forceps, 110 mm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91150-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:259px;">Eyes-lubricant</td>
			<td style="width:161px;">Novartis</td>
			<td style="width:141px;">Viscotears</td>
			<td style="width:173px;">For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom drill control</td>
			<td style="width:161px;">Foredom&#160;</td>
			<td style="width:141px;">FM3545</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Foredom micro motor handpiece</td>
			<td style="width:161px;">Foredom</td>
			<td style="width:141px;">MH-145</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Four-winged metal holder</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Head Holder for Mice</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">SG-4N</td>
			<td style="width:173px;">Assembled on stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Hemostasis Collagen Sponge</td>
			<td style="width:161px;">Avitene, Ultrafoam BARD</td>
			<td style="width:141px;">Ref 1050050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Imaris</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ketamine</td>
			<td style="width:161px;">Intervet</td>
			<td style="width:141px;">Ketaminol vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Kwik-Sil&#160;</td>
			<td style="width:161px;">WPI</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mai Tai DeepSee laser</td>
			<td style="width:161px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micro dressing forceps, 105 mm</td>
			<td style="width:161px;">Aesculap</td>
			<td style="width:141px;">BD302R</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:161px;">Narishige</td>
			<td style="width:141px;">PC-10H</td>
			<td style="width:173px;">Vertical puller for glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:161px;">Sensapex</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Mini bolt</td>
			<td style="width:161px;">Centrostyle</td>
			<td style="width:141px;">Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Mobile Homecage</td>
			<td style="width:161px;">Neurotar</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:259px;">Multiphoton Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">FV1000MPE</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:259px;">Nonwoven swabs 5&#215;5</td>
			<td style="width:161px;">Molnlycke Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Mesoft</td>
			<td style="width:173px;">Surgical tampons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polyacrylic glue</td>
			<td style="width:161px;">Henkel</td>
			<td style="width:141px;">Loctite 401</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:259px;">Round glass coverslip&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:141px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1.5 thickness&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:161px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:141px;">900</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Student iris scissors, straight 11.5 cm</td>
			<td style="width:161px;">FST</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Xylazine</td>
			<td style="width:161px;">Bayer Health Care</td>
			<td style="width:141px;">Rompun vet</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents

É amplamente reconhecido que o uso de anestésicos gerais pode minar a relevância dos dados eletrofisiológicos ou microscópicos obtidos com o cérebro de um animal vivo. Além disso, a longa recuperação da anestesia limita a freqüência de episódios de gravação / imagens repetidas em estudos longitudinais. Assim, novos métodos que permitam gravações estáveis ​​a partir de ratinhos não anestesiados, comportando são esperados para o avanço dos campos de ciências neurológicas e cognitivas celulares. As soluções existentes variam de mera contenção física para abordagens mais sofisticadas, tais como esteiras lineares e esféricos usados ​​em combinação com realidade virtual gerado por computador. Aqui, um novo método é descrito em que um mouse fixo-cabeça podem se mover em torno de um homecage móvel levantada ao ar e explorar seu ambiente em condições livres de estresse. Este método permite que os pesquisadores para realizar testes comportamentais (por exemplo, de aprendizagem, de habituação ou novela de reconhecimento de objeto) em simultâneo comdois fótons de imagem microscópica e / ou gravações de patch-clamp, todos combinados em um único experimento. Este vídeo-artigo descreve o uso do dispositivo de fixação da cabeça dos animais acordados (homecage móvel), demonstra os procedimentos de habituação dos animais, e exemplifica um número de possíveis aplicações do método.

O método aqui apresentado destina-se a imagens microscópicas ou unicelulares registros eletrofisiológicos em ratos, fixo-cabeça, mas de outra forma livremente em movimento e se comportando acordado. O animal pode mover-se em duas dimensões em uma real (em oposição a virtual), meio tangível e familiar, enquanto crânio dos animais é fixada firmemente ao braço de fixação da cabeça. Habituar a ratinhos para o homecage móvel levantado ao ar é constituída por 4-6 dias de sessões de treino de 2 horas duas vezes por dia (Figura 1). Os animais treinados pode então ser utilizado nas experiências de imediato. Um estudo típico inclui uma série de sessões de imagem ou sessões de gravação de patch-clamp que estão espaçados a intervalos que vão de algumas horas até vários dias ou semanas. É importante ressaltar que ambas as gravações ópticas e eletrofisiológicos podem ser realizadas simultaneamente com os estímulos e leituras cognitivas ou comportamentais, dentro de um único experimento. Para avaliar a estabilidade mecânica defixação do rato cabeça na homecage móvel, as sequências de imagens de vasos corticais marcados com dextrano fluorescente conjugado e de dendritos corticais expressando YFP foram coletadas enquanto os animais experimentais foram navegar no homecage móvel (Figura 2). Os deslocamentos máximos do cérebro durante a locomoção do animal não exceder normalmente 1-1,5 micrômetros. Estes deslocamentos ocorridos nas direções horizontal e muito raramente resultou em uma mudança detectável do plano de imagem, tornando desnecessário qualquer correção de artefatos de movimento. Fixação estável cabeça em homecage móvel permite a quantificação das espinhas dendríticas individuais em animais acordados com a mesma confiabilidade como em ratos anestesiados. Densidade das espinhas dendríticas, morfologia e volume de negócios podem ser monitorados durante os estudos longitudinais com várias sessões de imagem realizados em intervalos que variam de algumas horas a vários dias ou semanas. A usabilidade do móvel homecage para imagiologia óptica funcional foi testada no córtex somatossensorial de ratos acordados utilizando duas abordagens: i) microscopia de dois fotões nos ratinhos transgénicos Thy1-GCaMP3 e ii) intrínseca de imagem do sinal óptico em murganhos de tipo selvagem. Ca 2 + de imagem foi realizado na camada 2/3, que contém os corpos celulares de muitos neurónios marcados com fluorescência, bem como as suas dendrites e axónios (Figura 3). As parcelas de fluorescência-over-time de regiões selecionadas de interesse (ROI) são mostrados na Figura 3, o que demonstra a atividade neuronal espontânea (medido como aumentos transitórios da GCaMP3 fluorescência) durante a navegação ativa do mouse na homecage móvel. Imageamento óptico baseado em sinais intrínsecos permite o mapeamento da distribuição espacial dos domínios funcionais. Figura 4 ilustra mudanças wave-like no nível de oxigenação do sangue (que refletem a ativação neuronal regionais) que se propagam ao longo de córtex somatosensorial em resposta à vibrissa estimulação na freqüência de 0,05 Hz. Para testar a viabilidade de gravações de patch-clamp com homecage móvel, foram utilizados camundongos 2-3 meses de idade C57Bl/6J. Camada 2/3 neurônios do córtex somatossensorial foram registrados a partir de configuração de célula inteira usando o modo de fixação atual. Gravação de patch-clamp no cérebro de ratos acordados em homecage móvel fixo-cabeça era essencialmente similar a cegar patch-fixação em fatias de cérebro. Aproximadamente 50% das tentativas resultou na formação gigaseal bem sucedida, em que mais de 70% originou estável gravação configuração de célula inteira. Não foram observados eventos de perder contato gigaseal devido ao deslocamento mecânico de células. Figura 5 ilustra um fragmento de 60 segundos de um representante de 10 min gravação longa corrente-clamp correlacionados com episódios de camundongo ativa (em execução) e (repouso) estados passivos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in"src = &quot;/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1. O método de fixação de cabeça de ratos acordados no homecage móvel. A) Visão geral do projeto homecage móvel levantada ao ar e ilustrações do conceito geral. B) Diagrama de um cronograma experimental típico. O estudo começa com a implantação da janela craniana duas semanas antes habituar o rato para manuseio e empacotamento, a qual é seguida por oito sessões de treino duas vezes por dia. O estudo típico inclui uma série de sessões de imagem ou sessões de gravação de fixação de membranas que estão espaçados a intervalos que vão de algumas horas até vários dias ou semanas. Ambas as medições ópticas e eletrofisiológicos pode ser feito em paralelo com estímulos e leituras cognitivos ou comportamentais em um único experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Exemplo de dois fótons de imagem microscópica em ratos acordados em movimento ao redor do homecage móvel. A, B) a vasculatura cortical, marcado com o de 70 kDa de Texas Red-dextrano conjugado. O diâmetro dos segmentos individuais de navios é medida ao longo do tempo, traçando o perfil das linhas traçadas através do lúmen do vaso durante os períodos de descanso de rato e em execução (A). A taxa de fluxo sanguíneo nas artérias e veias é medido por linha de varredura ao longo das linhas traçadas paralelamente à parede do vaso (B). C, d) detalhes de morfologia neuronal visualizado no cérebro de camundongos transgênicos que expressam YFP na subpopulação de neurônios sob o promotor Thy1. Reconstrução tridimensional de neurônios piramidais no córtex somatossensorial do rato (C). As imagens de uma b dendríticafazenda adquirida em uma vigília, rato comportando são suficientemente estáveis ​​para quantificação de indivíduo dendrítica morfologia da coluna (D) E) A quantificação de movimento do cérebro causada por movimentos do mouse.. Maiores deslocamentos de amplitude correlacionar com períodos de funcionamento do mouse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Exemplo de atividade população neuronal em acordada Thy1-GCaMP3 rato mover-se ao redor do homecage móvel. A) imagem de dois fótons de camada cortical II / III neurônios. ROI, por exemplo neuronais corpos celulares, dendritos e axônios são mostrados em amarelo. B) Af / F traços da fluorescência GCaMP3 de ROIs mostrados em A (tempo de sD) Fluorescência de ROIs amarelos em C eries gravado em 1,5 seg / frame). C) zoom-in região fotografada a 65 ms / frame. plotados ao longo do tempo, mostra os aumentos transitórios (vermelhas) na fluorescência GCaMP3 que correspondem à ação Ca 2 episódios de potencial induzida + influxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Exemplo de mapeamento da distribuição espacial das respostas funcionais no córtex de um rato desperto, por meio de imagiologia os sinais ópticos intrínsecas. A) vista Bright-campo dos vasos sanguíneos superficiais através da janela craniana. B) mapa magnitude da atividade da linha de base em móveis homecage durante um episódio de 6 min. C) mapa Magnitude da atividade neuronal propaga ao longo córtex somatosensorial, em resposta à estimulação vibrissa a uma freqüência de 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Exemplo de célula inteira de gravação de patch-clamp no córtex de um rato desperto em movimento ao redor do homecage móvel. A) de gravação actual-clamp de um neurônio na camada cortical do rato 2/3. A 0,5 seg, 100-pA injeção de corrente (indicado abaixo do traço) resulta em uma explosão de potenciais de ação. A célula mostrou característica de adaptação à freqüência de pico para os neurônios piramidais. B) contínua gravação atual-clampdo mesmo neurônio correlacionada com a atividade de mouse locomotor &quot;(mostrado na rosa acima do traço). Atividade espontânea Representante do neurônio da camada 2/3 durante períodos do mouse do repouso (C) e corrida (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. Perda de peso animal e atividade locomotora de camundongos head-fixed/non-fixed durante as sessões de treinamento no homecage móvel. A) O peso do animal (média + SD,%) antes das sessões de treinamento. Note-se que a perda de peso é totalmente revertida pela sessão de treinamento 7-8 ª. B) Trajetória do rato locomoção horizontal relativa ao homecage móvel,que foi extrapolado a partir do movimento rastreado do homecage móvel durante 8 ª sessão de treinamento. c) A circulação de lagartas de um mouse não-cabeça-fixada explorar a gaiola redonda durante 8 ª sessão de treinamento. D) Duração do fixo-cabeça (círculo) e não fixa (triângulo) movimento camundongos durante 1-4 º dia de treinamento (média + SD,%). Note-se que, no dia 4, os ratos fixo-cabeça exibir nem congelamento (como no 1 º dia), nem atividade locomotora excessiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents at JoVE.com

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Este método cria um ambiente tangível, familiar para o mouse para navegar e explorar durante o exame ou unicelulares microscópicos registros eletrofisiológicos, que exigem a fixação firme da cabeça do animal.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

flat-floored-air-lifted-platform-new-method-for-combining-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

22.5K visualizações.  University of Helsinki.  Este método cria um ambiente tangível, familiar para o mouse para navegar e explorar durante o exame ou unicelulares microscópicos registros eletrofisiológicos, que exigem a fixação firme da cabeça do animal. 

Vídeo: Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different forms of learning. Specifically, viral-mediated delivery is used to express a genetically modified inhibitory G-protein coupled receptor (the Designer Receptor) into a discrete brain region in the rodent. Three weeks later, when designer receptor expression levels are high, a pharmacological agent (the Designer Drug) is administered systemically 30 min prior to a specific behavioral session. The drug has affinity for the designer receptor and thus results in inhibition of neurons that express the designer receptor, but is otherwise biologically inert. The brain region remains silenced for 2-5 hr (depending on the dose and route of administration). Upon completion of the behavioral paradigm, brain tissue is assessed for correct placement and receptor expression. This approach is particularly useful for determining the contribution of individual brain regions to specific components of behavior and can be used across any number of behavioral paradigms.

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Comportamento

A Method for Evaluating the Reinforcing Properties of Ethanol in Rats without Water Deprivation, Saccharin Fading or Extended Access Training

Operant oral self-administration methods are commonly used to study the reinforcing properties of ethanol in animals. However, the standard methods require saccharin/sucrose fading, water deprivation and/or extended training to initiate operant responding in rats. This paper describes a novel and efficient method to quickly initiate operant responding for ethanol that is convenient for experimenters and does not require water deprivation or saccharin/sucrose fading, thus eliminating the potential confound of using sweeteners in ethanol operant self-administration studies. With this method, Wistar rats typically acquire and maintain self-administration of a 20% ethanol solution in less than two weeks of training. Furthermore, blood ethanol concentrations and rewards are positively correlated for a 30 min self-administration session. Moreover, naltrexone, an FDA-approved medication for alcohol dependence that has been shown to suppress ethanol self-administration in rodents, dose-dependently decreases alcohol intake and motivation to consume alcohol for rats self-administering 20% ethanol, thus validating the use of this new method to study the reinforcing properties of alcohol in rats.

This protocol describes a novel and efficient method to quickly initiate operant responding for ethanol in rats that, contrary to standard methods, does not require water deprivation or saccharin/sucrose fading to initiate responding.

Um método para avaliar as propriedades de reforço de etanol em ratos sem água Privação, Sacarina desvanecimento ou treinamento de Acesso Ampliado

Operant oral self-administration methods are commonly used to study the reinforcing properties of ethanol in animals. However, the standard methods ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in mice: the Feeding Experimentation Device (FED). FED is an open-source system that was designed to facilitate flexibility in food intake studies. Due to its compact and battery powered design, FED can be placed within standard home cages or other experimental equipment. Food intake measurements can also be synchronized with other equipment in real-time via FED's transistor-transistor logic (TTL) digital output, or in post-acquisition processing as FED timestamps every event with a real-time clock. When in use, a food pellet sits within FED's food well where it is monitored via an infrared beam. When the pellet is removed by the mouse, FED logs the timestamp onto its internal secure digital (SD) card and dispenses another pellet. FED can run for up to 5 days before it is necessary to charge the battery and refill the pellet hopper, minimizing human interference in data collection. Assembly of FED requires minimal engineering background, and off-the-shelf materials and electronics were prioritized in its construction. We also provide scripts for analysis of food intake and meal patterns. Finally, FED is open-source and all design and construction files are online, to facilitate modifications and improvements by other researchers.

Feeding Experimentation Device FED: Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Feeding Experimentation Device (FED) is an open-source device for measuring food intake in mice. FED can also synchronize food intake measurements with other techniques via a real-time digital output. Here, we provide a step-by-step tutorial for the construction, validation, and usage of FED.

Alimentando Dispositivo Experimentação (FED): construção e validação de um dispositivo de código aberto para medição Food Intake em roedores

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A New Method for Inducing a Depression-Like Behavior in Rats

Contagious depression is a phenomenon that is yet to be fully recognized and this stems from insufficient material on the subject. At the moment, there is no existing format for studying the mechanism of action, prevention, containment, and treatment of contagious depression. The purpose of this study, therefore, was to establish the first animal model of contagious depression.
Healthy rats can contract depressive behaviors if exposed to depressed rats. Depression is induced in rats by subjecting them to several manipulations of chronic unpredictable stress (CUS) over 5 weeks, as described in the protocol. A successful sucrose preference test confirmed the development of depression in the rats. The CUS-exposed rats were then caged with na&#239;ve rats from the contagion group (1 na&#239;ve rat/2 depressed rats in a cage) for an additional 5 weeks. 30 social groups were created from the combination of CUS-exposed rats and na&#239;ve rats.
This proposed depression-contagion protocol in animals consists mainly of cohabiting CUS-exposed and healthy rats for 5 weeks. To ensure that this method works, a series of tests are carried out - first, the sucrose preference test upon inducing depression to rats, then, the sucrose preference test, alongside the open field and forced-swim tests at the end of the cohabitation period. Throughout the experiment, rats are given tags and are always returned to their cages after each test.
A few limitations to this method are the weak differences recorded between the experimental and control groups in the sucrose preference test and the irreversible traumatic outcome of the forced swim test. These may be worth considering for suitability before any future application of the protocol. Nonetheless, following the experiment, na&#239;ve rats developed contagion depression after 5 weeks of sharing the same cage with the CUS-exposed rats.

This protocol describes a new model by which healthy rats could contract depression over a given time periodthrough contagion by exposure to chronic unpredictable stressed (CUS) rats.

Um novo método para induzir um comportamento parecido com depressão em ratos

Contagious depression is a phenomenon that is yet to be fully recognized and this stems from insufficient material on the subject. At the moment, there is ...

Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a long recovery period. To perform an EEG recording, the animal is connected to a receiver, creating an unnatural tether to the head-mount. EEG monitoring is time consuming, carries risk to the animal, and is not a completely natural setting for the measurement of sleep. Alternative methods to detect sleep, particularly in a high-throughput fashion, would greatly advance the field of sleep research. Here, we describe a validated method for detecting sleep via activity-based home-cage monitoring. Previous studies have shown that sleep assessed via this method has a high degree of agreement with sleep defined by traditional EEG-based measures. Whereas this method is validated for total sleep time, it is important to note that sleep bout duration should be assessed by an EEG which has better temporal resolution. The EEG can also differentiate rapid eye movement (REM) and non-REM sleep, giving more detail about the exact nature of sleep. Nevertheless, activity-based sleep determination can be used to analyze multiple days of undisturbed sleep and to assess sleep as a response to an acute event (like stress). Here, we show the power of this system to detect the response of mice to daily intraperitoneal injections.

We describe a high-throughput method of measuring sleep by means of activity-based home-cage monitoring. This method offers advantages over traditional EEG-based methods. It is well validated for the determination of total sleep duration and can be a powerful tool to monitor sleep in rodent models of human disease.

Determinação não-invasiva, elevado-throughput da duração do sono em roedores

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper understanding of the neurobiological causes underlying the decision-making problems. A cost-benefit based T-maze task is used for measuring decision making in which rodents choose between a high reward arm (HRA) and a low reward arm (LRA). There are two paradigms of the T-maze decision-making task, one in which the cost is a time delay and the other in which it is physical effort. Both paradigms require a tedious and labor-intensive management of experimental animals, multiple doors, pellet reward, and arm choice recordings. In the current work, we invented an apparatus based on traditional T-maze with full automation for pellet delivery, door management and choice recordings. This automated setup can be used for the evaluation of both delay- and effort-based decision making in rodents. With the protocol described here, our lab investigated the decision-making phenotypes of multiple genetically modified mice. In the representative data, we showed that the mice with ablated medial habenular showed aversions of both delay and effort and tended to choose the immediate and effortless reward. This protocol helps to decrease the variability caused by experimenter intervention and to enhance experiment efficiency. In addition, chronic silicon probe or microelectrode recording, fiber-optic imaging and/or manipulation of neural activity can be easily applied during the decision-making task using the setup described here.

This article introduces an automated T-maze apparatus that we invented, and a protocol based on this apparatus for analyzing delay-based decision making and effort-based decision making in free moving rodents.

Uma ZIF automatizado baseado aparelhos e protocolo para análise de tomada de decisão baseada em atraso e esforço em roedores em movimento livre

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice

Depression is a highly prevalent and debilitating condition, only partially addressed by current pharmacotherapies. The lack of response to treatment by many patients prompts the need to develop new therapeutic alternatives and to better understand the etiology of the disorder. Pre-clinical models with translational merits are rudimentary for this task. Here we present a protocol for the unpredictable chronic mild stress (UCMS) method in mice. In this protocol, adolescent mice are chronically exposed to interchanging unpredictable mild stressors. Resembling the pathogenesis of depression in humans, stress exposure during the sensitive period of mice adolescence instigates a depressive-like phenotype evident in adulthood. UCMS can be used for screenings of antidepressants on the variety of depressive-like behaviors and neuromolecular indices. Among the more prominent tests to assess depressive-like behavior in rodents is the sucrose preference test (SPT), which reflects anhedonia (core symptom of depression). The SPT will also be presented in this protocol. The ability of UCMS to induce anhedonia, instigate long-term behavioral deficits and enable reversal of these deficits via chronic (but not acute) treatment with antidepressants strengthens the protocol&#39;s validity compared to other animal protocols for inducing depressive-like behaviors.

Here we present the unpredictable chronic mild stress protocol in mice. This protocol induces a long-term depressive-like phenotype and enables to assess the efficacy of putative antidepressants in reversing the behavioral and neuromolecular depressive-like deficits.

O protocolo de estresse suave crônico imprevisível para induzir Anhedonia em ratos

Depression is a highly prevalent and debilitating condition, only partially addressed by current pharmacotherapies. The lack of response to treatment by ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials and Electrocorticograms in Response to Nociceptive Laser Stimuli from Freely Moving Rats

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and human studies to investigate the cortical processing of nociceptive information. These laser-evoked brain potentials (LEPs) consist of several transient responses that are time-locked to the onset of laser stimuli. However, the functional properties of the LEP responses are still largely unknown, due to the lack of a sampling technique that can simultaneously record neural activities at the surface of the cortex (i.e., electrocorticogram [ECoG] and scalp electroencephalogram [scalp EEG]) and inside the brain (i.e., local field potential [LFP]). To address this issue, we present here an animal protocol using freely moving rats. This protocol is composed of three main procedures: (1) animal preparation and surgical procedures, (2) a simultaneous recording of ECoG and LFP in response to nociceptive laser stimuli, and (3) data analysis and feature extraction. Specifically, with the help of a 3D-printed protective shell, both ECoG and LFP electrodes implanted on the rat&#39;s skull were securely held together. During data collection, laser pulses were delivered on the rat&#39;s forepaws through gaps in the bottom of the chamber when the animal was in spontaneous stillness. Ongoing white noise was played to avoid the activation of the auditory system by the laser-generated ultrasounds. As a consequence, only nociceptive responses were selectively recorded. Using the standard analytical procedures (e.g., band-pass filtering, epoch extraction, and baseline correction) to extract stimulus-related brain responses, we obtained results showing that LEPs with a high signal-to-noise ratio were simultaneously recorded from ECoG and LFP electrodes. This methodology makes the simultaneous recording of ECoG and LFP activities possible, which provides a bridge of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, thereby facilitating the investigation of nociceptive information processing in the brain.

We developed a technique that simultaneously records both electrocorticography and local field potentials in response to nociceptive laser stimuli from freely moving rats. This technique helps establish a direct relationship of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, which facilitates the investigation of nociceptive information processing in the brain.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local e Electrocorticograms em resposta a estímulos nociceptivos Laser de ratos movimentando-se livremente

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and ...

Brain Infarct Segmentation and Registration on MRI or CT for Lesion-symptom Mapping

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a group of patients. With recent advances in brain imaging and image processing, LSM has become a popular tool in cognitive neuroscience. LSM can provide fundamental insights into the functional architecture of the human brain for a variety of cognitive and non-cognitive functions. A crucial step in performing LSM studies is the segmentation of lesions on brains scans of a large group of patients and registration of each scan to a common stereotaxic space (also called standard space or a standardized brain template). Described here is an open-access, standardized method for infarct segmentation and registration for the purpose of LSM, as well as a detailed and hands-on walkthrough based on exemplary cases. A comprehensive tutorial for the manual segmentation of brain infarcts on CT scans and DWI or FLAIR MRI sequences is provided, including criteria for infarct identification and pitfalls for different scan types. The registration software provides multiple registration schemes that can be used for processing of CT and MRI data with heterogeneous acquisition parameters. A tutorial on using this registration software and performing visual quality checks and manual corrections (which are needed in some cases) is provided. This approach provides researchers with a framework for the entire process of brain image processing required to perform an LSM study, from gathering of the data to final quality checks of the results.

Provided here is a practical tutorial for an open-access, standardized image processing pipeline for the purpose of lesion-symptom mapping. A step-by-step walkthrough is provided for each processing step, from manual infarct segmentation on CT/MRI to subsequent registration to standard space, along with practical recommendations and illustrations with exemplary cases.

Segmentação de infarct cerebral e registro em RM ou TC para lesão-mapeamento de sintomas

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a ...