The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

Preparação 1 Amostra <ol><li> Preparação de B. Células subtilis for Imaging <ol><li> Inocular 10 ml de caldo Penassay (PAB, também conhecida como Meio Antibiótico 3) com uma única colónia de B. subtilis SU570 tensão (168 trpC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-spec) 16. Crescer durante a noite a uma baixa velocidade (100 rpm) agitador a 30 ° C. </li><li> Dilui-se a cultura durante a noite a 0,05 A 600 (medida de absorvância a 600 nm) em PAB fresco a 30 ° C com alta velocidade (215 rpm), agitando e crescem até meio da fase exponencial (A 600 ~ 0,4). </li><li> Adicionar 2 g de agarose de electroforese em série em 100 ml de 1x meio de crescimento (PAB) em um frasco de vidro com tampa de rosca. Dissolve-se a agarose por autoclavagem. Este pode ser armazenado a 4 ° C, durante alguns meses, e microondas para fundir a agarose, quando necessário. Deixa-se repousar à temperatura ambiente. </li><li> Anexar uma estrutura adesiva (65 l de capacidade, consulte a Tabela de Materiais) para uma ABL padrãoss lâmina de microscópio. Para fazer isso, remover a folha de poliéster fina (cada quadro adesivo é posicionada entre duas folhas de poliéster, um fino e um de espessura, e tem o quadrado central removida) e aplicam-se a superfície adesiva exposta da estrutura da superfície da lâmina de microscópio. Isso efetivamente cria uma praça bem em cima do slide. Deixe a folha de poliéster de espessura fixado ao quadro, pois isso vai evitar que a lamela aderindo a ela em etapas subseqüentes. </li><li> Derreter a solução de agarose, num forno de microondas até ferver e pipeta de 67 uL para dentro da moldura adesiva. Colocar imediatamente uma lamela sobre a criar uma superfície lisa e deixar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Retirar as lamelas para 1-2 min, enquanto a amostra é recolhida. </li><li> Colher uma alíquota de 1 ml da amostra e centrifugar a 5900 xg durante 30 seg. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 mL fresco PAB. </li><li> Tirar 2,5 mL da amostra concentrada e pipeta para um pré-prepaalmofada de agarose vermelho. Espalhar a amostra uniformemente ao longo da superfície plana da almofada de agarose. Retire a armação adesivo da lâmina de microscópio, usando uma pinça sem tocar na almofada de agarose. </li><li> Transferir a almofada de agarose da lâmina de microscópio de 35 mm de diâmetro prato de Petri com uma lamela de vidro de fundo. Inverta a almofada de agarose de modo que a suspensão de células e lamela da placa de Petri estão em contacto directo uns com os outros. O fundo da placa de Petri, tem um índice de refracção de 1,525 para a imagem de alta resolução. </li></ol></li><li> Preparação de S. Vivo Células aureus for Imaging <ol><li> Inocular 10 ml de caldo-L com uma única colónia de S. aureus estirpe SA94 (SH1000 contendo araras-FtsZ-GFP e pGL485; Erm r, Cm r) 25. Crescer durante a noite a uma baixa velocidade (100 rpm) agitador rotativo a 37 ° C. </li><li> Dilui-se a cultura durante a noite a 0,05 A 600 (medida de absorvância a 600 nm) em caldo L fresco com IPTG 0,05 mM (isoβ propil-1-D-tiogalactopiranosido) para induzir a produção da proteína de fusão. </li><li> Incubar a 37 ° C com alta velocidade (215 rpm), agitando e crescem até meio da fase exponencial (A 600 ~ 0,4). </li><li> Siga os passos 1.1.3 - 1.1.8, como descrito para B. subtilis preparação-de células vivas. Nota: adicionar a concentração apropriada de indutor para a solução de agarose no passo 1.1.3 para as estirpes que expressam uma proteína de fusão fluorescentes sob controlo induzível. </li></ol></li></ol> 2 Preparação do Microscópio Este método usa um DeltaVision OMX (microscópio óptico, experimental) sistema de imagem 3D-SIM equipado com um módulo chama. Para as experiências descritas, apenas um laser e uma câmara são utilizadas. O trajecto de luz e iluminação são descritas na Figura 1. Este método assume que o microscópio tem calibração adequada, a função de transferência óptica (OTF)arquivos e manutenção colimação luz realizada. <ol><li> Para experimentos com imagens de células vivas, certifique-se a fase de aquecimento está ligado à fase cerâmica eo colar objectivo de aquecimento está ligado ao objetivo (60X 1,42 objetivo petróleo NA). </li><li> Ligue os aquecedores objetivas e de palco, pelo menos 4 horas antes da imagem e rampa lentamente a temperatura para o valor desejado a uma taxa máxima de 5 ° C / h. Recomenda-se iniciar este processo na noite anterior à imagem e rampa a 3 ° C / 4 horas. Para os experimentos de células vivas com B. subtilis, a maioria das experiências foram realizadas a 30 ° C. Para S. aureus, todas as experiências são realizadas a 37 ° C. </li><li> No dia da experiência, ligar o sistema, pelo menos, 1 hora antes da imagem para permitir que o sistema e lasers para estabilizar totalmente. Carregue a inserção pequena fase prato para o palco aquecido para pré-aquecer. <ol><li> Ligue a estação de trabalho do controlador mestre. </li><li> Ligue o workstat processamento de imagemião. </li><li> Ligue o refrigerador câmera localizada no piso fora do recinto microscópio. </li><li> Ligue todas as câmeras scmos (mesmo que eles não vão ser usados). </li><li> Dentro do laser e eletrônica gabinete, ligue: <ol><li> Chassis instrumento controlador. </li><li> Chassis Nanomotion. </li><li> Jena controlador para Z piezo. </li><li> Todos os controladores de motor 4 galvo. </li><li> Módulo de controle do laser primário. </li><li> Módulo de controle do laser secundário. </li><li> Todas as estações de trabalho da câmara. </li><li> Workstation OMXIC. </li></ol></li><li> Na estação de trabalho do controlador mestre, abra o software OMX, clicando no ícone. Defina o caminho do arquivo para o salvamento de dados em uma pasta de dados apropriado. </li><li> Para inicializar o hardware, vá para o menu Hardware, selecione Hardware e clique no botão Restart Hardware. Fechar a janela. </li><li> Iniciar o softWoRx software.Turn nos lasers necessários para as experiências (488 nm). </li><li> Ligue a chave de ignição para a trava de segurança laser. </li><li> Garantir a gaveta filtro dicróico correto está inserido abaixo do objetivo. Para GFP, que é o padrão (ou fixado) de gaveta. </li><li> Em OMX SF, vá ao menu Arquivo, selecione Configurações e selecione a gaveta fixa no menu suspenso gaveta. Fechar a janela. </li><li> Faça o seguinte na tela principal do software, na seção Parâmetros de luz: <ol><li> Ative a câmera adequada para o laser de excitação e filtro de emissão (ITCF) câmera da seleção Channel. </li><li> Verifique o modo de imagem está definido para Seqüencial. </li><li> Verifique o caminho óptico é definido para SI. </li><li> Verifique o Modo está definido para 95 MHz. </li><li> Confira o laser 488 é selecionado na excitação. </li><li> Defina o <strong&gt; Tamanho de 512 x 512 para o tamanho da janela e Binning de 1 x 1. </li></ol></li><li> Na guia Experiência, garantir Tipo está definido para SI a partir do menu drop-down. </li><li> Certifique-se de corte é ativado e que o espaçamento seção óptica é definida como 0,125. </li><li> Certifique-se de ponto de foco quando iniciar a análise é do meio. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Aplicar uma gota de óleo para o início do objectivo. Para 37 ° C, o óleo inicial recomendada tem um índice de refracção de 1,518 para melhor corresponder ao índice de refracção da camada de gel utilizado para a montagem das células bacterianas, a 37 ° C (veja passo 1.1.3). </li><li> Coloque o prato de amostra Petri contendo as células preparadas para a inserção palco e cubra com a tampa de aquecimento circular. Baixar a platina até que o óleo atinge a parte inferior doa placa de Petri amostra. </li><li> Colocar a placa de aquecer-se equilibrar durante 15 min na fase. Usando uma definição baixa exposição de 5 ms ou menos (localizado na seção Parâmetros de luz), o foco na amostra, utilizando os controles de posicionamento nano estágio (DZ, localizado na seção Nano Posicionamento). Concentre-se para baixo e através da amostra para determinar se a luz é espalhada de maneira uniforme acima e abaixo do plano focal da amostra. Se a função de dispersão não é mesmo (aberração esférica), limpar o fundo do prato de amostras e o objectivo com clorofórmio. Troque o óleo e repita esta etapa até que seja encontrada uma correspondência adequada entre o índice de refração do óleo e da amostra para minimizar a aberração esférica. </li><li> Usando 0,5 um dZ tamanhos de passo, marcar a parte superior e na parte inferior da pilha de imagem. Volte para o meio da amostra. Clique no botão Obter Espessura na aba Experimente definir a espessura de aquisição de amostra. Keep a altura da pilha a um mínimo e tendo o cuidado para não cortar a parte superior e inferior dos Z-rings. As espessuras típicas para B. subtilis são amostras 2-3 ^ m. </li><li> Determine o valor de intensidade máxima (Max) a imagem de amostra de com a exposição e% T configurações atuais. Este valor encontra-se abaixo da janela de imagem. Para imagens de lapso de tempo, ajustar a exposição e% T para obter uma intensidade máxima de 1.100-1.400 acima do fundo para a imagem. A intensidade mínima de 1,000 acima do fundo é necessária para obter a reconstrução da imagem. Imagem de um one-off para, aumentar a intensidade máxima de 4.000-5.000. </li><li> Ative a seção Time-lapse na guia Experiência. Defina a taxa de quadros necessários e tempo total. No arquivo de dados, digite um nome de arquivo apropriado. Clique no botão Executar para iniciar a aquisição de imagem. Nota: A aquisição de imagens é completa quando o gbar reen Progress está terminado e um arquivo de log é exibido para o conjunto de dados na pasta de dados apropriado. </li></ol> 4 Verificação da Qualidade de Dados <ol><li> No início da aquisição da imagem, observe o valor máximo de intensidade da imagem no início da aquisição da imagem para o primeiro quadro da série histórica. No final da aquisição do primeiro quadro, verificar que não foi mais do que uma diminuição de 10% na intensidade do sinal por meio do z-pilha para este primeiro quadro. Se houve mais do que este nível de fotodegradação no primeiro momento, os dados através da série de tempo vai ser de qualidade insuficiente para análise e aquisição vezes séries pode ser interrompido. </li><li> No final da aquisição da série de tempo, abrir o ficheiro de imagem em bruto resultante com .dv sufixo e determinar a diminuição da intensidade máxima do sinal a partir do início da série tempo para a imagem final. Descarte qualquer momentos onde não tem a abelhan mais de 30% de fotodegradação. </li></ol> 5. imagens Reconstrução 3D-SIM <ol><li> No menu Processos, activar a janela do SI Reconstrução. Use as configurações pré-existentes para todos os parâmetros. </li><li> Ative o botão OTF Específica Use Channel, e definido como o conjunto de filtro padrão. Ative o Específico Use Canal botão KO ângulos e definida como o conjunto de filtro padrão. </li><li> Arraste e solte a matéria (.dv) arquivo para o espaço de arquivo de entrada. Clique Faça. O arquivo de saída terá o mesmo nome do arquivo de entrada com _SI adicionado no final. Nota: Este processo de reconstrução pode ser executado como uma tarefa utilizando a função Task Builder no menu Processo se vários arquivos devem ser processados. </li></ol> 6 Exportação de Dados e Análise <ol><li> Use Imaris para visualizar imagens 3D no modo e ex superardados de imagem de porta como tiff (300 dpi) ou AVI (sem compressão). O tamanho do comprimento em Imaris pode ser realizado utilizando a ferramenta de medição no modo de ultrapassar. </li><li> Gerando parcelas de intensidade 3D do anel Z a partir de dados de imagem 3D-SIM: <ol><li> Examinar a distribuição de FtsZ em torno do anel Z e para criar parcelas intensidade 3D <ol><li> Abra um arquivo de imagem 3D para visualizar os z-fatias individuais. Use a ferramenta visualizador de volume localizado na guia Vista menu para cortar uma região de interesse. </li><li> Digite o número de janela para esta imagem 3D na janela de entrada e digite um novo e sem uso número janela para janela de saída. O botão select região ficará disponível para cortar um anel Z individual de interesse do campo da visão original de 40 × 40 m. </li><li> Ajustar o eixo desejado e do grau de rotação na aba de rotação. Clique no botão fazê-lo. Percorrer o volume para se obter o desejado perspectiva do anel Z. </li><li> Use a ferramenta Inspetor dados e ajuste tele dimensões de coluna / linha para criar uma nova região de interesse em torno de um anel Z individual. Clique no centro da imagem para posicionar esta nova região de interesse. Os dados da imagem de texto é uma tabela que mostra gerado automaticamente a intensidade de fluorescência de cada pixel no interior da região de interesse. </li><li> Clique no botão 3D gráfico para visualizar inicialmente a trama intensidade. </li><li> Em alternativa, os dados de imagem de texto pode ser exportado, clicando no botão salvar os dados da tabela no menu arquivo. </li><li> Copie os dados de imagem do arquivo de texto salvos em um novo planilha. Selecione todas as células dentro da planilha e criar um novo gráfico 3D Surface. Formate o gráfico intensidade enredo 3D para publicação. </li></ol></li><li> Para dados time-lapse repita os passos 6.2.1.1 - 6.2.1.7 em cada um dos diferentes pontos de tempo a partir do arquivo de imagem 3D. </li></ol></li><li> Acompanhando Intensidade Média de fluorescência ao longo do tempo <ol><li> Use os dados de imagem de texto para acompanhar os fluoresce intensidade ao longo do tempo numa região de interesse. </li><li> Escolha das células que correspondem à região de interesse. </li><li> Calcula-se a intensidade média da fluorescência em cada ponto de tempo para esta região de interesse. </li><li> Use os valores médios de intensidade da fluorescência para gerar um gráfico de linha em separado. </li></ol></li></ol>

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	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

Imagens ao vivo de células fluorescentes é uma ferramenta poderosa que permite a observação de mudanças dinâmicas no interior das células ao longo do tempo. Imagens ao vivo a biologia celular bacteriana tem sido difícil devido ao tamanho pequeno de células e redução da capacidade de as células bacterianas para suportar a exposição repetida à luz de excitação. F3D-SIM ampliou as ferramentas disponíveis para interrogar toda a biologia celular, mas é necessário para executar cuidadosamente esta técnica como artefatos podem ser introduzidas se mal aplicada. Há uma série de considerações importantes para o sucesso do uso dessa técnica. Como se trata de um grande campo método de imagem de fluorescência, que se baseia na utilização da função de dispersão de luz emitida a, incompatibilidade índice de refracção e aberração esférica da luz emitida deve ser evitado, para permitir a reconstrução da imagem exacta. A utilização de lamelas de 0,17 mm de espessura de uma alta qualidade, para evitar a variação de intensidade de sinal, devido à variabilidade de espessura de vidro nas tampaslabial é altamente recomendado. É extremamente importante avaliar cuidadosamente a aberração esférica da luz emitida durante os estágios iniciais de todas as experiências e ajustar a imersão índice de refração do óleo, conforme necessário. Isto pode variar de dia-a-dia, uma vez que é dependente tanto da temperatura e a montagem de meios de comunicação / substrato da amostra. A utilização do óleo incorrecto resultará na reconstrução das imagens inferiores com artefactos, tais como halos e sinais de eco. No final do processo de reconstrução de imagem, para cada fase de uma medida da qualidade da reconstrução podem ser obtidas pela &quot;melhor ajuste do ângulo de kO&quot; para cada fase / ângulo de iluminação. Se este valor for inferior a 1, para cada ângulo, então a qualidade do reconstruída será provavelmente elevado. Se este valor for acima de 6, o mais provável é que a imagem reconstruída conterá artefactos. Artefactos comuns incluem: i) o aparecimento de riscas na imagem que correspondema um dos ângulos da grade. Isto pode resultar de sinal mais baixo de que ângulo de grade; ii) haloing em torno das estruturas. Isto pode resultar de níveis muito desiguais de sinal a partir de estruturas brilhantes, em comparação com as estruturas envolventes, um desfasamento entre o índice de refracção do óleo e da amostra, ou pode ser devido às estruturas na imagem a ser demasiado amorfo e não contendo &quot;estrutura&quot; suficiente para ser reconhecido pelo algoritmo; iii) «favo de mel», que resulta a partir de um sinal de baixa-ruído na imagem, em geral, devido ao sinal de fundo elevado; iv) as estruturas que são esticadas / xy alongados em que pode ser devido a incompatibilidade de refracção índice de óleo e de amostra. Este artefato é difícil discernir para um usuário inexperiente. Recomenda-se que os novos usuários consultar um pesquisador SIM experiente para aconselhamento sobre a interpretação e análise de imagem quando começar a usar esta técnica. Tal como acontece com todas as experiências de imagem ao vivo de células fluorescentes, isto é importaçãoformiga para equilibrar cuidadosamente a entrada de energia de excitação, a fim de minimizar o grau de fotodegradação e fototoxicidade das células com sinal de emissão suficientes necessárias para reconstruir imagens com artefacto mínima. Fotobranqueamento excessivo (superior a 30% através de uma única pilha de aquisição z) vai levar a um padrão de listras na imagem reconstruída. Com o uso de câmeras scmos, imagens de super-resolução pode ser reconstruído com sucesso a partir de imagens brutas com sinal de emissão tão baixo como 1.000 contagens acima do fundo. Isto pode permitir que os tempos de exposição muito curto reduzindo assim fotobranqueamento e permitindo a captura rápida para cada quadro. Além disso, aumenta a quantidade de tempo entre os quadros para as células para se recuperar a partir do fornecimento de energia de excitação. Além disso, como o tempo de captura para cada quadro individual pode ser muito curto, o grau de artefacto introduzido por «motion blur &#39;durante uma captura indivíduo é reduzida com a utilização do presente método. Esta varição de 3D-SIM oferece uma série de outras vantagens sobre outras tecnologias super disponíveis e imagens de alta resolução para imagens ao vivo por biólogos de células bacterianas. O aumento de 2 vezes na resolução de todas as três dimensões e a capacidade de imagem superior a 30 um para uma amostra permite a imagiologia de células bacterianas (e mamíferos) integrais durante uma experiência. Técnicas como a localização de uma única molécula que são habitualmente desempenhadas na onda evanescente pode não conseguir a profundidade de penetração e uma amostra não oferecem informação sobre as células inteiras. Os recentes avanços que permitem a profundidades superiores de amostragem para esta técnica pode resultar em melhor resolução axial de células inteiras. Além disso, as técnicas de localização de moléculas individuais que exigem milhares de imagens em bruto a ser adquiridos também são limitadas na taxa de quadros que podem ser capturadas e pode exigir compromisso entre a taxa de captura de quadro e resolução espacial alcançado final, como a resolução espacial depende da número de vésperants gravadas dentro de um espaço definido. Diminuir o número de quadros capturados vão resultar em uma resolução espacial mais baixa, mas pode ser suficiente para se conseguir a resolução temporal necessária para o processo biológico de interesse. A quantidade de tempo de recuperação entre quadros também podem precisar de ser aumentada para minimizar a fototoxicidade em células vivas, limitando assim a duração e frequência em que o tempo-série pode ser obtido. Técnicas de alta resolução, como a microscopia eletrônica (ME) ou elétron cryotomography (ECT) oferecem uma maior resolução sobre 3D-SIM (e outras técnicas de microscopia óptica de super-resolução), mas devem ser realizados em amostras fixas. A fixação e processamento pode introduzir artefatos ea falta de rotulagem pode tornar difícil interpretação. Livre de marcador a ECT tem um contraste fraco e pode atingir profundidades de penetração da amostra de cerca de 500-200 nm, 24, de modo que, mesmo que a proteína de interesse pode ser identificada, a estrutura da proteína de uma célula bacteriana todo, não pode ser observado.Mesmo quando etiquetagem pode ser utilizado na EM, tais como com imuno, a formação de imagens é realizada apenas em 2D. 3D só é possível com o corte fino e reconstrução computacional das seções. O corte fino requer um técnico experiente, mas pode ser problemático e levar ao artefato. Com células vivas ou fixas, 3D-SIM não precisa ser incorporado de uma forma específica e as células podem ser preparadas rapidamente para imagens em um estado próximo natal. Este método é relativamente fácil de implementar por pesquisadores com experiência mínima em microscopia de fluorescência. As experiências podem ser realizadas em meios que suportem a função de célula saudável, enquanto não apresentam fluorescência ou gerar o sinal de fundo indevida. Para as células bacterianas, isto pode permitir o uso de diversos tipos de complexo e meios mínimos ou o uso de meios sólidos ou semi-sólidos para controlar a motilidade celular bacteriana. Muitos biólogos que já projetadas proteína fluorescente (FP) fusões e testado a funcionalidade doestas fusões podem ocupar essa tecnologia rapidamente, sem mais engenharia e validação de novas fusões PF fotoactivï¿½eis. Encontramos, como observação geral, que S. aureus foi mais suscetível à fotodegradação durante o exame com fusões PF que B. subtilis. Usando nossos métodos 3D-SIM original, onde o padrão de grade foi gerada por uma grade física, não fomos capazes de realizar imagens de células vivas com um número de S. fusões aureus PF. No entanto, com este método avançado F3D-SIM, fomos capazes de imagem estas fusões PF e realizar séries de tempo curto para capturar a dinâmica destas proteínas marcadas. Este é, provavelmente, devido aos tempos de exposição reduzidos necessários para a imagem latente e aumento do tempo entre os quadros para a recuperação das células. OMX chama 3D-SIM é uma tecnologia disponível no mercado que pode ser relativamente fácil de implementar em um único laboratório ou uma instalação de imagem do núcleo. Cuidados devem ser tomados para realizar a técnica para evitar artifatos, devido à má preparação da amostra ou pobre de captura de imagem. Uma vez que a técnica é dominada, estudos sobre a estrutura da proteína e dinâmica em pequenos organismos, tais como bactérias pode ser realizada na fluorescência único ou multi-cor.

Um número de diferentes tecnologias de imagem têm sido utilizados ao longo dos anos para estudar bactérias, incluindo várias técnicas de microscopia de elétrons e ópticos. Embora microscopia electrónica oferece uma resolução extremamente alta, para baixo para o nanómetro, a necessidade de um vácuo e a utilização de agentes de contraste tem limitado a esta técnica para amostras fixadas e embutidos. Artefatos também podem ser introduzidas devido à preparação da amostra demorado e um profissional qualificado é necessário para preparar as amostras, e para analisar e interpretar as imagens resultantes. A microscopia óptica oferece os benefícios de simples preparação da amostra e aplicação de várias etiquetas com relativa facilidade em comparação com microscopia eletrônica. Usando proteínas fluorescentes e os conjugados de tintura, a capacidade de estudar células vivas com microscopia de fluorescência também é possível. Com melhorias na estabilidade fluoróforo e proteína fluorescente tamanho / estrutura que levem à diminuição toxicidade celular, bem como avanços na detecção de câmera tecnolologia, microscopia de fluorescência confocal usando sistemas de imagem de campo amplo e expandiu significativamente a nossa compreensão da dinâmica espacial de células. Utilizando estas técnicas, o nosso conhecimento sobre a célula bacteriana ao longo dos últimos 20 anos, tem progredido significativamente para uma visão mais detalhada revela que um elevado nível de organização estrutural e proteína dentro da célula bacteriana 1. No entanto, os métodos convencionais de microscopia óptica são de difracção limitada, o que significa que a resolução inerente é cerca de metade do comprimento de onda da luz de excitação utilizado. Por conseguinte, mesmo com o sistema de microscopia óptica convencional mais ideal, o melhor resolução lateral é de cerca de 220-250 nm e a resolução axial é de cerca de 500 nm (para uma revisão ver Schermelleh et al. 2). Para os biólogos de células bacterianas, em particular, isso ainda limita muito o nosso entendimento da organização espacial dessas pequenas células; sendo apenas 1-2 uM em diameter e 1-10 um de comprimento. Há também a necessidade de técnicas de resolução mais altas que podem ser realizados em células vivas, onde o comportamento espacial dinâmica de uma proteína pode ser analisada para complementar os dados in vitro. Na última década, foram desenvolvidas diversas técnicas de imagem de fluorescência de super-resolução. Microscopia de super-resolução descreve técnicas de imagem que, pelo menos, o dobro da resolução lateral obtidas com microscópio óptico convencional, ultrapassando assim a barreira de difração. Essas técnicas de manipular a iluminação e / ou análise da luz emitida para criar aumentos reais do aparente resolução. Atualmente, existem três tipos principais de técnicas de super-resolução - i) estimulada microscopia esgotamento emissão 3 (STED); ii) microscopia de uma única molécula de localização, incluindo técnicas como a microscopia fotoativação localização 4,5 (PALM), microscopia óptica reconstrução estocástica <sup&gt; 6 (STORM), STORM direto 7 (dSTORM) e esgotamento do solo do estado com molécula indivíduo de retorno 8 (GDSIM); e iii) microscopia de iluminação estruturada 9-12 (SIM). Técnicas de localização única molécula oferecem os maiores aumentos na resolução lateral, até entre 10-40 nm em amostras biológicas. Em muitas das implementações de microscopia localização única molécula, a profundidade de amostragem é limitada para a onda evanescente e as implementações iniciais de STED também foram limitados na profundidade de amostragem. Melhorias No entanto, os avanços recentes, como o uso de óptica adaptativa, a exploração do astigmatismo na função de dispersão em diferentes pontos focais, detecção multi-avião e usando dois objetivos para inferir a posição axial da luz emitida vimos, tanto no axial resolução e à profundidade de amostragem em ambos molécula STED e única localização 13,14. Taxas de aquisição de dados para STED e técnicas de localização única moléculatambém são relativamente lenta devido ao grande número de imagens que necessitam de ser adquirido para a máxima resolução (até 50.000 por técnicas de localização). Esta aquisição de dados é lenta não se presta à imagem de amostras vivas sem modificações personalizadas que muitas vezes são bastante caros. Estas duas técnicas são atualmente perfeitamente adaptado para amostras fixadas (para revisão ver 2,15), no entanto, muito trabalho está sendo feito para resolver esta limitação. Microscopia estruturada tridimensional iluminação (3D-SIM) é uma técnica de campo largo que melhora a resolução lateral e axial, resultando na resolução de cerca de 110 e 280 nm, respectivamente. Profundidade de amostragem é de até 30 um a partir da lamela, permitindo imagens de células inteiras. A variação de 3D-SIM desenvolvido por Sedat, Agard, e Gustaffsson na plataforma (OMX) microscópio óptico Experimental envolve iluminar a amostra com um padrão de grelha conhecida, que é movida para 15 diferentesposições em cada plano z 9-11. As franjas nos padrões moiré resultantes que são criadas no espaço de freqüência fora da região observável são medidos. A informação a partir do espectro de frequências é computacionalmente reconstruída para gerar uma imagem de super-resolução visível 10,11. A velocidade relativa no qual as imagens cruas podem ser obtidas com essa técnica permite que imagens de células vivas. No entanto, é importante notar que, para os processos biológicos que ocorrem numa escala de tempo de segundos, a velocidade de aquisição das imagens em bruto continua a ser demasiado lenta para capturar as alterações dinâmicas. Para séries temporais com uma taxa de captura de segundos, a aquisição repetida sem tempo de recuperação suficiente pode levar a fototoxicidade e fotodegradação, especialmente durante a imagem ao vivo de pequenas células bacterianas. Para superar esses problemas, os avanços recentes para rápido 3D-SIM (F3D-SIM) têm sido desenvolvidos. Aqui nós descrevemos um conhecido como OMX chama 16 que foi introduced no final de 2011 Esta tecnologia da iluminação cria padronizada sem o uso de uma grade física como foi utilizado em sistemas anteriores. A utilização de feixes de luz interferente e nova tecnologia obturador permite a criação da luz modelada sobre a amostra de uma forma muito rápida. A velocidade de aquisição das imagens foi ainda mais reforçada com a introdução de complementar científico semicondutor de óxido metálico (scmos) câmeras, especialmente quando comparado com as câmeras EMCCD existentes. Essas mudanças resultaram em uma possível taxa de aquisição de imagem de um quadro por segundo para uma profundidade de amostragem de 1 mícron (512 x 512 pixels, 9 z fatias), permitindo o monitoramento de mudanças dinâmicas no interior das células que ocorrem dentro de segundos 16. A diminuição nos exposição (excitação) vezes aparente para células vivas, utilizando este método permite que tanto séries de tempo prolongado para serem capturados ou um aumento na taxa de captação. Aqui nós descrevemos a aplicação de microscopia F3D-SIM para examine a estrutura e movimento dinâmico do anel cytokinetic Z nas células de duas espécies bacterianas: o Bacillus subtilis organismo modelo em forma de haste e o agente patogénico humano cocoides Staphylococcus aureus. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto afim da tubulina, que desempenha um papel chave na divisão celular em bactérias 17,18. Ela se localiza no local de divisão para recrutar pelo menos 20 outras proteínas de divisão, formando o aparelho de divisão 17,18, e acredita-se proporcionar a força de constrição de células 19-23. Este método revela que FtsZ é homogeneamente distribuída ao redor do anel Z, em ambos os organismos em um arranjo talão-like; resolver o problema de longa data de o anel Z é uma correia contínua uniforme em torno da célula, tal como visualizado por microscopia de fluorescência de campo amplo convencional, ou uma estrutura descontínua, tal como sugerido por electrões crio-tomografia (ECT) 24. Mostramos como a capacidade de 3D-SIM pode melhorar muito exame espacial de pequena (1diâmetro mm): células redondas como S. aureus que divido em três planos perpendiculares consecutivos (x, y, z). Estudos de lapso de tempo usando essas técnicas mostram que a estrutura do anel Z é dinâmico, com alterações macroscópicas organização dentro do anel, em vez de moléculas FtsZ entrando e saindo de um andaime fixo 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

Imagem de amostras biológicas por meio de microscopia de fluorescência tem avançado substancialmente com as novas tecnologias para superar a barreira resolução da difração da luz permitindo super-resolução de amostras vivas. Atualmente, existem três tipos principais de técnicas de super-resolução - esgotamento emissão estimulada (STED), microscopia localização única molécula (incluindo técnicas como PALM, tempestade, e GDSIM) e microscopia de iluminação estruturada (SIM). Enquanto as técnicas de localização STED e única molécula mostrar os maiores aumentos na resolução, eles têm sido mais lento para oferecer maior velocidade de aquisição de imagem. Tridimensional SIM (SIM-3D) é um grande campo da técnica de microscopia de fluorescência, que oferece um número de vantagens sobre ambos molécula única localização e STED. A resolução é melhorada, com resoluções típicas laterais e axiais de 110 e 280 nm, respectivamente, e profundidade de amostragem de até 30 mm a partir da lamela, permitindoimagiologia de células inteiras. Os recentes avanços (rápido 3D-SIM) para a tecnologia de aumento da taxa de captura de imagens em bruto permite a captura rápida de processos biológicos que ocorrem em segundos, reduzindo significativamente foto-toxicidade e fotodegradação. Aqui descreve-se a utilização de um tal método de imagem de células bacterianas contendo a proteína cytokinetic fluorescentemente marcado FtsZ para mostrar como as células são analisadas e o tipo de informação única, que esta técnica pode fornecer.

Neste estudo foi visualizada a proteína bacteriana divisão celular FtsZ, expressa em células vivas como uma fusão FtsZ-GFP, para ilustrar as vantagens de poderosos F3D-SIM através de microscopia de fluorescência convencional para estudar a localização da proteína bacteriana e dinâmica. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto afim da tubulina polimeriza em que uma estrutura em anel dinâmico em torno da circunferência da célula. O anel Z tem uma função importante na divisão celular: a sua montagem marca o futuro local de divisão, recruta todas as proteínas de divisão celular a este site, e anel Z constrição parece fornecer a força para permitir o movimento para dentro do envelope celular durante a citocinese 17 , 18. Quando visualizadas por microscopia de fluorescência de campo amplo convencional, o anel Z aparece como uma banda única transversal de fluorescência em bactérias em forma de bastonete, incluindo os organismos mais bem estudados tal como B. subtilis (Figura 2A), &lt;em&gt; E. coli, e C. crescentus. É importante notar que a intensidade de fluorescência ao longo desta faixa parece ser mais ou menos uniforme, e o padrão de localização oferece muito pouco conhecimento sobre a organização estrutural e de distribuição dos polímeros FtsZ dentro do anel Z. Quando as mesmas células são examinadas usando o método F3D-SIM descrito aqui (Figura 2B), no entanto, as vantagens desta técnica são imediatamente aparentes. Em primeiro lugar, a rotação da imagem 3D-SIM em torno do eixo z, permite a visualização do anel Z como uma estrutura de anel genuíno no espaço tridimensional (Figuras 2C e 3A). Juntamente com o aumento na resolução, isto revela que a distribuição de FtsZ no anel Z é, de facto, altamente heterogénea (Figura 3). A melhoria na resolução também permite-nos ver os anéis Z que já começaram o processo de constrição para formar um septo divisão (indicado pela invaginação da membrana celular em &lt;strong&gt; Figura 2C e 2D). Exemplos adicionais de B. anéis Z subtilis visualizadas por esta técnica são mostrados na Figura 3Bi - 3Biv e ilustram como a intensidade de fluorescência em torno do anel Z nunca é a mesma. Além disso, as regiões de muito baixa intensidade de fluorescência são frequentemente observados. Referimo-nos a estas regiões como lacunas (setas brancas). Observamos essas lacunas em 15% de todos os anéis Z examinados (n = 84) e, predominantemente, em anéis Z com um diâmetro de 800-900 nm (93%). Para quantificar estas observações, as parcelas de intensidade 3D ​​foram criados do anel Z e são mostrados na Figura 3CI e 3CII usando os anéis Z mostrados nas Figuras 3Biii e 3Biv. As parcelas de intensidade mostram que tipicamente a quantidade de fluorescência no anel Z pode variar até 3-4 vezes em diferentes regiões do B. anel Z subtilis. Além disso os lotes de intensidade 3D mostram que a gaps de fluorescência dentro do anel Z quase ler níveis basais de fluorescência de fundo (seta preta na figura 3CI). Estes exemplos acima mostram boas reconstruções do anel Z e são dependentes de luz suficiente ser emitida a partir da amostra sem fotobranqueamento significativa. Isto é conseguido através do brilho do fluoróforo de GFP fundida a FtsZ e sua abundância na célula sob estas condições (elevada relação sinal-ruído). Em outras células, onde a relação sinal-ruído é o baixo de reconstrução da imagem é pobre. Para simular esta ocorrência com FtsZ-GFP, a quantidade de sinal de emissão recolhidos a partir do B. células subtilis foi reduzida através da redução da energia de excitação. Tal como mostrado na Figura 3D, uma redução de 100 vezes de energia resulta na excitação de uma imagem do Z-anel que possui artefactos significativos. Isso ocorre como consequência de contraste local insuficiente entre o sinal FtsZ-GFP eo fundo levando a poor reconstrução da imagem. Curiosamente, B. Z anéis subtilis mostrou lacunas mais pronunciados e heterogeneidade nas regiões superior e inferior do anel, mas não nos lados do anel (Figura 3B). Isto ocorre por causa da diferença de resolução conseguida por esta variação de 3D-SIM no plano lateral, em relação ao plano axial. Isto resulta nas regiões superior e inferior do anel Z (plano lateral) a ser trabalhada com a melhor resolução possível. As lacunas no anel Z são demasiado pequenos para serem detectados nos lados do anel Z tal como visualizado no plano axial, que tem cerca de metade da resolução da superfície lateral. As bactérias que têm uma morfologia cocoides, tais como S. aureus, tem anéis de Z, que se encontram posicionados em todos os planos. Então, imaginando o anel Z quando se situa no plano lateral (ou perto disso) fornece a capacidade de imagem todas as regiões do anel com ótima resolução. Aproveitando isso, examinamos a estrutura deo anel Z em directo de S. células aureus, utilizando-se uma estirpe que contém um uma fusão GFP-FtsZ rolamento plasmídeo. A produção desta fusão está sob o controlo de um promotor indutível SPAC P (ver o passo 1.2.1). Quando examinados por, no plano axial, S. Z anéis aureus apareceu idêntico a B. Z subtilis anéis que estão presentes no mesmo plano (figura 4AI). Contudo, os anéis de imagiologia Z no plano lateral confirmou que todo o anel Z apareceu tanto talão semelhante e heterogénea. Cerca de 26% destes anéis também mostraram, pelo menos, um &quot;fosso&quot; visíveis de fluorescência (Figura 4Aii, 4B). Semelhante a B. subtilis FtsZ, parcelas de intensidade de fluorescência mostram que a intensidade de fluorescência do anel Z varia tanto quanto 4-6 vezes em diferentes áreas do S. aureus anel Z (Figura 4C). O comprimento e largura dos grânulos pode ser medida (Consulte Diagrama esquemático na Figura 4D). Isto mostrou que 80% dos anéis Z (n = 43) que foram examinados tinha um comprimento de 200 nm de talão, atingindo um comprimento máximo de 400 nm. A largura de grânulos, por outro lado, medido a 200 nm. Houve, em média, 12 ± 2 (SEM) contas FtsZ por anel Z. Localização de dados semelhante foi observado quando FtsZ nativa foi visualizado com esses métodos usando microscopia de imunofluorescência (IFM), mostrando que este padrão de localização heterogênea e cordão-como era genuína e não um artefato causado pela expressão de FtsZ-GFP, além de FtsZ nativa (dados não mostrada). Este avanço do 3D-SIM é capaz de mostrar que o anel Z aparece como uma estrutura heterogénea e é possivelmente descontínuo na natureza. Para abordar a questão de como essa estrutura Z-ring heterogêneo sofre constrição e facilita a divisão celular, uma análise de time-lapse de Z dinâmica anel pode ser realizada. Um dos principais desafios commicroscopia de fluorescência estudos time-lapse é a minimização de fotodegradação e fototoxicidade amostra durante o exame. 3D-SIM exige um grande número de imagens em bruto a ser obtido, o que significa que a fotodegradação de uma amostra ao longo do tempo resulta numa proporção baixa de sinal-ruído do sinal que conduz à insuficiente para permitir a reconstrução da imagem apropriados. A aplicação da nova tecnologia minimiza a quantidade de energia utilizada para a excitação de cada exposição e, consequentemente, uma diminuição da energia de entrar nas células vivas. Ele faz isso através de uma combinação de interferometria de feixe de luz para criar o padrão de estrutura sobre a amostra e a utilização de câmaras científicos CMOS que podem aumentar a sensibilidade e eficiência quântica. Esta combinação resulta em aquisição z-pilha de 1 mM por segundo (512 × 512 pixels x 8 z fatias) em comparação com 1 mM por 5-8 segundos (512 x 512 pixels x 8 z fatias) obtido com a iteração anterior 3D-SIM (descrito em Riglar et 26 ai.).Diminuir o tempo de aquisição de imagem e ajustes de exposição também podem ajudar a minimizar fototoxicidade de células vivas que é particularmente relevante em estudos de lapso de tempo. A nova tecnologia apresentada aqui também aborda outro problema na geração de imagens ao vivo de células que nos referimos como &quot;motion blur&quot;, que, neste contexto, refere-se à localização de proteínas mudança na aquisição da imagem. Ao diminuir o tempo de aquisição de imagem a quantidade de &quot;motion blur&quot; são minimizadas, criando assim uma reconstrução de imagem mais preciso. Estudos anteriores que abordaram como FtsZ é organizada dentro do anel Z não ter sido capaz de mostrar como a estrutura do anel Z muda ao longo do tempo. Para investigar este aspecto realizamos time-lapse usando F3D-SIM. Esta aquisição permitiu à de uma imagem 3D-SIM do anel Z em B. subtilis cada 5-10 seg durante um período de 50 segundos, o que anteriormente não era possível nesta escala de tempo. Mostrado na Figura 5A é uma example das rápidas mudanças na distribuição FtsZ dentro do anel Z ao longo do tempo (diâmetro de 890 nm). Outros anéis Z que estavam visivelmente no processo de constrição também mostraram ter dinâmicas semelhantes que afectaram a distribuição de FtsZ em torno do anel Z (não mostrado). Parcelas intensidade 3D ​​também pode ser gerado para cada um dos pontos de tempo para quantificar e valorizar as contínuas mudanças na intensidade de fluorescência e, assim, abundância relativa de FtsZ em diferentes regiões do anel Z sobre uma escala de tempo de segundos (Figura 5B). As regiões de interesse pode ser identificada a partir destas parcelas de intensidade para acompanhar as flutuações de intensidade de fluorescência (Figura 5C). O acompanhamento destas mudanças na estrutura do anel Z nessas condições seria praticamente impossível sem a tecnologia avançada F3D-SIM. Além disso, esse trabalho revelou que em S. aureus o movimento dinâmico de FtsZ é semelhante à observada em B. subtilis. S. células aureus RN4220 producing FtsZ-GFP foram fotografadas por 50 segundos a 10 intervalos de tempo sec. Alterações à heterogeneidade do anel Z em S. aureus com F3D-SIM também foram semelhantes para B. subtilis (ver setas e setas da figura 6). Estes estudos lapso de tempo apoiar um modelo de constrição anel Z (o modelo beliscar iterativo), que foi predito por meio de exame de C. fixo células crescentus, mas não podia ser demonstrada devido à necessidade de examinar dinâmica Z-ring 27 em células vivas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Diagrama esquemático da configuração óptica do F3D-SIM utilizado neste estudo luz. Laser a partir da tabela de laser é dirigida através de uma fibra de um cartão SIM para lentes de colimação e fixa grade, em seguida, para o módulo de controlo de fase, que cria, tanto o comprimento de onda específico espaçamento ideal of ± as vigas de 1 a ordem do feixe central de ordem zero e as etapas da fase de recolha SIM. As vigas em seguida, insira o módulo de controle do ângulo em que os raios são refletidos para os três grupos diferentes para criar os três ângulos de iluminação. As vigas em seguida, entrar no microscópio e caminho da luz, como mostrado (Modificado com permissão de Paul Goodwin, API). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2 Comparação da fluorescência de campo amplo convencional e imagens 3D-SIM de B. As células que expressam subtilis FtsZ-GFP. (A) convencional de grande campo de imagem de fluorescência de B. As células que expressam subtilis FtsZ-GFP (SU570; verde) como uma única cópia, também foram coradas com o corante de membrana FM4-64 (vermelho). Barra de escala = 5 um. A imagem foi obtida através de um microscópio de fluorescência vertical.(B) imagem 3D-SIM do mesmo B. subtilis cepa expressar FtsZ-GFP, manchado com FM4-64. Regiões de interesse a partir da imagem pode ser selecionado (caixa tracejada) para ampliar. A imagem também pode ser girada em torno do eixo z para ver anéis FtsZ 3D no plano axial. (C, D) A remoção de fora-de- foco de luz e uma melhor resolução de imagem fornecidos pela 3D-SIM permite a visualização nítida dos anéis de Z (incluindo aqueles que estão contraindo) e da membrana celular interna durante a divisão (indicado por setas brancas). Note-se que o texto do protocolo descreve a visualização de uma única fluoróforo. No entanto, o procedimento pode ser adaptado para a aquisição de um máximo de quatro comprimentos de onda diferentes ao mesmo tempo. Este número foi reproduzido a partir de Strauss et al 16. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Imagens representativas do anel Z em forma de bastonete células bacterianas vivas (B. subtilis) expressando FtsZ-GFP usando o 3D-SIM. (Ai) O anel Z é observado como uma banda de fluorescência perpendicular ao eixo longitudinal da célula de que está no plano xy. (Aii) A imagem foi rodado em torno do z -axis usando software de visualização 3D Imaris (consulte protocolo passo 6.1), de modo que se está olhando através da estrutura do anel para ver claramente como FtsZ é distribuído dentro do anel Z. Esta imagem, agora no plano ZX mostra que o anel tem uma distribuição heterogênea de FtsZ com regiões de muito pouca ou nenhuma fluorescência (setas brancas). A imagem deve ser girada para observar essas regiões &#39;gap&#39; de fluorescência. Bi-Biv mostrar mais exemplos de anéis Z girada que agora se encontram no plano ZX. Anéis em Z (bi-iii) têm um diâmetro de 0,9 um. ~ (Biv) mostra um anel Z com um diâmetro de only 0,65 uM constrição submetidos. (Ci) Este perfil típico intensidade 3D ​​ilustra a intensidade da fluorescência (isto é, concentração) diferenças na FtsZ-GFP em torno do anel de Z tendo um diâmetro de 0,85 um (referem-se a passos de protocolo 6,1-6,3). O nível de fluorescência em estas lacunas é baixa e se aproxima de níveis de fluorescência de fundo (seta preta). (CII) Um perfil de intensidade semelhante 3D de um anel Z no processo de constrição. Concentração FtsZ-GFP é também não uniforme; diâmetro, 0,65 m. Painéis A, B, CI e Cii foram reimpressos de Strauss et al 16. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 imagens Representante 3D-SIM de S. células aureus produzem FtsZ-GFP. Uma vez que estas células são arredondadas (cocos), o anel Z vai havenviar um e várias orientações. As células que mostram uma banda de fluorescência na orientação normal de visualização (isto é, no plano xy), como mostrado em (Ia), são muito semelhantes às de células em forma de bastonete quando girado em torno do eixo Z, como para a Figura 1AI. Em (Aii) o anel Z já está no plano xy; orientação e resolução lateral é máximo ao longo de todo o anel, que já apresenta uma estrutura de cordão de tipo (B). (C) Um gráfico de intensidade 3D ​​da abundância relativa de FtsZ-GFP no anel Z (D). representação esquemática do S . aureus anel Z. As setas vermelhas indicam o comprimento de esferas e dimensões de largura (consulte o protocolo passo 6.1). Este valor foi modificado de Strauss et al 16. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig5highres.jpg" width="500" /> &lt;strong&gt; Figura 5 F3D-SIM permite a análise rápida de FtsZ localização ao longo do tempo em 3D-SIM. (A) Mudanças na distribuição FtsZ-GFP dentro do anel Z em forma de bastonete B. subtilis células pode ser visualizado para indicar a dinâmica do anel. Tempo (seg) é indicado no canto superior esquerdo de cada imagem. (B) parcelas de intensidade de fluorescência em 3D mostrar a não uniforme e a distribuição dinâmica de FtsZ no anel Z. Dinâmica (C) FtsZ (FtsZ-GFP alterações de fluorescência na anel) também pode ser analisada em mais pormenor através da quantificação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo, em duas regiões de interesse. Este número foi reproduzido a partir de Strauss et al 16. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 F3D-SIM imagens de lapso de tempo mostram mudanças na FtsZ localização dentro do anel ao longo do tempo em S. umaUreus. uma seta branca indica um intervalo quando é inicialmente detectado no anel Z. O aparecimento ou desaparecimento de lacunas na mesma posição (como indicado pela seta branca) ao longo do tempo ilustra como FtsZ é redistribuído em torno do anel Z. As setas brancas indicam a formação de lacunas no anel Z em pontos de tempo posteriores. Tempo (seg) é mostrada no lado esquerdo superior das imagens. Este valor foi modificado de Strauss et al 16.

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Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K visualizações.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

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Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Biologia

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...