Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Leverhulme, da Engenharia e Ciências Físicas Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [áruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] e do Conselho de Pesquisa Médica [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Agradecemos E. Avezov e M. Lu por transfecção do LifeAct-GFP e células citosólica-GFP, respectivamente, e W. Chen para a preparação da cultura de células HEK293. Agradecemos também K. O&#39;Holleran para assistência com o design do microscópio, e L. Shao e R. Heintzmann para discussões e sugestões úteis.

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The authors have nothing to disclose.

<html> sistemas Custom-Built TIRF-SIM, tais como a configuração detalhado neste protocolo são capazes de imagem de super-resolução multicolor em alta velocidade em comparação com microscópios comercialmente disponíveis. A vantagem inerente de SIM, como uma técnica de super-resolução é que a resolução temporal não é limitada pelos fotofísica do fluoróforo, em comparação com outros métodos tais como microscopia de molécula única localização (SMLM) ou métodos de verificação de pontos, tais como microscopia de depleção de emissão estimulada ( STED). Ao contrário dessas outras técnicas, SIM não requer fluoróforos foto induzida ou esgotáveis ​​modo imagem multicolor é simples. sistemas TIRF-SIM não, tais como a óptica de seccionamento SIM e multifocal SIM geralmente pode conseguir melhorar a resolução de 1,7 vezes ou menos, na prática, ao contrário do factor de 2 a melhoria aqui relatado, e sistemas comerciais são também muitas vezes mais lenta e menos flexível do que o sistema apresentado neste protocolo. &quot;&gt; As duas principais dificuldades na aplicação desta técnica são, em primeiro lugar a necessidade de posicionamento preciso das seis vigas SIM dentro da zona TIR de abertura costas do objetivo, que requer um tempo trabalhoso e demorado procedimento de alinhamento óptico. Em segundo lugar, para produzir alto contraste padrão na amostra, a rotação de polarização é essencial. para sistemas de baixa nA 2D-SIM, rotação de polarização pode ser evitado pela escolha cuidadosa da orientação de polarização linear, mas isso torna-se impossível para TIRF SIM-25. para imagem multicolor de alta velocidade, eletro- controle de polarização óptica é necessário e isso aumenta a complexidade e o custo do sistema. Limitações da técnica TIRF-SIM, como TIRF convencional, é, naturalmente, limitada a observação de estruturas e processos localizados na membrana celular basal, que pode ser iluminada por a profundidade de penetração de 150-200 nm do campo evanescente biológicos. EnquantoSIM é frequentemente citado como sendo menos photodamaging de células do que qualquer um ou STED SMLM, duplicação resolução lateral ainda faz aumentar o número necessário de fótons por, pelo menos, 4 vezes em comparação com 5 TIRF microscopia convencional. Para geração de imagens em altas taxas de quadros com tempos de exposições curtas, este aumento de fótons exige uso de aumento da intensidade de iluminação. Embora qualquer fluoróforo pode ser usado para geração de imagens de amostras SIM móveis fixos ou lentos, proteínas fluorescentes de alto brilho ou próxima geração de corantes sintéticos com fotoestabilidade melhorada são recomendados para imagens de células vivas. Embora esta aplicação é capaz de imagiologia de uma única cor em taxas de quadros SIM em excesso de 20 Hz, a imagem multicolor no sistema apresentado é limitada pelo tempo de comutação do filtro de emissão de roda motorizada. Devido ao grande tamanho do chip câmara scmos, o uso de um filtro de emissão de banda múltipla e separadoras de imagem óptica seria possível e permitir i simultâneamaging com múltiplos comprimentos de onda, sem qualquer penalidade na velocidade. Outra possibilidade seria a alternância das diferentes lasers de excitação e usar um filtro de entalhe de banda múltipla para rejeitar a luz de excitação. O uso de um SLM ferroeléctrica binário nesta aplicação também não é óptima. A eficiência de difracção de tal SLM é muito baixo, então a maior parte da luz incidente é no reflexo de ordem zero, que é filtrado para fora por a máscara espacial. Para aplicações que exigem muito altas taxas de quadros, a velocidade de imagem é, portanto, limitada pelo poder dos diodos de laser de saída. O SLM também introduz algumas elipticidade na polarização para comprimentos de onda de distância do comprimento de onda de 550 nm projeto onde os pixels não funcionam placas meia onda como ideais. Embora isso poderia ser compensado através da utilização de uma LCVR adicional, a solução ideal pode ser o uso de um dispositivo de micro-espelho digitais (DMD) como um gerador de padrão. possíveis modificações O prese configuraçãonted aqui é flexível e mais facilmente modificado do que os instrumentos comerciais para que outras modalidades de imagem, tais como 3D-SIM, rápida 2D-SIM, SIM multifocal (MSIM) e SIM não-linear (NL-SIM) podem ser implementadas 21,34,35. 2D-SIM pode ser bem adequado para imagiologia relativamente plana, move-se rapidamente estruturas, tais como o retículo endoplasmático periférica. O ER periférica é mais profundo dentro da célula que pode ser iluminado usando um campo evanescente TIRF, mas devido à sua estrutura plana pode ser fotografada usando padrão 2D-SIM com insignificante fundo fora de foco. Além disso, o uso de melhores algoritmos de reconstrução de corte ópticas para suprimir fora-de-foco de luz estender o uso do 2D-SIM para opticamente amostras de espessura, embora onde duplicação resolução axial não é necessária 21. Em MSIM, a amostra é iluminada por uma rede esparsa de excitação focos 36. Esta modalidade pode ser implementado simplesmente removendo a máscara espacial (SM) E substituindo-o por um polarizador. O SLM agora funciona como um modulador de amplitude. As grelhas SIM binários exibidos na SLM pode ser substituído por uma estrutura de pontos em 2D, com o tamanho dos pontos escolhidos para ser igual ao tamanho de um foco de difracção limitada no plano de imagem. Na Figura 7A, uma estrutura de 4 x 4 quadrados do pixel é exibido na SLM (inset) que quando demagnified sobre a amostra gera focos de difracção limitada de 150 x 150 mm, tendo em conta o tamanho do pixel SLM física de 13,62 | im. Os focos de excitação pode ser então traduzida pela mudança do padrão da rede em SLM e isto é repetido várias vezes a fim de iluminar a totalidade do campo de visão. As imagens são adquiridas para cada posição do padrão traduzida e a pilha é pós-processados ​​para produzir uma imagem reconstruída com uma melhor resolução de até um fator de <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> e reduziu fora-de-foco de luz em comparação com a imagem widefield equivalente30. Esta modalidade pode ser útil para imagiologia de amostras grossas, densos para os quais SIM padrão é inadequado, por exemplo, estruturas de baixo contraste, tais como os glóbulos vermelhos corados (Figura 7C), embora o tempo de aquisição é aumentada, devido ao grande número de quadros de matérias- requerido por campo de visão (neste caso n = 168). Finalmente, a configuração pode ser modificada para permitir que seja alta-NA linear TIRF-SIM ou activação modelado não linear SIM (PA NL-SIM), tal como apresentado recentemente por Li et al., Através da utilização de uma 1,7 objectivo ou a adição de ultra NA de um laser de 405 nm fotoativação e otimização cuidadosa dos SLM padrões ralar 35. Aplicações futuras SIM ainda é uma técnica rápida evolução e muitas aplicações nas ciências da vida será habilitado no futuro. A velocidade, resolução e melhorias de contraste da técnica e a capacidade de utilizar padrão fluorï¿½oros mean que, para bioimaging, SIM está definido para substituir muitos sistemas de microscopia convencional, tais como plataformas de campo confocal e largas. sistemas SIM comerciais já estão disponíveis hoje, com especificações técnicas pendentes, no entanto, eles estão além do alcance financeiro de muitos laboratórios de pesquisa, e, crucialmente, eles são inflexíveis de ser modificado e desenvolvido para implementar as mais recentes desenvolvimentos da investigação no campo. Eles também não têm a capacidade essencial para &#39;ser adaptado para o experimento na mão&#39;, muitas vezes um gargalo crítico na corte pesquisa de ciências biológicas borda. O sistema descrito aqui será particularmente adequado para estudar processos dinâmicos perto da superfície da célula, para estudos in vitro de sistemas bicamada reconstituídos, para estudar a química de superfície nos materiais e ciências físicas, por exemplo. de materiais 2D, e muitas outras aplicações.

Ao longo da última meia década, a microscopia de super-resolução amadureceu e mudou-se de laboratórios ópticos especializados para as mãos do biólogo. Existem soluções microscópio comerciais para os três principais variantes para alcançar óptico super-resolução: microscopia molécula localização única (SMLM), estimulado microscopia de esgotamento de emissão (STED), e microscopia de iluminação estruturada (SIM) 1,2. SMLM tais como microscopia fotoativados localização (PALM) e microscopia óptica reconstrução estocástico (STORM) têm sido as técnicas mais populares, em grande parte devido à simplicidade da configuração óptica e a promessa de alta resolução espacial, prontamente abaixo de 20 nm. No entanto microscopia de super-resolução via única molécula de localização vem com uma intrínseca trade-off: o atingível resolução espacial é dependente de acumular um número suficiente de localizações fluoróforo individuais, limitando assim a resolução temporal. processo dinâmico de imagemES em células vivas, por conseguinte, torna-se problemático como uma amostra deve adequadamente o movimento da estrutura de interesse para evitar artefactos de movimento ao mesmo tempo que a aquisição de acontecimentos de localização suficientes em que o tempo para reconstruir uma imagem. A fim de atender a esses requisitos, demonstrações ao vivo SMLM celular têm obtido o necessário aumento das taxas de fluoróforo photoswitching, aumentando muito o poder de excitação, e isso leva por sua vez a fototoxicidade e estresse oxidativo, limitando assim o tempo de sobrevivência de amostra e relevância biológica 3. A clara vantagem de STED sobre ambos SIM e SMLM é que ele pode imagem com super-resolução em amostras de espessura, por exemplo resolução lateral de cerca de 60 nm foi conseguida em fatias de cérebro organotípicas em profundidades de até 120 mm 4. Imagiologia em tais profundidades com implementações objetivos únicos de SMLM ou SIM é inviável, mas torna-se possível com qualquer folha de luz única molécula ou estrutura folha de luz microscopy 5. -Taxa de Vídeo STED também tem sido demonstradas e utilizadas para mapear a mobilidade das vesículas sinápticas, embora até agora este tem sido limitada a imagiologia de pequenos campos de visão 6. Para aplicações em biologia celular e reacções auto-montagem moleculares 7 - 12 que exigem imagens com alta resolução temporal ao longo de muitos pontos de tempo, microscopia de iluminação estruturada (SIM) pode ser bem adequada, uma vez que não é dependente das propriedades fotofísicas de um marcador fluorescente particular, sondar. Apesar dessa vantagem inerente do SIM, até agora a sua utilização tem sido principalmente confinada à imagem latente células fixas ou processos lentos. Isto é devido às limitações dos sistemas de SIM comercialmente disponíveis: a taxa de quadros aquisição destes instrumentos foi limitada pela velocidade de rotação das grades utilizadas para gerar os padrões de iluminação sinusoidais necessários, bem como a manutenção da polarização óptica. A mais nova geração de SIM comercialinstrumentos são capazes de imagem rápido, mas eles são proibitivamente caro para todos, mas as instalações de imagiologia centrais. Este protocolo apresenta um guia para a construção de um sistema flexível SIM para imagiologia de processos rápidos em amostras finas e perto da superfície basal de células vivas. Emprega total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) para gerar um padrão de iluminação que penetra no mais profundo do que cerca de 150 nm na amostra 13, que reduz drasticamente o fora de sinal de fundo do foco. A idéia de combinar SIM com TIRF é quase tão antiga como SIM-se 14, mas não foi realizado experimentalmente antes de 2006 15. A primeira in vivo imagens obtidas com TIRF-SIM foram relatados em 2009 16 atingindo taxas de quadro de 11 Hz para visualizar tubulina e kinesin dinâmica, e dois sistemas TIRF-SIM cores foram apresentados 17,18. Mais recentemente, uma guia para a construção e utilização de uma única cor de dois feixes s SIMistema foi apresentado com frame-rate de até 18 Hz 19,20. O set-up aqui apresentado é capaz de imagem de super-resolução SIM a 20 Hz em três cores, dois dos quais podem ser operados em TIRF-SIM. Todo o sistema é construído em torno de um corpo do microscópio invertido e usa uma fase de tradução XY motorizada com um palco z-atuado piezo. Para gerar os padrões de excitação sinusoidal necessários para TIRF-SIM, o sistema apresentado utiliza um modulador de luz espacial ferroeléctrica (SLM). padrões binários de grelha são mostradas na SLM e as ordens de difracção de ± 1 resultantes são filtrados, e retransmitida focado no anel TIR da lente objectiva. Os deslocamentos e as rotações dos gradeamentos de fase necessários são aplicadas mudando a imagem exibida SLM. Este protocolo descreve como construir e alinhar um tal caminho de excitação, detalha o alinhamento do caminho de emissão, e apresenta amostras de ensaio para garantir um alinhamento óptimo. É também des<html> os secretários questões e desafios específicos para alta velocidade TIRF-SIM em matéria de controlo de polarização e sincronização de componentes. Considerações de design e Restrições Antes de montar o sistema TIRF-SIM apresentados neste protocolo, existem várias restrições de design a considerar que determinam a escolha de componentes ópticos. Todas as abreviaturas de componentes ópticos referem à Figura 1. Spatial Luz modulador (SLM) A ferroelétrico SLM binário é utilizado nesta configuração, uma vez que é capaz de comutação padrão de sub-milissegundo. SLMs nemáticos em tons de cinza podem ser usados, mas estes oferecem bastante reduzido os tempos de comutação. Cada ligado ou desligado do pixel binário numa fase SLM vai conferir deslocamento para a frente de onda plana incidente, quer uma fase π ou 0, por conseguinte, se um padrão de grelha periódica é exibido na SLM ele irá operar como uma grade de difracção de fase. ent &quot;&gt; reflexão interna total (TIR) Para atingir TIR e produzir um campo evanescente, o ângulo de incidência dos feixes de excitação na interface vidro-amostra deve ser maior do que o ângulo crítico <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Isso define o ângulo mínimo incidente necessário, e, portanto, também o espaçamento máximo, ou período, do padrão de iluminação evanescente. O ângulo máximo de incidente <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (O ângulo de aceitação) é limitado pela abertura numérica (NA) da lente objectiva, que pode ser calculada a partir da definição <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Isto determina o padrão de espaçamento mínimo realizável de acordo com a fórmula Abbe <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> que liga NA e comprimento de onda <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> para o padrão de espaçamento mínimo <imgalt = &quot;Equação&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. Na prática, uma imersão em óleo 1,49 NA TIRF objectivo produz um ângulo de incidência máximo de cerca de 79 ° e um período mínimo de padrão na amostra de 164 nm, utilizando um comprimento de onda de excitação de 488 nm. Estes dois ângulos definem um anel em volta da abertura da objectiva sobre os quais o instrumento atinge TIR iluminação (ou seja. O anel TIR), e em que os focos duas excitação deve ser posicionado com precisão e precisamente rodado para gerar cada padrão de iluminação. Reconstrução de imagens TIRF-SIM exige a aquisição de um mínimo de três deslocamentos de fase por rotação padrão, portanto, o período padrão de SLM deve ser divisível por 3 (ver Figura 1). Por exemplo, um período de 9 pixels para iluminação 488 nm e 12 pixels para 640 nm iluminação. Para uma discussão abrangente de design padrão SLM, incluindo otimização de sub-pixel de padrão de espaçamento usando grades de cisalhamento, Ver o trabalho anterior de Kner et al. 16 e Lu-Walther et al. 20 A posição dos dois focos de excitação deve estar dentro do anel TIR para todos os comprimentos de onda, no entanto, o ângulo de difracção dos ± 1 ordens da SLM é de comprimento de onda dependente. Para SIM padrão, imagem multicolor pode ser obtida através da optimização do período de reticulação para o comprimento de onda mais longo, e tolerar uma perda de desempenho para os canais mais curtos. Para TIRF-SIM no entanto, optimizando para um comprimento de onda significa que o outro comprimento de onda deixa de focos dentro do anel são TIR. Por exemplo, utilizando um período de reticulação de 9 pixels é suficiente para proporcionar TIRF para 488 nm, como os focos são a 95% do diâmetro da abertura para trás e para dentro do anel TIR, mas para 640 nm, este período seria posicionar o focos fora a abertura. Por esta razão diferentes espaçamentos padrão de pixel deve ser utilizado para cada comprimento de onda de excitação. O alinhamento do caminho de excitação TIRF-SIMé extremamente sensível a pequenas mudanças na posição do espelho dicróico (DM4 na Figura 1) no corpo do microscópio, muito mais assim do que no SIM convencional. Utilização de uma torreta rotativa cubo de filtro não é recomendado, em vez disso usar um único, espelho dicróico multi-banda, que é mantido numa posição fixa e concebidos especificamente para os comprimentos de onda de excitação utilizados. É essencial que apenas a maior qualidade espelhos dicróicos são utilizados. Estes exigem substratos grossos de pelo menos 3 mm, e são muitas vezes designado como &quot;plano de imagem&quot; pelos fabricantes. Todos os outros substratos levar a aberração intolerável e degradação da imagem em TIRF-SIM. Controle de polarização Para alcançar TIRF-SIM é essencial rodar o estado de polarização da luz de excitação, em sincronia com o padrão de iluminação de modo a que ele permanece azimutais polarizada no plano da pupila objectivo em relação ao eixo óptico (isto é,. s-polarizada). O alinhamento das ópticas de controlo de polarização dependerá do elemento óptico específico empregue, por exemplo uma célula de Pockels 21, ou uma placa de meia onda em uma etapa de rotação motorizada 22. Neste protocolo um retardador variável de cristal líquido personalizado (LCVR) é usado, projetado para fornecer de onda completa (2π) retardance sobre a faixa de comprimento de onda 488-640 nm, uma vez que permite a comutação rápida (~ ms). Se usar um retardador de cristal líquido é essencial a utilização de um componente de alta qualidade: componentes padrão geralmente não são suficientemente estáveis ​​para dar um retardamento constante ao longo da duração do tempo de exposição da câmara que leva a uma desfocagem para fora do padrão de iluminação e de baixo contraste de modulação . retardadores de cristal líquido são também fortemente dependente da temperatura e exigem construído no controle de temperatura. sincronização Os lasers deve ser sincronizado com o SLM. SLMs ferroelétricos binários são equilibrados internamente por switching entre um estado ligado e desligado do estado. Os pixels só agem placas como meio de onda em qualquer seu estado ligado ou desligado, mas não durante o tempo entre quadros de comutação. Portanto, os lasers só deve ser ligado durante estados on / off através do LED Activar sinal do SLM para evitar uma redução em contraste padrão devido ao estado intermediário dos pixels. Um modulador acústico-óptico (OMA) pode, alternativamente, ser utilizado como um obturador rápido, se os lasers não podem ser modulados digitalmente. Escolha de lentes Com base nestes constrangimentos, o demagnification necessária do plano SLM sobre o plano da amostra para produzir os padrões de iluminação pretendida pode ser determinada. Isto permite o cálculo das distâncias focais de duas lentes L3 e L4 no telescópio relé imagem e a lente de excitação condensador L5. Neste sistema um / imersão em óleo 1.49NA lente objectiva 100X é usado com 488 nm de excitação e 640 nm, consequentemente, utiliza comprimentos focais de 300 e 140 milímetrospara L4, L3, e 300 mm de L5, dando um total de demagnification 357X, equivalente a um tamanho de pixel de 38 nm SLM no plano da amostra. Usando esta combinação de lentes, SLM ralar para 9 períodos de iluminação 488 nm e 12 pixels para dar 640 nm padrão de espaçamentos 172 e 229 nm para a amostra, que corresponde a ângulos de incidência de 70 ° e 67 ° respectivamente. Para uma interface de água de vidro, o ângulo crítico é de 61 °, e é independente do comprimento de onda, por conseguinte, estes dois espaçamentos padrão permitir excitação TIRF para ambos os comprimentos de onda. Uma lente objectiva equipado com um colar de correcção é útil para a correcção das aberrações esféricas introduzidos por variações na espessura da lamela, ou se a operar a 37 ° C. Reconstrução imagem Uma vez que os dados em bruto SIM tenha sido adquirido, é uma questão de esforço computacional para gerar imagens de super-resolvido em um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, o padrão de iluminação tem de ser determinado paracada imagem e em segundo lugar, os componentes do espectro SIM deve ser separada e recombinadas de forma adequada como para dobrar o suporte OTF eficaz (ver Figura 6, inserções). O conhecimento preciso dos padrões de iluminação projectados é primordial, como os componentes de frequência super-resolvido tem que ser não misturados com a maior precisão possível para evitar artefactos causados ​​por as partes residuais de componentes sobrepostos. Nós determinamos o padrão de iluminação parâmetros a posteriori a partir dos dados de imagem em bruto seguindo o procedimento introduzido por Gustafsson et al. 23 Em suma, um conjunto de parâmetros de iluminação que descreve uma senóide bidimensional normalizada tem de ser encontrado para cada um dos <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> padrões de excitação <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> por este meio <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> e <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> descrever o contraste da franja e do padrão na fase inicial de cada imagem individual m respectivamente. Os componentes do vector de onda, <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> e <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Só mudam com orientações diferentes <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> do padrão e pode ser assumida em contrário constante. Para determinar grosseiramente as componentes do vector de onda uma correlação cruzada dos espectros de imagem em bruto é realizada, o que é refinada através da aplicação de deslocamentos subpixel a uma das imagens interligado a optimizar a sobreposição. Isto é feito através de multiplicação de espaço-Real gradientes de fase <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> que induzem uma mudança subpixel na frefre--espaço. Note-se que é útil ter uma boa estimativa da onda-vectores antes da estimativa real padrão e esta pode ser encontrada por imagiologia de uma camada de cordão fluorescente. Como o passo de fase entre os padrões é deslocado <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , Ou seja. <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> , A separação de componentes de frequência pode ser realizada por uma transformada de Fourier ao longo do eixo &quot;fase&quot;. A fase mundial <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> e o contraste franja <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> pode então ser determinada usando regressão linear complexa de diferentes componentes. Os componentes individuais separadas são então combinadas através de um filtro de Wiener generalizado. Para uma descrição detalhada de ambos extração de parâmetros e implementação do filtro de Wiener generalizado nos referimos o leitor a Gustafssonet al. 23, onde o mesmo algoritmo é utilizado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1149">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Toptica</td>
			<td style="width:181px;">iBeam SMART</td>
			<td style="width:535px;">with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Coherent</td>
			<td style="width:181px;">OBIS LS</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">640 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Cobolt</td>
			<td style="width:181px;">MLD</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Long-pass dichroic mirrors&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td>for combining excitation beams</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:143px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;">58-860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor calcite polarizers</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GT5-A</td>
			<td>For alignment of LCVR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM05PM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic half wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AHWP05M-600</td>
			<td>400 - 800 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>For HWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Liquid Crystal Variable Retarder</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">SWIFT</td>
			<td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">LCVR controller</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">D3060HV</td>
			<td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic quarter wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">AQM-100-0545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1P/M</td>
			<td>For QWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">10 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC080-010-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">200 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Cage XY Translators</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Ferroelectric spatial light modulator</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-00249&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">SLM mounting frame</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-10014</td>
			<td>Fixed to custom built aluminium mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">&#216;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GM200/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">XYR1/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rail carrier</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">M-PRC-3</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision Optical Rail</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">PRL-6</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 273 322&#160;</td>
			<td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">140 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 239 322</td>
			<td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision XY Translation Mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">LM2XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Lens Mounting Adapters</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM2AD32</td>
			<td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&#34; mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Translation stages</td>
			<td style="width:143px;">Comar</td>
			<td style="width:181px;">12XT65</td>
			<td>Dovetail, side drive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">XY Translator with Differential Drives</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">ST1XY-D/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC508-300-A-ML</td>
			<td>Excitation tube lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Automated XY stage with Z-piezo top plate</td>
			<td style="width:143px;">ASI</td>
			<td style="width:181px;">PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&#160;</td>
			<td>with MS-2000 controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Inverted microscope frame</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Objective lens</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">UAPON100XOTIRF</td>
			<td>100X/1.49NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">High speed filter wheel</td>
			<td style="width:143px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:181px;">HF110A</td>
			<td>with Prior ProScan III controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bandpass emission filters</td>
			<td style="width:143px;">Semrock</td>
			<td style="width:181px;">FF01-525/30, FF01-676/29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:143px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:181px;">ORCA Flash v4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stage top incubator</td>
			<td style="width:143px;">OKO Lab</td>
			<td style="width:181px;">H301-K-FRAME</td>
			<td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stainless steel optical posts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">TR series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Post holders</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">PH series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Kinematic mirror mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">KM100</td>
			<td>for mounting 1&#34; mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">100 nm fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">T-7279</td>
			<td>Tetraspeck</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">83697-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">8 well glass bottom dishes</td>
			<td style="width:143px;">ibidi</td>
			<td style="width:181px;">80827</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">155409</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">0.01mm microscope reticle slide</td>
			<td style="width:143px;">EMS</td>
			<td style="width:181px;">68039-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C10613</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

imaging super-resolução óptica com microscopia de iluminação estruturada (SIM) é uma tecnologia-chave para a visualização de processos a nível molecular na ciências biomédicas e químicas. Embora os sistemas SIM comerciais estão disponíveis, os sistemas que são projetados em laboratório pode superar sistemas comerciais, este último normalmente concebidos para facilidade de uso e aplicações de uso geral, tanto em termos de fidelidade de imagem e velocidade. Este artigo apresenta um guia detalhado para a construção de um sistema SIM que utiliza iluminação reflexão interna total (TIR) ​​e é capaz de imagem em até 10 Hz em três cores em uma resolução chegando a 100 nm. Devido à combinação de SIM e TIRF, o sistema proporciona um melhor contraste de imagem do que as tecnologias rivais. Para atingir estas especificações, vários elementos ópticos são utilizados para permitir controle automatizado sobre a estrutura de estado de polarização e espacial da luz de iluminação para todos wav excitação disponíveiselengths. Detalhes completos sobre a implementação de hardware e controle são dadas para conseguir a sincronização entre a geração de luz de excitação teste padrão, comprimento de onda, estado de polarização, e controle da câmera com ênfase na obtenção de taxa de quadros máxima de aquisição. Um protocolo passo-a-passo para o alinhamento e a calibração do sistema é apresentado e a melhoria resolução alcançável é validado em amostras de teste ideal. A capacidade de imagiologia super-resolução de taxa de vídeo é demonstrada com células vivas.

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A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

a-guide-to-structured-illumination-tirf-microscopy-at-high-speed-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K visualizações.  University of Cambridge. This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Bioengenharia

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-chip microscopia tomográfica Empregando Multi-ângulo de iluminação e Pixel Super-resolução

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocidade Spectrometer Sub-GHz para Brillouin Scattering Análise

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...