Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Inocular meio LB com uma única colónia da estirpe JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescer durante a noite num agitador a 37 ° C. </li><li> Dilui-se a cultura de 1:1000 em meio mínimo M9 + [sais M9, 0,4% de glucose, 2 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl 2, ácidos aminados e vitaminas MEM] e crescer a mid-log de ​​fase (OD 600 = 0,2-0,3) na presença de cloranfenicol (150 ug / ml) à temperatura ambiente (RT). </li><li> Induzir a cultura com 20 mM de IPTG durante 2 horas (ver Nota 1). </li><li> Pellet cultura em microcentrífuga (8000 rpm, 1 min) e ressuspender em um volume igual de M9 +; repetição. Após a re-suspensão em segundo lugar, o crescimento prosseguir à temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> Fix cultura induzida com paraformaldeído a 4% em PBS (pH = 7,4) à temperatura ambiente durante 40 min. Pellet cultura e ressuspender em um volume igual de PBS; repetição. Se as células de imagem ao vivo, pular de fixação, a cultura da pelota, e ressuspender com volume igualde M9 - [sais M9, 0,4% de glucose, 2 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl 2, ácidos aminados MEM]; reincidentes. </li><li> Diluir 1:10 com contas de ouro cultura ressuspenso. Aplicar a amostra para a câmara de imagem preparado (ver passo 2.4). </li></ol> [1] Nota: O protocolo de indução acima (passos 1,1-1,3) foi optimizada para o sistema de expressão da estirpe JB281. Condições de indução de execução podem variar para outros sistemas de expressão ou de proteínas de interesse. 2. Assembleia da Câmara de imagem <ol><li> Fazer a 3% (w / v) de solução de agarose em M9 -. Melt agarose a 70 ° C num bloco de aquecimento de bancada durante 40 min. Loja agarose fundida a 50 ° C durante até 5 horas. </li><li> Coloque um slide microaqueduct limpo na metade superior da câmara de imagem com os eléctrodos virados para baixo. Alinhar a junta inferior do slide microaqueduct de modo a cobrir os canais de perfusão. </li><li> Aplicar ul ~ 50 da agarose fundida para o centro do vidroslide. Imediatamente superior a gota de gel de agarose com uma lamela limpa e seca. Permitir que o gel solidifique à temperatura ambiente durante 30 min. <ol><li> Para limpar lamelas: providenciar lamelas em um suporte cerâmico e sonicar durante 20 min em rotação banhos de acetona, etanol e KOH 1M em frascos de vidro. Repetir ciclo de três vezes, para um total de 9 sonicações, seguido por uma única sonicação em dH 2 O. Armazenar as lamelas limpas em fresco dH 2 O. Antes de usar, soprar lamelas secas com ar filtrado. </li></ol></li><li> Cuidadosamente remover a lamela, deixando almofada de gel no slide microaqueduct. Imediatamente adicionar 1 ml de amostra de cultura de células (ver passo 1.6) para a parte superior da almofada de gel. Espere por ~ 2 min, o que permite uma solução para ser absorvida pela almofada de gel. Almofada de gel superior com uma nova lamela, limpo e seco. Montar a câmara de imagiologia todo de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 3. Aquisição de Imagem <ol><li> Ligue o microscópio, câmera e lasers. Abra MetaMorph suaveWare (Molecular Devices). </li><li> Coloque apropriadas de excitação / emissão de filtros no caminho de imagem (Figura 1). </li><li> Definir poderes laser e configurações de aquisição em conformidade. <ol><li> 488-nm = 15 mW de laser (ver Nota # 2) </li><li> 561-nm do laser = 75 mW </li><li> 405-nm do laser = 2 mW ± filtro de densidade neutra (Nota n º 3) </li></ol></li><li> Bloquear câmara de imagens na fase através do adaptador etapa complementar. </li><li> Designa uma região de imagem apropriado (100x100 pixels), que é homogeneamente iluminado por todas as três lasers. </li><li> Identificar uma área de amostra que contém ambas as células e marcadores fiduciais (esferas de ouro) em estreita proximidade, mas não se sobrepõem. </li><li> Concentre-se na superfície de células mais próximas da lamela. Adquirir uma imagem de campo claro com 50 ms de tempo de integração e mover o foco 0,5 m na amostra (Figura 3Ai). </li><li> Adquirir imagem conjunto verde fluorescência com excitação a partir do 488-n<html> m laser utilizando um tempo de integração 50 ms (Figura 3Aii). </li><li> Adquirir streaming de vídeo no canal vermelho com iluminação contínua de 405 nm e 561 nm lasers. Para as células fixas, uma 50 taxa de quadros ms é utilizado para um total de 20.000 frames (total de ~ 17 min), com a potência do laser 405 nm, em rampa de ~ 10% por cada 1000 quadros (ver nota 4). Para as células vivas, a taxa de quadros 10 ms é usado para um total de 3.000 quadros (~ 30 s total) com uma potência de laser de 405 nm, constante. </li><li> Mover o foco de volta para a superfície inferior das células e adquirir outra imagem de campo claro como no passo 3.7. </li></ol> [2] Nota: A intensidade integrada da fluorescência verde de uma célula é directamente proporcional ao número total de FtsZ-mEos2 moléculas expressas na célula. A potência de excitação de 488 nm e configurações de conjuntos de fluorescência de aquisição deve ser mantido constante para todas as células de modo que a relação FtsZ-mEos2 níveis de expressão em diferentes células pode ser comparado. ONTEÚDO &quot;&gt; [3] Nota:. células fixas são gravadas com a densidade neutra (ND) filtro (Figura 1, o componente óptico # 5) no local, a fim de atingir uma taxa de activação lenta, de modo que cada molécula individual pode ser identificado com precisão A ND filtro é removido quando as células de imagens ao vivo para aumentar a taxa de activação, enquanto se mantém baixa a probabilidade de duas moléculas de ser activadas em simultâneo numa zona de difracção limitada. A taxa mais rápida aplicada ao vivo de células de imagem é necessária para diminuir o tempo de aquisição total, assim &quot;congelar&quot; o anel Z-in-time e limitar o efeito do fotodano para a célula. [4] Nota: Os números de quadros adquiridos foram optimizados para o nosso sistema e são dependentes da estrutura celular particular, a rotulagem, densidade e taxa de activação se esgotar a totalidade do conjunto das fluoróforos é importante para a análise. Em células vivas, é importante para se obter um número suficiente de localizações no mais curto período de um time quanto possível para evitar a desfocagem da imagem devido ao movimento da estrutura celular. 4. PALM Construção da Imagem <ol><li> Determinar a posição do centro de gravidade de cada mancha detectada. <ol><li> Carregue a pilha de imagem em Matlab (MathWorks, Inc). </li><li> Corte a pilha de imagens de uma região em torno de uma célula que exclui todas as contas fiduciais. </li><li> Seleccionar um limiar de intensidade para a detecção de ponto que está acima do nível de fundo, mas abaixo do ponto de intensidade média. Nós contabilizar a variação no nível de fundo ao longo de uma experiência através do cálculo da média de funcionamento de intensidade máxima usando uma janela de quadro 150. O limiar de intensidade para cada quadro é então interpolada a partir dos valores médios de execução. </li><li> Subtrair o limiar correspondente a partir de cada quadro. Pontos potenciais são identificados como três pixels adjacentes com intensidades acima do limiar. </li><li> Ajustar a intensidade de fluorescência de cada mancha para um potencial Gaussia bidimensionalfunção n [Equação # 1], utilizando um algoritmo não linear, pelo menos um quadrado (Figura 2). A precisão a localização de cada ponto é calculado o número total de fotões detectados [Equação # 2]. Qualquer mancha mal-fit com uma precisão de localização superior a 20 nm (células fixas) ou 45 nm (células vivas) é descartado (ver nota 5). Qualquer lugar com uma intensidade maior do que duas vezes maior de intensidade média, possivelmente devido à sobreposição de emissores, também é descartada. </li><li> Para as células fixas, retire observações repetidas da mesma molécula, desconsiderando qualquer local cujo centróide posição é no prazo de 45 nm de qualquer outro lugar que o precedeu por 6 quadros ou menos. Para as células vivas, todos os pontos são retidos. </li></ol></li><li> Calibrar deriva amostra usando movimento marcador fiducial. <ol><li> Colheita fora de uma região de pixel 10x10 em torno de um marcador fiducial. </li><li> Subtrair o limiar respectivo determinado em 4.1.3 a partir de cada quadro. </li><li> Encaixe o perfil de intensidade em cadaarmação através de mínimos quadrados algoritmo apropriado assumindo uma forma Gaussiana bidimensional. </li><li> Calcule o deslocamento entre as posições centróide em relação ao quadro 1. </li></ol></li><li> Corrigir a posição do centróide de cada molécula única identificada em 4.1 com a deriva amostra adequada calculado em 4,2. Comparar as imagens de campo claro adquiridos em 3.7 e 3.10. Se as células são observadas a mover-se relativamente aos marcadores fiduciais, os dados são lançados para fora. </li><li> Sobrepor todas as posições corrigidas centróide em uma única imagem composta de pixels 15x15 nm. Traçar cada molécula única, como uma unidade de área, perfil gaussiano bidimensional centrada na posição centróide com um desvio padrão igual a precisão de localização [Equação # 2]. Isso resulta em um mapa de densidade de probabilidade, em que a intensidade de um pixel é proporcional à probabilidade de encontrar uma molécula em que o pixel (Figura 3Aiv). </li><li> Comparando imagens de palma para imagens do conjunto. <ol><li> Replot o centroposições id como em 4.4, mas em um avião com 150x150 pixels nm e um desvio padrão igual a 250 nm. Isto gera uma imagem PALM que imita uma imagem de difracção limitada, que pode ser usado para comparar com a imagem de conjunto de difracção limitada, adquirida em 3,8 (Figura 3Aiii). </li><li> Para confirmar que as moléculas detectadas são representativos de toda a população, comparar a imagem reconstruída conjunto (Figura 3Aiii, passo 4.5.1) com o conjunto experimental imagem de fluorescência (Figura 3Aii, passo 3.8) para confirmar que as duas imagens mostram estruturas de forma semelhante , orientação e intensidade relativa. </li></ol></li></ol> [5] Nota: A precisão de localização mínimo requerido foi determinado empiricamente para cada método de imagem, marcando as precisões de todas as moléculas de uma dada amostra e seleccionando um corte apropriado. 5. PALM Análise de Imagem <ol><li> Medindo Z-Ring Width e diâmetro. <ol><li> Rodar a imagem, de modo a PALM verticalmente orientar o eixo do comprimento da célula (Figura 4A). </li><li> Recorte da região celular contendo o Z-ring. </li><li> Calcular a intensidade cumulativo, projetando um perfil de intensidade ao longo do eixo longo da célula. </li><li> Encaixe o perfil de intensidade a uma distribuição de Gauss. A largura do anel é definido como o máximo de largura total a metade (FWHM) da distribuição de Gauss ajustada (Figura 4B). </li><li> Projetar o perfil de intensidade acumulada de 5.1.2 ao longo do eixo curto da célula. O diâmetro do anel é definido como o comprimento do perfil de intensidade (Figura 4C). </li></ol></li><li> Plotagem Densidade FtsZ (ver Nota 6). <ol><li> Replot as posições centróide como em (4.4), mas sem o perfil gaussiano de tal modo que cada molécula original é dado um valor de 1 e atribuído a um único pixel correspondente à sua posição centróide. Deste modo, a intensidade de cadapixel representa o número total de moléculas detectadas naquele pixel. A imagem PALM densidade também pode ser visualizado como um gráfico de contorno (Figura 5E). </li></ol></li><li> Determinar a resolução espacial. <ol><li> Teoricamente possível resolução espacial: criar um PSF representante para toda a amostra usando a precisão de localização média determinada de todas as moléculas detectadas e calcular o FWHM (Equação 3). </li><li> Experimentalmente obtida resolução espacial: calcular a média de deslocamento entre as observações repetidas da mesma molécula. </li></ol></li></ol> [6] Nota: Utilizou PALM de reflexão interna total (TIR-PALM, Figura 1 e 5) para restringir a activação e estimulação de uma camada fina (~ 200 nm) acima da interface celular / vidro. de modo que as moléculas apenas FtsZ associados com a membrana mais próximo da lamela irá ser detectado.

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	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. 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W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Imagens PALM contêm informações sobre as contagens de moléculas e posições dentro de uma célula, permitindo uma análise detalhada da distribuição e arranjo de moléculas de proteína alvo que é difícil de conseguir por outros meios. Abaixo destacamos as precauções que devem ser tomadas para extrair informações quantitativas precisas, mantendo a relevância biológica de imagens de palma. Nós também explorar a informação que pode ser melhor obtidos utilizando células vivas vs fixo. Por fim, sugerimos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 50 x MEM Aminoácidos </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitaminas </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102 RF- </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído 16% </td><td> Electron Micrsocopy Ciências </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> Agarose SeaPlaque GTG </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm de ouro Contas </td><td> Microesferas-Nanoesferas </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imagem Câmara </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adaptador de estágio </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, Objetivo 60x </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ixon Câmara EMCCD </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm laser de safira </td><td> Coerente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Safira Laser </td><td> Coerente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405 nm Laser CUBE </td><td> Coerente </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

A divisão celular bacteriana requer a montagem coordenada de mais de dez proteínas essenciais para midcell 1,2. Central neste processo é a formação de um anel supraestrutura-like (Z-ring) pela proteína FtsZ no plano de divisão 3,4. O anel Z é constituída por múltiplas protofilamentos single-stranded FtsZ, e compreendendo o arranjo dos protofilamentos dentro do Z-ring irão fornecer indicações acerca do mecanismo de Z-anel de montagem e a sua função como um gerador de força de 5,6. Esta informação permaneceu uma incógnita devido a limitações atuais em microscopia de fluorescência convencional e microscopia eletrônica. A microscopia de fluorescência convencional não é capaz de fornecer uma imagem de alta resolução do Z-ring devido ao limite de difracção de luz (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagem detectou espalhados protofilamentos FtsZ em C. pequena células crescentus 7, mas é difícil de aplicar a células maiores, tais comoE. coli ou B. subtilis. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de fluorescência de super-resolução, microscopia fotoativados localização (PALM), para caracterizar quantitativamente a organização estrutural do E. coli Z-ring 8. PALM oferece imagens de alta resolução espacial (~ 35 nm) e rotulagem específica para permitir a identificação inequívoca de proteínas-alvo. Nós FtsZ rotulados com a proteína mEos2 fotoactivável fluorescente, a qual muda de verde de fluorescência (excitação = 488 nm) para vermelho de fluorescência (excitação = 561 nm) após a activação a 405 nm 9. Durante uma experiência de palma, individuais FtsZ-mEos2 moléculas são estocasticamente activado e as posições correspondentes do centróide das moléculas individuais são determinadas com &lt;precisão nm 20. Uma imagem de super-resolução do anel Z é então reconstruído por sobrepondo as posições de todos os centróide detectados FtsZ-mEos2 moléculas. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Usando este método, verificou-se que o Z-ring tem uma largura fixa de ~ 100 nm e é composto por um feixe de protofilamentos FtsZ solto que se sobrepõem uns aos outros, em três dimensões. Estes dados fornecem um trampolim para outras investigações das alterações do ciclo celular dependentes da 10 Z-anel e pode ser aplicado a outras proteínas de interesse.

Ilustrado na Figura 3Aiv é um bi-dimensional, render super-resolução do anel Z-gerado a partir do método de imagem PALM descrito acima. Abaixo, resumem-se informação qualitativa e quantitativa que pode ser obtido a partir deles. Qualitativamente, observamos que o Z-anel é uma estrutura irregular que adota várias configurações (única banda ou arco helicoidal) que não são distinguíveis em imagens convencionais de fluorescência (Figura 3A comparar-Dii</st...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  The Johns Hopkins University School of Medicine. Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

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Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography de células bacterianas

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologia

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.