This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

Base de uma única célula não-colônia tipo monocamada (NCM) cultura de hPSCs. 1. Preparações <ol><li> Adicione 500 ml de meio de cultura de fibroblastos de rato embrionários (MEFs): meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,1 e aminoácidos não essenciais (NEAA) mM. </li><li> Isolar fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) derivadas a partir da estirpe CF1, seguindo um protocolo de rotina 16 e MEFs cultura em 0,1% de 6 cavidades da placa de cultura de células revestidas com gelatina, em meio DMEM. Como alternativa, comprar ações do MEF na passagem 3 a partir de recursos comerciais. </li><li> Prepare placas Matrigel. <ol><li> Dilui-se 5 ml de estoque de Matrigel hESC qualificado com 5 ml de meio DMEM/F12 (arrefecida a ~ 4 ° C) e armazenar até 50% em alíquotas de um congelador de -20 ° C. Descongelar o estoque de Matrigel congelado no frigorífico (~ 4 ° C) O / N e dilui-se ainda mais o Matrigel em meio DMEM/F12 fria (para dar origem a uma concentração de trabalho de 2,5%). </li><li&gt; O revestimento 6 placas de cultura de células com 1,5 ml de 2,5% de Matrigel por poço, armazenar as placas revestidas em frigorífico S / N (Nota: utilizar a placa de Matrigel-revestido dentro de 2 semanas). </li><li> Remova a placa de Matrigel da geladeira, deixe a placa para aquecer à temperatura ambiente na capa de cultura de células de 10 a 30 min (Nota: não aquecer a placa em uma incubadora de cultura de células) e aspirado DMEM meio antes de chapeamento hPSCs. </li></ol></li><li> Adicione 500 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas: 80% de meio de DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 0,1 mM β-mercaptoetanol, e 4 ng / ml de FGF-2. </li><li> Preparar 10 ml de meio de congelação 2x HPSC: 60% de FBS, 20% de DMSO, e 20 uM Y-27632 em meio mTeSR1, esterilizar por filtração, e de usar o meio dentro de 1 semana. </li></ol> 2. Protocolo 1 (Básico): Crescer HPSC colônias em Alimentadores <ol><li> Use números de passagem MEF a 5 ou 6 (designado como p5 e p6) para cultura HPSC, a fim de obter resul consistentets. Mitoticamente inactivar MEFs por tratamento das células com 10 ug / ml de mitomicina C, durante 3 horas a 37 ° C, lavar as células 3x com fosfato tamponado salino da 1X Dulbecco (STP-D), e, em seguida, se dissociam MEFs com 0,05% de tripsina em 0,53 mM EDTA. Alternativamente, irradiar MEFs a uma dose de 8000 rads com um irradiador de raios-X. </li><li> Conte o número de células utilizando o método de exclusão com Trypan Blue mancha sob microscópio. Como alternativa, use um contador automático de células. </li><li> Placa MEFs irradiados em placas de poliestireno de 6 poços revestidos com gelatina a 0,1% a uma densidade de 1,88 x 10 5 células por poço (ou seja, 1,96 x 10 4 células / cm 2). Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Remova o meio de cultura MEF por aspiração com uma pipeta de Pasteur (Nota: não as etapas de lavagem necessárias neste momento). </li><li> Colônias Triturar HPSC da cultura anterior em pequenos pedaços, examinar os aglomerados sob microscópio para garantir que seus tamanhos que variam from 50 a 100 mM, em diâmetros, e placa aglomerados HPSC sobre o topo das camadas alimentadoras MEF num poço contendo 2 ml de meio HPSC. </li><li> Mude hESC média diária de 3 a 5 dias, a registro o crescimento da colônia por fotografia, marque qualquer colônias morfologicamente alterados ou diferenciadas (~ 5%), e remover manualmente as colônias marcadas pela suavemente aspiração com uma pipeta Pasteur. </li><li> Lavar as colónias remanescentes no MEFs duas vezes (2 min cada com D-PBS), e incuba-se as colónias, com 2 ml de 1 mg / ml de colagenase IV em meio HPSC por 10 a 30 min), e analisar o desprendimento de colónias do HPSC superfície MEF-revestido (Nota: use um raspador para ajudar o processo de desapego somente se as colônias são fortemente ligado à placa). </li><li> Adicionar 5 ml de meio HPSC a cada poço para minimizar reações enzimáticas, colônias de transferência para um tubo de 15 ml, permitir colônias HPSC para sedimentar por 3 a 5 minutos à temperatura ambiente, e garantir a sedimentação de colônias por visualização direta do cells na parte inferior do tubo (Nota: não se centrifugar o tubo nesta fase). </li><li> Retire os sobrenadantes contendo MEFs residuais e dissociado células individuais, voltar a suspender as colônias com 5 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas, e repita o passo sedimentação duas vezes. </li><li> Retire as médias, colônias HPSC triturar em pequenos pedaços, loja em 1X HPSC congelamento médio (ou CryoStore CS10 meio de congelamento) para criopreservação (1 confluente bem por frasco congelado) ou placa em uma placa de 6 poços para passaging celular. </li></ol> 3 Protocolo 2:. Converter HPSC Colônias de Alimentadores para NCM <ol><li> Lavar peletes HPSC em D-PBS, uma vez, incuba-se as peletes com 1 ml de 1X Accutase durante 10 min, e examinar a reacção enzimática sob um microscópio para assegurar a dissociação de uma única célula. </li><li> Encerrar as reacções enzimáticas por ressuspensão suave das células em 5 ml de meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632, seguido por centrifugação a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min(Nota, não use força excessiva de centrifugação, que causam danos às células). </li><li> Adicionar 5 ml de meio mTeSR1 ao sedimento, ressuspender o sedimento de células individuais, e filtro de células dissociadas através de um filtro de células de 40 mM (para remover quaisquer agregados celulares residuais). </li><li> Semente 1,3-2 x 10 6 para um poço hPSCs (1,4-2,1 x 10 5 células / cm 2) de uma placa de 6 poços revestidas com 2,5% de células estaminais embrionárias humanas qualificado Matrigel, adicionar meio mTeSR1 até 2,5 ml, e incluem 10 uM Y-27632 no meio (para facilitar o plaqueamento inicial de 24 horas de uma única célula). Em alternativa, utilizar os seguintes pequenas moléculas para substituir 10 mM Y-27632 para melhorar chapeamento de uma única célula: 1 PM Y-39983 (ROCK I inibidor), 1 phenylbenzodioxane mM (inibidor ROCHA II), 1 PM thiazovivin (um novo inibidor ROCK) , e 2 uM inibidor de JAK 1. </li><li> Substitua o meio com meio mTeSR1 livre de drogas no dia seguinte (dentro de 24 horas), dissociar as células de um adicionalbem, e contagem do número de células para determinar a eficiência de uma única célula de revestimento (Nota: aproximadamente, 50 a 90% de uma única célula plaqueamento eficiência que podem ser alcançados nesta fase). </li><li> Permitir que as células a crescer como uma única formada de células em monocamada durante alguns dias com 3 ml de meio mTeSR1. Mude média diária. </li><li> Empiricamente determina o ritmo de passaging adaptado NCM, dependendo da densidade celular. Passagem, quando o crescimento celular atinge confluência no dia 3 ou dia 4, ou no ponto de tempo de 4 horas após o desaparecimento das fronteiras da célula-a-célula. Dissociar as células em 1 ml de Accutase, utilizar uma proporção de 1 a 3 desdobramento (isto é, uma bem confluente de células plaqueadas em 3 cavidades de placa de 6 poços) para passagens em células e estabilizar adaptado NCM por 5 passagens. </li><li> Congelamento celular <ol><li> Utilizar um bem confluentes (5-6 x 10 ~ 6 células) para um frasco congelado: dissociar as células confluentes de uma bem com 1 mL de Accutase durante 10 min. </li><li> Diluir wom 5 ml de células em meio de centrifugação e mTeSR1 como descritos acima. </li><li> Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio mTeSR1 e, em seguida, adiciona-se lentamente 500 ul de 2X HPSC meio de congelação (contendo 20 ^ M Y-27632) em um frasco de criopreservação. Alternativamente, ressuspender as células em 1X HPSC meio de congelamento contendo inibidor 2 uM JAK 1 ou meio 1X CryoStor CS10, na presença de 10 uM ou Y-27632 ou 2 fiM inibidor de JAK 1. </li><li> Colocar os frascos congelados em um cryocontainer gelo-refrigeradas (inferior preenchido com isopranol) e transferir o cryocontainer para um congelador de -80 ° C imediatamente. </li><li> Transferência de células do freezer -80 ° C para um tanque de nitrogênio líquido (no dia seguinte) para a criopreservação de longo prazo. </li></ol></li><li> Descongelamento celular <ol><li> Utilize um frasco de criopreservação para chapeamento um poço de uma placa de 6 poços. </li><li> Meio de pré-aquecer mTeSR1 em um banho de água a 37 ° C durante 10 min, as células descongelamento no mesmo banho de água durante 2 minutos,gota a gota para adicionar as células 5 ml de meio mTeSR1 pré-aquecido contendo 10 uM Y-27632, e centrifuga-se como descrito acima. </li><li> Suavemente ressuspender as pelotas de células com 2 ml de meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632 e lentamente transferir células de um poço de pré-revestidas com Matrigel (Nota: evitar a produção de bolhas de ar). </li><li> Mude médio diário e esperam que o crescimento HPSC para alcançar confluência no dia 3 ou 4. </li></ol></li></ol> 4 Protocolo 3:. Converter HPSC colônias em Matrigel a NCM Cultura <ol><li> Retirar uma placa revestida de Matrigel do frigorífico, colocar a placa na cultura capa de tecido, durante 10 a 30 minutos, remover o meio de cada poço da placa, e adicionar 2 ml de meio mTeSR1 pré-aquecido a cada poço. </li><li> Transferência triturado aglomerados HPSC da cultura alimentador (Passo 2.10 do protocolo de base) para a placa de Matrigel acima. Adicionar meio mTeSR1 até 2,5 ml de volume final em cada poço. </li><li> Alterar média diária durante 3 a 4 diass até colónias atingir 80 a 90% de confluência. </li><li> Para passagens em células: enxaguar as colónias com D-PBS, duas vezes, o tratamento de células com 1 ml de 2 mg / ml de dispase a 37 ° C durante 15 a 20 min, e de sedimento e de passagem de células como aglomerados. </li><li> Para a cultura NCM: repita os passos 3,1-3,9 definido no protocolo 2. </li></ol> 5 Protocolo 4:. NCM Cultura da hPSCs no LN-521 <ol><li> Descongelar o recombinante LN-521 solução, a 4 ° C, antes do dia da utilização e fazer a solução de revestimento de laminina (LCS), diluindo a laminina descongelado com 1X D-PBS (contendo Ca 2 + / Mg 2 +) para uma concentração final de 10 ug / ml. </li><li> Adicionar 1 ml da LCS a um bem em 6 bem-placa (nota: evitar a seco durante o processo de revestimento). </li><li> Selar a placa revestida com Parafilm para evitar a evaporação e armazenar o prato na geladeira (4 ° C) O / N (nota: use a placa dentro de 1 semana). </li><li> Remova cuidadosamente os LCS com uma pipeta de Pasteur, sem auching a superfície revestida e adicionar 2 ml de meio mTeSR1 para um poço. </li><li> Aquecer todas as soluções de cultura (incluindo D-PBS) em um banho de água a 37 ° C durante 25 min. </li><li> Converta colônias HPSC para NCM <ol><li> Dissociar agregados celulares de células individuais com Accutase conforme descrito no protocolo 2. </li><li> Semente 1,3-2 x 10 6 hPSCs em um LN-521-revestido bem (1,4-2,1 x 10 5 células / cm 2), sem a presença de inibidores de rock. </li><li> Alterar média diária durante 3 a 4 dias. </li><li> Dissociar as células em 1 ml de Accutase no dia 3 ou 4 para a próxima passagem em células usando um 1 a 3 razão de divisão. </li></ol></li></ol> . 6 Protocolo 5: NCM Cultura para plasmídeo DNA transfecção <ol><li> Adaptar colónias HPSC a cultura NCM tal como descrito em Protocolos 2 e 4. </li><li> Placa dissociado hPSCs em 12 poços da placa com uma densidade de células de 7,5 x 10 5 células / poço em meio mTeSR1 na presença de 10 uM Y-27632. </li><li> Substituir médio mTeSR1 com meio mTeSR1 livre de drogas entre 4-8 horas após o plaqueamento das células. </li><li> Para cada transfecção, diluir 2,5 ug de plasmídeos de expressão (por exemplo, pmaxGFP) e 5 ul de Lipofectamina 2000 em tubos Eppendorf separados em 125 ul de cada um de Opti-MEM. </li><li> Após 5 min, misturar os reagentes e incubar diluídos durante 20 min a temperatura ambiente (de modo a formar complexos de transfecção). </li><li> Adicionar os complexos de transfecção 250 ul a cada poço contendo hPSCs em 1 ml de meio mTeSR1 e incuba-se as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Examinar a eficácia de transfecção com um microscópio de fluorescência e fotografia aleatoriamente para o cálculo da eficiência de transfecção real. </li></ol> . 7 Protocolo 6: NCM Cultura para transfecção de MicroRNAs <ol><li> Dissociar hPSCs semi-confluentes no dia 2, em condições NCM, adicionando 1 ml de Accutase por poço em 6<html> Bem-placa. </li><li> Adicionar 10 ml de meio mTeSR1 para diluir as reacções enzimáticas e centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de células com meio mTeSR1, semear as células a uma densidade de 7,5 x 10 5 células por poço numa placa de 12 poços em meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632, e permitir que as células aderir durante 4 h. </li><li> Substitua o meio com meio Y27632-livre mTeSR1. </li><li> Use comercialmente disponível microRNAs (por exemplo, um miRIDIAN miRNA transfecção de controle não-alvo marcado com Dy547). Titula-se concentrações na gama 0-160 nM usando os reagentes fornecidos e seguir as instruções dos fabricantes. </li><li> Optimizar a eficiência de transfecção para cada concentração em linhas HPSC pela imagem da fluorescência Dy547 das células vivas em um microscópio às 24 h após a transfecção. </li><li> Calcular as eficiências de transfecção com base no percentual de células positivas Dy547 sobre todas as células com imagens. </li></ol>. tle &quot;&gt; 8 Protocolo 7: Cultura NCM para a transdução de Lentivirus Vector <ol><li> Repita os passos 7.1 a 7.4 do Protocolo 6. </li><li> Calcular as quantidades de partículas virais a serem utilizadas para a transdução de: usar o seguinte fórmula: TU = (MOI x CN) / VT, enquanto TU indica o número total de unidades de transformação, MOI é igual à multiplicidade desejada de infecção no poço (ou MOI TU / célula), CN especifica o número de células em cada poço, e VT indica os títulos virais de estoque (TU / mL). Por exemplo, uma vez que os títulos virais de imagens SMART-shRNA vector é igual a 1 x 10 9 TU / ml (unidades de transformação por ml), 7,5 x 10 5 células por poço, no tempo de transdução, e esperada uma MOI de 20: 15 de usar mL das partículas virais de ações para cada poço (nota: esta condição é recomendado para indução lentiviral transitória). </li><li> Pré-quentes de 300 ul de meio mTeSR1 com 10 mg / ml de polibreno durante 30 min. </li><li> Adicionar 15 mL de partículas virais de ações emo meio mTeSR1 pré-aquecido contendo polibrene e misture delicadamente a solução. </li><li> Substituir o meio de cultura de células com 300 ul de meio pré-aquecido contendo as partículas virais. </li><li> Após 4 horas de incubação, examinar turboGFP fluorescência (um fabricante de expressão shRNA) para determinar a eficiência de transdução. </li><li> Adicionar 300 mL de meio mTeSR1 adicional para a transdução bem quando as células começam a expressar turboGFP. </li><li> Após 12-16 horas de incubação, reexaminar expressão turbo-GFP. </li><li> Realizar experimentos de acompanhamento desejados com essas células transduzidas dentro de 72 horas. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media.">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Há duas formas principais de se hPSCs cultura in vitro: cultura convencional do tipo colônia (de células em alimentadores ou matrizes extracelulares) e cultura de suspensão de hPSCs como agregados sem alimentadores 6. As limitações de ambos do tipo colônia e suspensão métodos de cultura incluem heterogeneidade acumulada e mudanças epigenéticas herdadas. Cultura NCM, com base em ambos passaging de uma única célula e plaqueamento de células de alta densidade, representa um novo método pa...

A capacidade de se diferenciar em direção hPSCs tecidos adultos multilinhagem abriu novos caminhos para o tratamento de pacientes que sofrem de doenças graves que envolvem cardiovascular, hepática, pâncreas, e sistemas neurológicos 1-4. Vários tipos de células derivadas de hPSCs também fornecem plataformas celulares robustos para modelagem de doenças, a engenharia genética, a seleção da droga, e 1,4 testes toxicológicos. A questão-chave que garante suas aplicações clínicas e farmacológicas futuras é a geração de um grande número de hPSCs clínica de grau através de cultura in vitro de células. No entanto, sistemas de cultivo atuais são insuficientes ou inerentemente variável, envolvendo várias culturas alimentadoras e sem alimentador de hPSCs como colônias 5,6. Crescimento do tipo colônia de ações hPSCs muitas características estruturais da massa celular interna (ICM) de embriões de mamíferos adiantados. A ICM é propenso a diferenciar-se em três camadas germinativasnum ambiente multicelular, devido à existência de gradientes de sinalização heterogéneos. Assim, a aquisição de heterogeneidade no desenvolvimento embrionário precoce é considerado como um processo necessário para a diferenciação, mas uma característica indesejável de cultura HPSC. A heterogeneidade na cultura HPSC é muitas vezes induzida por sinais apoptóticos excessivas e diferenciação espontânea devido a condições de crescimento abaixo do ideal. Assim, no tipo de colónia de cultura, as células heterogéneas são frequentemente observados na periferia das colónias 7,8. Foi também mostrado que as células em células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) colónias respostas diferenciais exposição a moléculas de sinalização, tais como BMP-4 9. Além disso, métodos de cultura colônia produzir colheitas de células baixas, bem como as taxas de recuperação muito baixo de células de criopreservação, devido às taxas de crescimento incontrolável e sinalização apoptótica vias 6,9. Nos últimos anos, várias culturas de suspensão têm sido desenvolvidos para hPSCs de cultura, particulArly para a expansão de grandes quantidades de hPSCs dentro e alimentadoras condições livres de matriz 6,10-13. Obviamente, os diferentes sistemas de cultura tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Em geral, a natureza heterogénea de hPSCs representa um dos principais inconvenientes da colónia de tipo e de cultura de agregados, que são métodos para a entrega de materiais de sub-óptima de DNA e de RNA em hPSCs por engenharia genética 6. Claramente, há uma necessidade imperiosa de desenvolver novos sistemas que evitam algumas deficiências dos métodos de cultura atual. As descobertas de inibidores de pequenas moléculas (como o inibidor ROCHA Y-27632 e JAK inibidor 1) que melhoram a sobrevivência de uma única célula pavimentar o caminho para a cultura dissociada-HPSC 14,15. Com a utilização destas moléculas pequenas, que desenvolveram recentemente um método de cultura de tipo não-colónia (NCM) crescimento de dissociar-hPSCs 9. Este método de cultura novela combina passaging de uma única célula e de alta densidadechapeamento de métodos, o que nos permite produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneas sob ciclos de crescimento consistente, sem grandes anormalidades cromossômicas 9. Alternativamente, a cultura NCM pode ser implementado com diferentes moléculas pequenas e matrizes definidas (como as lamininas), a fim de optimizar o processo de cultura de amplas aplicações. Aqui, apresentamos vários protocolos detalhados com base na cultura NCM e delinear procedimentos detalhados para a engenharia genética. Para demonstrar a versatilidade de protocolos NCM, também testamos cultura NCM com inibidores ROCHA diversas e com a única isoforma laminina 521 (ou seja, LN-521).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Countess automated cell counter&#160;&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.&#160;</td>
			<td style="width:187px;">C10227</td>
			<td style="width:187px;">Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Faxitron Cabinet X-ray System</td>
			<td style="width:220px;">Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Model RX-650</td>
			<td style="width:187px;">X-ray irradiation of MEFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">MULTIWELL six-well plates&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Becton Dickinson Labware</td>
			<td style="width:187px;">353046</td>
			<td style="width:187px;">Polystyrene plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">11965&#8211;092</td>
			<td style="width:187px;">For MEF medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">mitomycin C</td>
			<td style="width:220px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:187px;">107 409</td>
			<td style="width:187px;">Mitotic inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">25300-054</td>
			<td style="width:187px;">For MEF dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">11330&#8211;032</td>
			<td style="width:187px;">For hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">31985-062</td>
			<td style="width:187px;">For hPSC transfection</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Heat-inactivated FBS</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">16000&#8211;044</td>
			<td style="width:187px;">Component of MEF medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Knockout Serum Replacer&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">10828&#8211;028</td>
			<td style="width:187px;">KSR, Component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">14190-144</td>
			<td style="width:187px;">D-PBS, free of Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11140&#8211;050</td>
			<td style="width:187px;">NEAA, component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:187px;">25030&#8211;081</td>
			<td style="width:187px;">Component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:203px;">mTeSR1 &#38; Supplements</td>
			<td rowspan="2" style="width:220px;">StemCell Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;">5850</td>
			<td style="width:187px;">Animal protein-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">TeSR2 &#38; Supplements</td>
			<td style="width:220px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:187px;">5860</td>
			<td style="width:187px;">Xeno-free medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:187px;">7522</td>
			<td style="width:187px;">Component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;"> 
			MEF (CF-1) ATCC</td>
			<td style="width:220px;">American Type Culture Collection (ATCC)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">SCRC-1040</td>
			<td style="width:187px;">For feeder culture of hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:220px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:187px;">354277</td>
			<td style="width:187px;">For feeder-free culture of hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Laminin-521</td>
			<td style="width:220px;">BioLamina</td>
			<td style="width:187px;">LN521-02</td>
			<td style="width:187px;">Human recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">FGF-2 (recombinant FGF, basic)</td>
			<td style="width:220px;">R&#38;D Systems, MN</td>
			<td style="width:187px;">223-FB</td>
			<td style="width:187px;">Growth factor in hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CryoStor CA10&#160;</td>
			<td style="width:220px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:187px;">7930</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Accutase</td>
			<td style="width:220px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:187px;">AT-104</td>
			<td style="width:187px;">1X mixed enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">JAK inhibitor I</td>
			<td style="width:220px;">EMD4 Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">420099</td>
			<td style="width:187px;">An inhibitor of Janus kinase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Y-27632</td>
			<td style="width:220px;">EMD4 Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">688000</td>
			<td style="width:187px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Y-27632</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0012</td>
			<td style="width:187px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Y-39983</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0029</td>
			<td style="width:187px;">ROCK I inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Phenylbenzodioxane&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0030</td>
			<td style="width:187px;">ROCK II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Thiazovivin</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0017</td>
			<td style="width:187px;">A novel ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">BD Falcon Cell Strainer&#160;</td>
			<td style="width:220px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:187px;">352340</td>
			<td style="width:187px;">40-&#181;m cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Nalgene 5100-0001 Cryo 1&#176;C</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:187px;">C6516F-1</td>
			<td style="width:187px;">&#8220;Mr. Frosty&#8221; Freezing Container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:187px;">Transfection reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DharmaFECT Duo&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">T-2010-02</td>
			<td style="width:187px;">Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">IP-004500-01-05</td>
			<td style="width:187px;">Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">SMART-shRNA</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:187px;">To be determined</td>
			<td style="width:187px;">Lentiviral vector</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">pmaxGFP</td>
			<td>amaxa Inc (Lonza)</td>
			<td>Included in every transfection kit</td>
			<td style="width:187px;">Expression plasmid for transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">4-Oct</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-5279</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG2b, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">SSEA-1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21702</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgM, differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">SSEA-4</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21704</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG3, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Tra-1-60</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21705&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgM, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Tra-1-81</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21706</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgM, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">CK8 (C51)</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-8020</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG1, against cytokeratin 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">&#945;-fetoprotein</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-8399</td>
			<td style="width:187px;">AFP, mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">HNF-3&#946; (P-19)</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-9187</td>
			<td style="width:187px;">FOXA2, goat polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Troponin T (Av-1)</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">MS-295-P0</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Desmin&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">RB-9014-P1</td>
			<td style="width:187px;">Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Anti-NANOG</td>
			<td style="width:220px;">ReproCELL Inc, Japan</td>
			<td style="width:187px;">RCAB0004P-F</td>
			<td style="width:187px;">Polyclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Rat anti-GFAP</td>
			<td style="width:220px;">Zymed</td>
			<td style="width:187px;">13-0300</td>
			<td style="width:187px;">Glial fibrillary acidic protein</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Albumin (clone HSA1/25.1.3)</td>
			<td style="width:220px;">Cedarlane Laboratories Ltd. (</td>
			<td style="width:187px;">CL2513A</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG1,</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Smooth muscle actin (clone 1A4)</td>
			<td style="width:220px;">DakoCytomation Inc</td>
			<td style="width:187px;">IR611/IS611</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Nestin</td>
			<td style="width:220px;">Chemicon International</td>
			<td style="width:187px;">MAB5326</td>
			<td style="width:187px;">Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">TUBB3</td>
			<td style="width:220px;">Convance Inc</td>
			<td style="width:187px;">MMS-435P</td>
			<td style="width:187px;">Tuj1, mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">HNF4&#945; (C11F12)</td>
			<td style="width:220px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:187px;">3113</td>
			<td style="width:187px;">Rabbit monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Paraformaldehyde (solution)</td>
			<td style="width:220px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:187px;">15710</td>
			<td style="width:187px;">PFA, fixative, diluted in D-PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alternative cultures for human pluripotent stem cell production, maintenance, and genetic analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Um esquema geral da cultura NCM A Figura 1 representa um esquema de cultura NCM típico mostrando as alterações dinâmicas de hPSCs depois de alta densidade de revestimento de uma única célula, na presença do inibidor ROCHA Y-27632. Estas alterações morfológicas incluem ligações intercelulares após o plaqueamento, a formação de agregados celulares e crescimento celular exponencial, seguido por condensação de células (Figura 1A).</stro...

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Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

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