Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Autores agradecer à equipa técnica e OEM em Gilson, INC para o suporte técnico estendido.

Os autores MKC, MJG, EEB, NJD e RO estão ou estavam no momento de funcionários de desenvolvimento de InvivoSciences, INC que conceberam e desenvolveram os protocolos robóticos descritos aqui. TW é o CSO para InvivoSciences INC. SH é um empregado de Gilson INC.

No presente estudo foi desenvolvido um método de cultura robótico para a produção iPSC que miniaturizes e automatiza alimentação e passagem em um formato de placa de 96 poços ao mesmo tempo, permitindo aumento de escala eficiente. Um robô de manipulação líquido foi utilizado para alimentar rotineiramente colónias IPSC e passagem los em intervalos regulares por dissociação enzimática. O robô também foi programado para produzir placas revestidas de gel de matriz extracelular e executar um gradiente de densidade de sementeira. Quando fibroblastos e tecido adiposo derivado iPSCs foram cultivadas neste sistema durante mais de 20 passagens, cerca de 3 meses, pluripotência foi mantida, como foram cariótipos estáveis. Ambas as linhas celulares foram capazes de diferenciação em cardiomiócitos. Juntos, a coleção de protocolos descrito aqui permite que os usuários com pouca experiência de cultura de células-tronco, ou acesso limitado a cultura equipamento especializado, a cultura de células-tronco e atingir uma produção de alta celular ou multi-linha manipulação com trabalho mínimo e custo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Os protocolos robóticos detalhadas aqui fornecer um método para aumento de escala econômica de produção e manuseio da IPSC. Uma vantagem é a cultura de células-tronco escalável em um formato de placa estabelecida com base demonstrado aqui e anteriormente 44,47 - 49 para manter pluripotência. Enquanto outros formatos de células pluripotentes rendimento escalável cultura de células-tronco 20,23,29 método esta placa baseada essencialmente requer nenhuma mudança no formato da cultura, como a adaptação à suspensão, uso de anti-espuma produtos químicos ou o uso prolongado de Rho-quinase inibidor 20. Este método placa de base pode, portanto, rapidamente e, previsivelmente, acomodar novas linhas porque as condições de cultura são semelhantes. Como o uso de iPSCs para modelagem doença aumenta 4,6,19,50, novas linhas de IPSC são continuamente gerados. As técnicas descritas aqui são os mais adequados para a cultura nova linhas em meio ao alto volume e taxa de transferência porque a barreira para a transição para o formato é low. Isto também é verdade para o trabalho e do equipamento necessário para manter as colônias. Por último, porque o formato e manuseamento são semelhantes ao meio ambiente usado para derivar linhas e validar IPSC, desempenho de cultura, tais como a diferenciação dirigida, é provável que seja mais previsível. A Figura 8 ilustra uma estratégia para aumento de escala da produção de células estaminais em placas de 96 poços. Uma placa (ciclo 0) é utilizada para semear roboticamente 12 novas placas, um aumento de 12 vezes (ciclo 0 a 1). Depois de vários dias de alimentação, um dos doze placas é passadas para semear um outro conjunto de doze placas (Ciclo 1 Ciclo 2 a). Os restantes onze placas estão agora disponíveis para outros usos e representam o componente de produção do sistema. A este ritmo, a passagem de uma placa irá fornecer 11 placas de cada ciclo, ou a cada 3-4 dias. Esta metodologia pode ser dimensionada mais quando várias placas são passadas como mostrado na transição do Ciclo 2 para Ciclo 3. No ciclo 3, duas placas sãosempre utilizados para manter a colônia e sementes 24 novas placas. Os restantes 22 placas são então disponíveis para uso após cada ciclo de passagem. Em qualquer ponto no ciclo de manutenção do utilizador pode propagar mais placas para aumentar a produção. Um exemplo seria a passagem cada coluna para dois ciclos de crescimento. A primeira passagem converte uma placa em doze placas, e cada um dos doze placas é utilizada para semear 144 placas. Neste caso, um utilizador inicia com uma placa e após duas passagens, ou cerca de 1,5-2 semanas de cultura, tem 144 placas. Por exemplo, os fibroblastos e tecido adiposo linhas de IPSC produzir aproximadamente 25-75000000 células por placa de 96 poços quando estiver pronto para a passagem. 144 placas poderiam representar, por conseguinte, cerca de 4-7 x 10 9 células. O que é a carga de trabalho para o transporte de 144 placas de 96 poços roboticamente? Uma das metas para este trabalho foi a produção de células-tronco escalável que reduziu o trabalho em comparação aos tradicionais (placa ou seja, de 6 poços) cultura de células-tronco. O robô accomplishes este aliviando a necessidade de manipular fisicamente cada placa durante a alimentação e passaging. Enquanto escalas de 96 poços de produção placa linearmente, como seria em placas de 6 poços tradicionais, o tempo que um técnico gasta trabalhando com as placas é significativamente menos cultura utilizando robótica. A eficiência da produção de cultura robótico é derivado a partir desta diferença (Figura 9). Verificou-se técnicos poderia remover uma placa de 6 poços da incubadora, que vá ao microscópio, em seguida, aspirar e alimentar a placa em cerca de 3,5 minutos. Em comparação, os técnicos de passar cerca de 30 seg a remoção de uma placa de 96 poços da incubadora e inspeccionar sobre o microscópio para a densidade e a contaminação antes da sua colocação sobre o robô. Com um protocolo de alimentação expandida semelhante ao descrito acima, seis placas de 96 poços pode ser carregado e alimentado, o que demora aproximadamente 21 min ou 3,5 min por placa. O tempo total decorrido para alimentar uma placa é comparável entre robôic e métodos manuais, mas a alimentação de mão 6 placas de um técnico é necessário para todos os 21 min enquanto o técnico gasta apenas 3 min lidar com as seis placas para o robô (uma inspeção de 30 segundos por placa). Como a Figura 9 mostra, o tempo de um técnico passa a manipulação 144 placas usando o robô é cerca de 1,2 horas, contra 8 hr manualmente eo robô nunca vai fazer manipulação um erro as placas ou a transferência de líquidos. As 96 cavidades de cultura de IPSC métodos descritos aqui proporcionam uma plataforma para as tarefas de triagem tratável complexos. Porque cada poço é geneticamente idêntico e semeado com a mesma densidade a partir do mesmo conjunto inicial, as variáveis ​​podem ser distribuídos ao longo da placa e mantido pelo robô com reservatórios disponíveis comercialmente para segregar condições. Isto seria útil para experiências, como o crescimento de células estaminais desenvolvimento meios 34,35,47, substrato ou condição de cultura teste e estudos de toxicidade utilizando células estaminais51. Uma vez que cada linha de células estaminais é único em termos de requisitos de tamanho colônia e passagem óptimas, pode-se usar este sistema para modular a densidade de semeadura, freqüência de alimentação e manuseio passagem através da manipulação das colunas colhidas, a agitação mecânica durante a passagem ea frequência de alimentação. Iteração através destas variáveis ​​permitirá ao usuário encontrar rapidamente um conjunto de condições adequadas para a cultura de uma nova linha ou desenvolver novas técnicas de cultura. O sistema robótico também é capaz de manter a 96 colónias de células-tronco paralelas mas independentes. Quando IPSC derivada a partir de células somáticas ou clonado após a manipulação genética, vários clones são rastreados paralelas para produzir potenciais linhas IPSC. Uma vez que as células individuais são semeadas em placas de 96 poços, este sistema pode alimentar e de passagem das placas de 96 poços a colocação de cada colónia segregados. Isto permite muito elevado rendimento quando selecção de clones potenciais e elimina a dificuldade de cultura de 96 linhas paralelas fisicamente. Este método também umallows ampliados produção de cada clone, de modo que o material é prontamente disponível para análise paralela. Finalmente, prevemos integrando estas técnicas de cultura com um sistema de tráfico placa robótico que proporciona placas de e para a incubadora de cultura permitindo totalmente automatizado. Isto poderia ser conseguido com a robótica mais complexos que permitem uma maior expansão desde os protocolos básicos aqui descritos são transferíveis para outros sistemas baseados placa. Os primeiros passos críticos para abordar nos protocolos são aqueles que impedem e verificar se há contaminação, tais como os passos 1.5 e 4.2. Contaminação, como discutido acima, podem ser evitados com êxito se boa técnica estéril e bom senso são utilizados. É imperativo, independentemente do formato de cultura de células-tronco, que o cheque operador de contaminação e fazê-lo neste protocolo com os passos indicados irá reduzir significativamente o risco de contaminação. Aplicação do gel matriz extracelular adequada é uma segunda essnóstico passo para o sucesso global do presente protocolo. Sem revestimento adequadamente as placas de 96 poços, as células estaminais não irão crescer. Um problema comum é bem revestimento incompleto. A experiência demonstrou que as bolhas de ar, uma atracção electrostática e impedir acção capilar bem revestimento completo. O passo de pré-molhamento (1.6) foi desenvolvido para melhorar significativamente revestimento cavidades de fundo e não devem ser ignorados. Este passo de pré-molhar parece reduzir a hidrofobicidade aparente de 96 poços de plástico da placa de tal modo que quando o revestimento de gel da matriz extracelular é aplicada, ela é distribuída uniformemente em toda a cavidades de fundo e os lados. Também é recomendado para tocar suavemente as placas de 96 poços contra uma mão limpa uma vez revestido para garantir até mesmo distribuição extracelular solução gel matriz. Os parâmetros de dissociação são também importantes a optimizar. Incubação prolongado com a enzima ou reagente de dissociação com base EDTA vai resultar em células individuais, que podem ou não ser o objectivo durante a passagem. Por conseguinte, o operadordevem prestar especial atenção à forma como tempo de dissociação, força trituração, e repetições de lavagem afetar morfologia da colônia e da saúde e ajustar em conformidade. Compreender as limitações ao das técnicas descritas aqui são fundamentais para a operação bem-sucedida. Tal como em qualquer outro ambiente de cultura de células, a utilização de placas de 96 poços apresenta um risco relativamente elevado de contaminação. Como acima descrito, um técnico é responsável por cada placa durante a alimentação e passaging; por exemplo, quando se abre a tampa, colocar a placa na cama robô, e verificando a placa no microscópio. Portanto, como foi observado após o passo 1.5, é imperativo não tocar no interior de qualquer tampa ou placa de expor essa parte em qualquer superfície potencialmente contaminados, como os blocos de aquecimento inclinados ou pinos verticais na cama. Durante o desenvolvimento do protocolo essa limitação foi descoberto e foi o impulso para desenvolver um rack para segurar tampas de placas para manter a esterilidade. Da mesma forma, os reservatórios de cocho, pontas de pipeta e outras fontes sobre a cama manipulação robô líquido são fontes potenciais de contaminação, porque eles estão abertos ao meio ambiente e manipulados pelo técnico. Portanto, uma boa técnica estéril deve ser aplicada como a redução movimentos sobre os materiais de cultura expostas ou líquidos abertos. Outra limitação é que, quando o protocolo é dimensionado para cima, verificando visualmente cada poço de 100&gt; placas de 96 poços é incómodo. Este pode ser tratado por inspecção visual toda a placa para sinais de contaminação, tais como meios turva, para identificar poços suspeitas. Para aumento de escala futuro, a utilização de um microscópio automatizado e indicador de crescimento celular e potencial contaminação serão incorporados. Em resumo, o 96 poços plataforma de base de elevado rendimento descrita aqui oferece um método reprodutível, de alta fidelidade para a cultura de células estaminais e de produção num formato de placa. Este método reduz a experiência necessária, equipamentos e tempo necessário de trabalho dedicado à cultura de células-tronco enquantomantendo os benefícios de cultura aderente tradicional.

O uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) tem aumentado significativamente desde sua derivação em 2007 1 para o teste composto, medicina regenerativa e modelagem doença 2-6. Essa demanda vem da capacidade de iPSC para produzir grandes quantidades de células pluripotentes que podem ser diferenciadas em células somáticas em uma quantidade inigualável. Como técnicas de diferenciação dirigidos melhorar 7-10 e desenvolvimento de células humanas ou modelagem de tecidos e terapia celular aumenta 11-14, o mesmo acontece com a exigência de produção em massa de iPSCs de alta qualidade. É amplamente citado que, entre outras doenças, enfarte do miocárdio ou a substituição funcional de células b vai exigir centenas de milhões para bilhões de iPSC derivada de células somáticas 15-18. Modelagem de tecido 3D Além disso, cada vez mais complexo para a descoberta de drogas e therapy vai exigir um grande número de células 9,13,19. Em todos estes exemplos, definido, uniforme e iPSCs reprodutíveis deve estar disponível e fácil de produzir. A fim de produzir-tronco derivadas de células biopharmaceutics e células para engenharia de tecidos e transplantes, uma tecnologia de células de fabricação de baixo custo é essencial. De produção em escala de iPSCs concentrou-se em cultura em suspensão de 20 - 25 ou uma suspensão com a utilização de substratos de microveiculos 26-28, em parte, porque estas técnicas são implantadas com sucesso para grande escala, não CIPS, produção baseado eucariótica. Vários grupos têm demonstrado que sistemas de cultura de suspensão de células estaminais pluripotentes produzem 20,21,23,24,29. No entanto, estas abordagens utilizam sistemas caros e complexos não prontamente disponíveis para os pesquisadores que desenvolvem programas de diferenciação novos, dirigindo engenharia de tecidos e fazendo laboratinvestigação à escala ory. Além disso, suspensão e microcarregador culturas IPSC necessitam de adaptação e técnicas ou produtos químicos que não são encontrados na cultura iPSC tradicional aderente, como o uso contínuo de inibidores Rho-quinase, agentes anti-espuma e filtração para regular agregação. O stress físico às células é mais prevalente em cultura em suspensão, introduzido por meio de agitação mecânica, bem como durante a colisão microtransportador. Estes problemas limitam a previsibilidade e velocidade com que recém-gerado linhas de células estaminais podem ser cultivadas em suspensão. Outros têm desenvolvido sistemas robotizados de manuseamento de placas que imitam as técnicas de cultura de placas 30,31 mas estas plataformas exigem grandes investimentos para equipamento e perícia para operar para além dos desafios fundamentais associados com a cultura de células estaminais. O presente trabalho descreve o desenvolvimento ea prática de um sistema de cultura escalável iPSC que utiliza um líquido robótico de 8 canais padrão auto-suficientemanipulador e placas de 96 poços. Este método foi concebido para colmatar escala de laboratório cultura iPSC e de alto volume de produção iPSC (por exemplo, 10 7-1,5 x 10 9 células por semana por técnico), permitindo aqueles que desenvolvem novas tecnologias IPSC para escalar facilmente a produção sem grandes investimentos em hardware ou trabalhistas. Este método é relativamente barato para configurar, requer pouca ou nenhuma experiência de cultura de células-tronco, programação ou engenharia, tem uma pequena pegada de equipamentos sem a necessidade de uma capa de cultura de células dedicado, e utiliza equipamento de cultura celular padrão para permitir a média a alta taxa de transferência automatizado a produção de células. O objetivo era desenvolver um sistema capaz de cultura de células-tronco escalável que pode ser utilizado por laboratórios novos para conter cultura de células, aqueles que acham cultivo manual uma barreira para o desenvolvimento de suas idéias ou aqueles que querem um meio econômico para a produção de um grande número de células-tronco. A plataforma apresentada aqui remove influência sobre técnicocultura de células-tronco e normaliza os procedimentos de alimentação e passagem para permitir a produção de células-tronco consistente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Avanço contínuo em cultura de células-tronco pluripotentes está fechando a lacuna entre banco e cabeceira para o uso dessas células na medicina regenerativa, a descoberta de medicamentos e testes de segurança. A fim de produzir-tronco derivadas de células biopharmaceutics e células para engenharia de tecidos e transplantes, uma tecnologia de células de fabricação de baixo custo é essencial. Manutenção da pluripotencialidade e desempenho estável de células em aplicações a jusante (por exemplo, a diferenciação de células) ao longo do tempo é fundamental para a produção de células em grande escala. No entanto, isso pode ser difícil de conseguir, especialmente se as células são cultivadas manualmente onde o operador pode introduzir variabilidade significativa, bem como ser proibitivamente caro para aumento de escala. Para habilitar de alto rendimento, a produção de células-tronco em larga escala e remover a influência do operador protocolos de cultura de células-tronco usando um romance de bancada multi-canal de líquido manipulação do robô foram desenvolvidos que requerem o envolvimento técnico mínima ou experiência. Comestas células estaminais pluripotentes induzidas protocolos humanos (IPSCs) foram cultivadas em condições isentas de alimentação directamente a partir de um lote congelado e mantidas em placas de 96 poços. Dependendo da linhagem de células e taxa de aumento de escala desejado, o operador pode facilmente determinar quando a passagem com base numa série de imagens que mostram as densidades óptimas de fraccionamento de colónias. Em seguida, os reagentes necessários estão preparados para realizar uma separação de colónias para placas novas, sem um passo de centrifugação. Após 20 passagens (~ 3 meses), duas linhas de IPSC mantida cariótipos estáveis, expressa marcadores de células estaminais e diferenciadas em cardiomiócitos com alta eficiência. O sistema pode realizar subsequente rastreio de alto rendimento de novos protocolos de diferenciação ou manipulação genética concebidos para placas de 96 poços. Esta tecnologia vai reduzir a carga de trabalho e técnica para produzir um grande número de células-tronco idênticas para uma infinidade de aplicações.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.4K visualizações.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Um dispositivo para executar a migração celular / cicatrização de feridas em uma placa de 96 poços

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...