This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Bj&#246;rk S&#252;ss for helpful comments.

1. Aspectos gerais da amostra e Instrumento Preparação <ol><li> Use um espectrômetro comercial FT-IR equipado para medições passo-scan resolvida no tempo. Para obter os melhores resultados colocar o espectrómetro de FT-IR na parte superior de uma mesa dissociado-vibração. </li><li> Evacuar o compartimento de ótica para alguns mbar. Purgar o compartimento da amostra com ar seco ou azoto. </li><li> Coloque um IR material transparente opaco à radiação visível na frente do detector MCT do espectrómetro de FT-IR. Esta precaução é essencial para evitar artefatos do pulso de laser emocionante durante experimentos passo-scan. Nota: Nós usamos um de germânio (Ge) janela de 25 mm de diâmetro. O alto índice de refração faz com que intensidade indesejável perde, em grande parte evitadas usando um filtro de Ge com revestimento antireflexo. </li><li> Refresque-se o detector MCT Dewar com nitrogênio líquido. Nota: O uso de detectores fotovoltaicos MCT é preferido sobre photoconductives devido à sua resposta linear e, por conseguinte, photometr superioresic precisão e confiabilidade da linha de base 31,53. </li><li> Pré-concentrar a amostra usada para as experiências para, pelo menos, 2 mg de proteína / ml em um tampão de baixo (&lt;20 mM) a força iónica para evitar a formação de cristais de sal, enquanto a secagem da suspensão de proteína para formar uma película homogénea de proteína. Para amostras que sedimento, lavar / concentrá-las através da aplicação de ultracentrifugação (por exemplo, proteínas de membrana, um lipossomas ou em pedaços de membrana celular). Use centricons de corte adequada para proteínas que não fazem sedimento (por exemplo, proteínas de membrana solubilizadas em detergente). </li><li> Para melhores resultados use: a) preparações de proteínas tão puro e ativo quanto possível; b) Relação de lípidos / proteínas ≤ 3 em peso para as proteínas em manchas de membrana celular ou reconstituídos em lipossomas; c) índices de detergente / proteína ≤ 1 em peso para as proteínas de detergente solubilizado. Evite o uso de detergentes ou lipídios cujas bandas vibracional se sobrepor aos da proteína (por exemplo, rachaduras). </li></ol&gt; 2. Preparação de total atenuada Experimentos reflexão sobre bacteriorodopsina <ol><li> Montagem do acessório de ATR para dentro do compartimento da amostra do espectrómetro de FT-IR. Nota: Nós usamos um ATR ZnSe / diamante com 5 reflexões ativos. Evite materiais semicondutores como o germânio ou de silício como elemento de reflexão interna (IRE) do acessório ATR, como suas propriedades ópticas são afetados pelo laser visível emocionante. </li><li> Meça uma ampla gama (aprox. 4,000-800 cm -1) espectro de energia em 4 cm-1 de resolução da superfície IRE limpa, rápida-scan espectroscopia FT-IR convencional. Utilizar este espectro de um espectro de referência para calcular espectros de absorção em uma fase posterior. </li><li> Cobrir a superfície IRE do ATR com 20 mL de tampão usado mais tarde para re-hidratar a amostra (por exemplo, 4 M de NaCl e 100 mM de NaPi, pH 7,4). Medir a absorção de infravermelho do tampão. </li><li> Retire o tampão, e lavar a superfície wi IREª água. Evite tocar na superfície. Remover o líquido residual a partir da superfície do IRE por uma intensa corrente de ar. </li><li> Espalhe ~ 3 ul de bacteriorodopsina (BR) em membranas roxas (~ 6 mg de proteína / ml em água desionizada) por cima da superfície IRE (-0,2 cm 2 de área). Seca-se a suspensão da proteína sob uma ligeira corrente de ar seco até um filme é atingido. </li><li> Medir o espectro de absorção do filme seco (ver Figura 1). </li><li> Adicionar cuidadosamente 20-40 ul de um tampão de elevada força iónica para hidratar o filme seco (por exemplo, 4 M de NaCl e 100 mM de NaPi, pH 7,4). Nota: A força iónica elevada impede inchamento excessivo da folha de membrana, o que permite reter o máximo de proteína possível fechar a superfície apalpada (Figura 2). </li><li> Cobrir o suporte do ATR com uma tampa para evitar a evaporação da água. Opcionalmente, colocar um revestimento de cobertura ligada a um banho de circulatório definido como 25 ° C por controlo da temperatura. Para as proteínas com photocycles longos (&amp; #62; segundos), o controle de temperatura pode aumentar a estabilidade da linha de base. </li><li> Meça um espectro de absorção. Estimar a percentagem de amostra que permanece perto da superfície após a re-hidratação do filme através da subtracção do espectro de absorção do tampão (Figura 3). </li><li> Confirmar estabilização da película inchaço gravando os espectros de absorção a 5-20 minutos de intervalo após a re-hidratação (Figura 4). Este passo é opcional, mas recomendado. </li></ol> 3. Realização de experimentos de transmissão de detergente-solubilizado channelrodopsina-2 <ol><li> Adicionar 10 ul de ChR2 (~ 10 mg de proteína / ml) dissolvido em mM NaCl 5 mM, HEPES 5 (pH 7,4) e decil-maltósido (DM) no centro de uma janela BaF 2 de 20 mm de diâmetro. Espalhá-lo com a ajuda da ponta da micropipeta para um diâmetro de 6-8 mm (proteína de densidade superficial de ~ 200 ng / cm 2). </li><li> Forma um filme using um fluxo suave de ar seco. Para obter os melhores resultados de assegurar que a película é homogéneo e tem um diâmetro mais ou menos correspondente ao tamanho do feixe de infravermelhos na maior abertura. </li><li> Hidratar a película através da adição de 3-5 uL de uma mistura de glicerol / água distribuída em 3-5 gotas em torno do filme seco, e com força perto o com uma segunda janela utilizando um silicone plana O-ring de ≥ 1 mm de espessura. Nota: A relação da mistura de glicerol / água controla a humidade relativa entre as janelas 54. Para amostras hydroscopic usar uma proporção 3/7 ou 2/8 de glicerol / água (w / w). As gotas de glicerol / água nunca deve estar em contato direto com o filme de proteína. </li><li> Insira os BaF 2 janelas colada em um suporte. Impedir que a luz directamente a partir do detector, atingindo a tapar a janela da amostra com um material opaco IR, tais como papel, com um orifício que corresponde ao tamanho da película hidratada. Colocar o suporte no compartimento da amostra. </li><li> Controlar a temperatura do suporte a 25 °C por uma camisa termostática ligado a um banho de temperatura controlada circulatório. </li><li> Medir um espectro de absorção. Assegure-se que a absorção máxima na região da amida I (~ 1,700-1,620 cm -1) está na gama de 0,6-1,0. </li><li> Estimar a massa ea razão molar de proteína / detergente / água a partir do espectro de absorção do filme hidratado (Figura 5) utilizando extinção referência espectros coeficiente de água, DM, e proteínas de membrana representativos (Figura 6). </li><li> Aguarde até que o nível de hidratação estabiliza antes de realizar experimentos passo-scan (≥ 1 h). </li></ol> 4. Ajuste e sincronização do Laser Emocionante Para experiências na BR usar a segunda emissão harmônica de um Nd pulsado: YAG (λ = 532 nm) para acionar o photocycle. Para experimentos envolvendo ChR2, use uma excitação de λ = 450 nm, conforme previsto por uma oposcilador paramétrico tico (OPO) impulsionada pela terceira harmónica (λ = 355 nm) de um laser Nd: YAG. Certifique-se que o pulso de laser é suficientemente curto (~ 10 ns) para minimizar a foto-excitação secundária. Nota: A energia dos pulsos de laser deve ser tão constante quanto possível. Em nossa configuração, a intensidade do laser oscila ≤ 10% em torno da média, como foi confirmado pela medida um reflexo do laser por um fotodiodo conectado a um gravador de transientes e integrando a resposta (Figura 8). <ol><li> Par o laser para a amostra. Ajustar a densidade de energia do laser na amostra de 2-3 mJ / cm 2 por impulsos utilizando um medidor de potência. <ol><li> Para a configuração do ATR, use uma fibra óptica colocado em cima da tampa do ATR. </li><li> Para as experiências de transmissão, usar espelhos para trazer o laser para a amostra e, se necessário, para as lentes ou colimar ou divergir o feixe de raios laser para um diâmetro ligeiramente superior ao tamanho da amostra de filme. </li></ol></li><li> Sincronize o laser pulsar com a gravação de dados pelo espectrômetro. Use o Q-switch sync-out TTL pulso da eletrônica do laser Nd: YAG para acionar o espectrômetro. Defina a frequência de excitação do laser Nd: YAG a 10 Hz para a BR e 0,25 Hz para ChR2, respectivamente. </li><li> Usar um gerador de impulsos de atraso (PDG) para controlar a taxa de excitação de laser, se o ritmo de repetição do laser Nd: YAG não é facilmente ajustável. <ol><li> Ligue a lâmpada sync-para fora do laser Nd: YAG para a entrada de disparo externo PDG. A PDG fornece uma saída de ~ 190 ms de pulso TTL adiada para o Q-switch sync-in de entrada do laser Nd: YAG para acionar o de laser. Portão da PDG para aceitar um gatilho externo somente após certo período de tempo desde o último gatilho aceita (100 ms para a BR ou 4 segundos para ChR2). </li></ol></li></ol> 5. Preparações Passo-scan Time-resolvidos e configurações <ol><li> Coloque um passe filtro óptico baixo no caminho óptico. Para executar medições passo-scan resolvida no tempo na 1,800-850 centímetros -1 gama espectral, usar um filtro de cima opaco 1950 centímetros -1 e com boa transmissão (&gt; 50-80%) a seguir 1800 centímetros -1 (Figura 7). </li><li> Altere o detector de AC para o modo DC-coupled. Nota: Após este ajuste o sinal interferogram deixarão de oscilar em torno de zero, mas em torno de um valor conhecido como o nível DC. </li><li> Utilizar a maior abertura possível de feixe do aparelho para maior fluxo de fotões e, assim, uma melhor relação sinal-ruído, mas dentro dos limites de linearidade do detector. </li><li> Traga o nível DC do interferograma a zero e reajustar o ganho eletrônico para fazer melhor uso da faixa dinâmica do digital analógico convertido (ADC). Atingir compensada aplicando uma polarização de tensão para o sinal fornecido pelo pré-amplificador DC-nível. Nota: Esta opção é incluída em modernos espectrômetros FT-IR. Caso contrário, um dispositivo externo feito em casa pode ser utilizado em vez disso, colocada entre o pré-amplificador e o ADC 38. O cuidado é, em seguida,necessária para garantir que os componentes electrónicos de tal dispositivo são rápidos e linear. </li><li> Comece o menu passo-scan do espectrômetro FT-IR. Defina a largura de banda espectral alvo para a medição passo-scan para 1,975.3-0 cm -1. Ajuste a largura de banda espectral para uma fração do número de onda do laser de He-Ne (1/8 º lugar no presente caso), ligeiramente superior a de corte do filtro óptico. </li><li> Desative qualquer filtro eletrônico passa-alta para evitar distorções da cinética em momentos posteriores. Um filtro eletrônico passa-baixa pode ser benéfico quando a sua frequência de corte é da ordem ou acima da taxa de amostragem do ADC (aliasing reduz ruído). </li><li> Defina a resolução espectral e fase a 8 cm-1 e 64 cm-1, respectivamente. Defina o modo de aquisição interferogram para um único lado para a frente. Com essas opções um interferograma requer cerca de 500 pontos. </li><li> Defina a taxa de amostragem do ADC para o mais alto disponível no espectrômetro (por exemplo, 160 kHz, ou 6,25 ms). Defina o &quot;gatilho para a experiência&quot; para &quot;externo&quot;, ou seja, o laser é o mestre. Defina o número de pontos de dados linearmente espaçados a ser gravado: 7.000 para Br (até 42 ms) e 20.000 para ChR2 (até 125 ms). Nota: mais longas escalas de tempo pode ser coberta sem transbordar a memória ADC usando um quasi-logaritmicamente impulsos TTL externas espaçadas de tempo a partir de um gerador de ondas para accionar a aquisição de dados 38, ou utilizando dois gravadores de transientes paralelas como substitutos do ADC interno 31, 32. </li><li> Salve aproximadamente 100 pontos pré-gatilho como uma referência para o estado escuro da amostra. Nota: Na escala de tempo de milissegundos a qualidade dos dados é muitas vezes limitada por flutuações no espelho móvel. Aumentar os pontos de pré-disparador acima de 100 é, por conseguinte, não deverá melhorar significativamente a qualidade dos dados. </li><li> Defina o número de co-adições, ou seja, número de médias do fotorreação por espelho positião. Para a BR, use 20 colegas de adições (20 min de medir o tempo em 10 Hz taxa de excitação). Para ChR2 usar dois colegas de adições (70 mínimo de medir o tempo em 0,25 taxa de excitação Hz) </li><li> Repita a experiência de 10x para a BR, e 35x em três diferentes filmes de amostra para ChR2, ter finalmente ~ 200 colegas de adições por posição espelho. </li></ol> 6. Processamento de Dados <ol><li> Confirmar o estado da amostra por meio da comparação do espectro de IV diferença induzida pela luz a partir da primeira e da última medição. Considere descartar quaisquer medições, onde a intensidade do espectro de diferença cai abaixo de 60% da primeira dosagem. </li><li> Calcular a média dos interferogramas gravados. <ol><li> Usando o software OPUS do espectrômetro FTIR selecionar os interferogramas resolvido em tempo para a média e adicioná-los à &quot;Spectrum Calculator&quot;. </li><li> Clique &quot;=&quot; para se obter a média dos interferogramas. Nota: Quando a fase do interferogramaé constante durante a medição é indiferente a interferogramas média ou espectros de canal único. A fase constante pode ser confirmada através do cálculo e comparar o espectro de fase para a primeira e a última interferograma gravada. </li></ol></li><li> Realizar a transformada de Fourier dos interferogramas resolvida no tempo em média para obter espectros de canal único resolvida no tempo em média. <ol><li> Usando o mesmo software como no passo 6.2.1, selecione o interferograma resolvida no tempo em média e clique no ícone de &quot;interferograma de espectros&quot;. Use o método Mertz fase de correção, um fator zero preenchimento de 2 (dois pontos digitais por resolução instrumental), e uma função de apodização (por exemplo, triângulo, Blackmann-Harris 3-termos, etc.) </li><li> Clique em &quot;Convert&quot; inferior para transformar o interferograma resolvida no tempo em espectros resolvida no tempo. </li></ol></li><li> Exportar os dados de canal único resolvido em tempo como uma &quot;tabela de pontos de dados&quot; ou um &quot;, &quot;Arquivo usando o&quot; Matlab salvar como &quot;ícone no software OPUS. Continue o processamento de dados em um programa externo. <ol><li> Média, os espectros de canal único antes do laser, e converter os dados de canal único resolvido em tempo para espectros diferença absorção resolvida no tempo. </li><li> Calcular um vector para o desvio padrão do ruído esperada no espectro diferença, como uma função do número de onda (Figura 12), utilizando o desvio padrão do ruído, ε, e significam, S 0 (ν), dos espectros de canal único 100 precede o laser: ε / S 0 (ν). O valor de ε é estimado subtraindo espectros de canal único consecutivo e calculando o desvio padrão corrigido por √ 2. </li><li> Retirar regiões espectrais demasiado barulhentas para ser de uso (por exemplo, acima de 1.825 centímetros -1 e inferior a 850 cm-1). </li><li> Realize uma quase-logarítmica média (por exemplo, 20 espectros / hora década). O appearance de dados irá melhorar e o número de espectros serão reduzidos a partir de 10 ~ 4 a 10 ~ 2, sem qualquer perda significativa de informação (Figura 9). </li><li> Aumento de quatro vezes a densidade espectral de pontos (1 ponto / cm -1), utilizando interpolação Fourier (pós-zero enchimento). Nota: execute os passos 6.4.1 a 6.4.4 em um programa feito em casa correndo em MATLAB. </li></ol></li><li> Processar os espectros de tempo resolvido obtido (Figura 10A), com a decomposição do valor singular SVD, (Figura 13). Realizar a filtragem de dados por meio da reconstrução dos dados com um número limitado de componentes SVD significativas (Figura 10B). Nota: Realizamos SVD em MATLAB, utilizando a função &quot;svd&quot; built-in. </li></ol>

Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.

Um dos primeiros aspectos que deve ser considerado quando se realiza o passo de varrimento experiências FT-IR resolvidos no tempo de uma proteína é a preparação de uma amostra de uma forma adequada para a espectroscopia de infravermelho. A absorção de IV dos outros do que a proteína de interesse substâncias tem de ser reduzida, especialmente a partir de água. A abordagem mais comum é a evaporar a água da amostra a granel de modo a formar um filme. O filme pode ser re-hidratado, quer por adição de algumas gotas de uma solução aquosa ou por exposição da película a uma atmosfera de humidade controlada. Nós mostramos como em ambos os casos, é possível calcular o nível de hidratação obtido por meio de espectroscopia de absorção de infravermelho (ver Figura 3 e Figura 5). Embora os níveis de hidratação obtidos podem aparecer baixa em comparação com aqueles que em solução, eles são realmente perto aos encontrados em células vivas 70, fazendo com que o estudo dos filmes hidratados de proteínas funcionalmente relevantes. Além de água, eleTambém é importante conhecer e controlar a quantidade de lípidos ou detergentes na amostra. Ambos devem ser mantidos baixos o suficiente para ter um impacto na redução da espectroscopia de absorção de infravermelho, mas suficientemente alta para preservar a integridade e funcionalidade da proteína de interesse. Espectroscopia passo-scan resolvida no tempo só é diretamente aplicável às proteínas que mostram reações reversíveis que podem ser acionados reproduzível pela luz (mas ver o progresso em acoplamento passo-scan com troca rápida buffer) 71. No passo-scan a reação precisa ser reprodutível por pelo menos ~ 500x, o número mínimo para completar um interferograma cobrindo 1,800-850 cm -1 região em 8 cm-1 de resolução. Na prática, contudo, a média de dados adicional é geralmente necessária para empurrar o nível de ruído. Para 200 posição co-additions/mirror (10 5 repetições da reação) um espectro de 6.25 ms resolução diferença de absorção pode exibir uma sta ruídodesvio ndard entre 2 x 10 -5 e 2 x 10 -4 por um ATR e entre 5 x 10 -6 e 3 x 10 -5 para um experimento de transmissão (Figura 15). Graças à sua maior taxa de transferência de fótons, a transmissão permite a ~ 7 níveis de ruído mais baixos do ATR, um aspecto fundamental para o estudo com sucesso amostras que deram alterações de absorção fracas, como ChR2. Por outro lado, a ATR exige 5 a 25 vezes menos do que uma amostra de ensaio de transmissão. A aplicação de passo-scan espectroscopia FT-IR resolvida no tempo é problemático para as proteínas que exibem photocycles lentas: gravar um interferograma a passo-scan pode se tornar impraticável longo. Algumas soluções têm sido apresentadas para lidar com esses casos 72,73, muitas vezes baseados em usar várias amostras de troca para acelerar medidas à custa do aumento do consumo de proteínas e complexidade experimental 27,74. Em alguns casos, é possível contornar este problema por excitando a amostra antes da photocycle é estritamente concluída. Para ChR2, com photocycle exigindo após foto-excitação de 60 segundos para a recuperação de 99%, a recuperação em 4 seg já de 80% é 48. Com uma eficiência de excitação de 10% por pulso de laser, de 98% de moléculas CHR2 estão no estado escuro 4 seg após foto-excitação, tornando possível realizar experiências com uma taxa de repetição de laser de 0,25 Hz. O processamento de dados é um aspecto técnico final necessárias para atingir os melhores resultados possíveis. Média logarítmica reduz o ruído e, também importante, reduz o tamanho dos dados, sem distorções, uma característica essencial para a análise de dados posteriores através de decomposição em valores singulares ou montagem global. Média logarítmica é, no entanto, não é muito bem sucedido em média as flutuações no tempo-traços causados ​​por oscilações no espelho móvel e outras fontes de ruído 1 / f durante as medições (Figura 9). Estas flutuações na linha de basepode exceder o ruído no intervalo milissegundo e corrompido a qualidade dos dados. Decomposição de valor singular aproveita a redundância de dados para reduzir o ruído, e com algumas modificações 57 pode reduzir assim as flutuações na linha de base. Finalmente, a maior parte mais difícil e demorada de um passo de varrimento experimento de FT-IR de resolução por tempo corresponde à atribuição de bandas e a interpretação do espectro e cinética dos dados. Para bacteriorodopsina muitas das bandas que aparecem na diferença espectros IR foram atribuídos ou interpretados graças ao trabalho acumulado de muitos grupos de pesquisadores ao longo de décadas. Para uma proteína muito menos estudado, tais como canal-2, os experimentos IR resolvido em tempo acima apresentados têm de ser acompanhadas por experiências paralelas em mutantes sítio-dirigidas e combinados com informações de técnicas complementares para chegar a uma interpretação mecanicista 48.

Para elucidar completamente como proteínas desempenhar a sua função, é necessário medi-los como eles trabalham, ou seja, ao longo de um caminho de reação que muitas vezes envolve uma série de intermediários e estende várias ordens de tempo. As principais etapas de função da proteína ocorrem frequentemente no microssegundo para milissegundo intervalo de tempo 1, em particular backbone mudanças conformacionais e reações transferências de prótons em proteínas de membrana. Cristalografia de raios-X, sem dúvida, o pilar da biologia estrutural, proporciona estáticos (time-média) densidades de elétrons a partir de bem-difração cristais de proteínas, notoriamente difíceis de crescer com as proteínas da membrana 2. A modelo atômico 3D pode ser construído com base em densidades de elétrons, embora raramente incluindo a localização dos átomos de hidrogênio. Progresso notável na cristalografia de raios-X resolvida no tempo, quer confiando no Laue difracção 3 ou em femtosecond pulsos de raios-X 4, acrescenta a dimensão de tempo para a informação estrutural elevada eminerentes a cristalografia de raios X 5. Mas deixando de lado os desafios técnicos e analíticos, a rede cristalina pode prejudicar backbone mudanças conformacionais e alterar a dinâmica de proteínas, uma lacuna inevitável de métodos baseados em cristais de proteínas 5. Consequentemente, os aspectos dinâmicos de proteínas são ainda melhor coberto por métodos ópticos, como pioneira pelo flash fotólise 6,7, embora com a desvantagem geral da visão estrutural limitado. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), combina a resolução temporal de espectroscopia óptica com uma sensibilidade valioso para a estrutura da proteína, a última característica explorada em investigações estruturais e funcionais estáticos em inúmeras proteínas de membrana 8-11. Em particular, a diferença de espectroscopia FT-IR tem provado ser uma ferramenta ideal para estudar mudanças espectrais minúsculos como um trânsitos de proteína de um estado metaestável para outro 12-19. Studies sobre a dinâmica de proteínas, que não no nível única molécula 20,21, exigem um processo de disparo para a sincronização. A reacção é convenientemente iniciada rápido e não invasivo usando luz como gatilho, como foi feito no estudo de proteínas com fotoreações cíclicos. Um dos principais desafios associados a estudos resolvido em tempo é a realização de resolução de tempo suficiente, mantendo a boa resolução espectral e relação sinal-ruído adequado. É essencial também para cobrir uma gama suficientemente ampla espectral e temporal. Time-resolved passo de varrimento espectroscopia FT-IR sobressai em todos estes aspectos 22, com exemplos publicados cobrindo faixas espectrais tão largo quanto 3,900-850 cm -1 e dinâmica que se estende ~ 9 ordens de tempo, com até 3,5 cm1 espectral e resolução temporal de 30 ns 23-28. Espectrômetros de infravermelho com transformada de Fourier mostram redução de ruído e maior precisão fotométrica sobre os dispersivos 29. However, no modo de gravação rápida varredura normal espectrômetros FT-IR sofre de uma resolução de tempo limitado a ≥ 5-10 ms, como consequência do tempo mínimo do espelho móvel do interferômetro requer para completar uma varredura. Com a técnica de passo de varrimento, em contraste, a dependência do tempo do evento dinâmico é desacoplado da duração do varrimento do interferômetro. Resumidamente, os movimentos do espelho móvel em passos discretos, em vez de continuamente varredura para completar uma varredura. Em cada uma dessas etapas o (móvel) espelho é mantida fixa e uma passageira é gravado. Assim, a resolução de tempo é limitada pelo tempo de subida do mercúrio-cádmio-telureto (MCT) do detector, que é geralmente na gama de 10-100 ns. Na prática, a grande faixa dinâmica do interferograma (contendo um sinal intenso nos sinais centerburst e pequenas nas asas), requer a digitalização adequado um conversor analógico / digital (ADC) com até 16-24 bits, levando à amostragem taxas não superiores a ~ 200 kHz(5 ms) 30. Nanossegundo tempo resolução pode ser realizada por medição de apenas as mudanças no interferograma, para que um bit ADC 8-12 é suficiente 23,31-33. Aspectos técnicos 30,34,35 e aplicações 36-38 de tempo resolvido passo-scan foram discutidos em detalhe em outro lugar. A finalidade da contribuição actual é proporcionar um protocolo descrevendo os aspectos práticos do passo de varrimento espectroscopia de FT-IR de resolução por tempo nas proteínas de membrana fotossensíveis. Aqui, o desempenho da técnica é mostrado para dois métodos de amostragem: transmissão e de reflexão total atenuada (ATR). O uso de ATR permite trabalhar na presença de excesso de água, o que não só assegura condições de hidratação completa para a proteína, mas também permite o controlo agudo do pH da amostra e força iónica 49,50. Experimentos Passo-Scan são ilustrados em dois sistemas selecionados: bacteriorodopsina e canal-2. 39,40, tornando-se a proteína de membrana best-entendido até agora. Entre as várias técnicas empregadas para o estudo de funcionalidade bR espectroscopia FT-IV, indiscutivelmente, exercida uma das maiores impactos. Ou seja, a espectroscopia FT-IR tem sido a chave para resolver os grupos envolvidos na transferência de prótons através da membrana como contabilizados em outros lugares 13,41,51. Channelrodopsina (CDH) é o primeiro canal iônico fechado leve encontrado na natureza 42,43. Excitação da luz de ChR leva à abertura transitória de um canal de iões. Sua descoberta se estabeleceu o caminho para o desenvolvimento de optogenetics, onde os processos moleculares são controlados por luz 44,45. ChR pertence, como Br, para a família de rodopsinas microbianos mas, em contraste com Br, muito menos se conhece sobre o seu mecanismo funcional 52. ChR2 combina a sua função como um ion canal com a atividade de bombeamento de prótons 46,47. Recentemente, nós aplicamos passo-scan espectroscopia FT-IR resolvida no tempo para resolver reações de transferência de prótons intra-proteína ea dinâmica de proteínas backbone mudanças de conformação em ChR2 48.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">FT-IR spectrometer</td>
			<td style="width:248px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">Vertex 80v</td>
			<td>Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BaF2 windows</td>
			<td style="width:248px;">korth Kristalle</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">diamond ATR accesory</td>
			<td style="width:248px;">Smiths detection</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nine-reflection DuraDisk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">thermostatic bath</td>
			<td style="width:248px;">Julabo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">vibration decoupled table</td>
			<td style="width:248px;">OPTA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator</td>
			<td style="width:248px;">Continuum electro-Optics</td>
			<td style="width:119px;">Minilite&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Optical parametric oscillator (OPO)</td>
			<td style="width:248px;">OPTA</td>
			<td style="width:119px;">BBO-355-VIS/IR S/N 1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital delay/pulse generator&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:119px;">DG535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator</td>
			<td style="width:248px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:119px;">Quanta-Ray</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Various optical mirrors and lenses</td>
			<td style="width:248px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPUS 7.0&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software to control Vertex 80v spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab run time</td>
			<td style="width:248px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to run home-made executable programs to preprocess the data</td>
		</tr>
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proton transfer and protein conformation dynamics in photosensitive proteins by time-resolved step-scan fourier-transform infrared spectroscopy

Monitoramento da dinâmica de protonação e proteína backbone mudanças de conformação durante a função de uma proteína é um passo essencial para a compreensão de seu mecanismo. Protonação e conformacionais alterações afectam o padrão de vibração de cadeias laterais de aminoácidos e da ligação peptídica, respectivamente, ambas as quais podem ser sondados por infravermelho (IR), espectroscopia de diferença. Para proteínas cuja função pode ser repetitivamente e reprodutivelmente desencadeadas pela luz, é possível obter os espectros de diferença de infravermelhos com (sub) resolução microssegundo sobre uma ampla gama espectral usando a técnica de infravermelhos passo digitalizar transformada de Fourier. Com ~ 10 -10 2 3 repetições da fotorreacção, o número mínimo de completar uma varredura a resolução espectral razoável e largura de banda, o nível de ruído no espectro de diferença de absorção pode ser tão baixo como ~ 10 - 4, suficiente para seguir a cinética da mudanças de protonação de um único aminoácido. Baixaros níveis de ruído pode ser realizada por mais média de dados e / ou de processamento matemático. A quantidade de proteína necessária para resultados óptimos é entre 5-100 mg, dependendo da técnica de amostragem utilizada. Quanto requisitos adicionais, a proteína tem de ser primeiro concentradas num tampão de baixa força iónica e, em seguida, seca para formar um filme. O filme de proteína é hidratado antes da experiência, quer com pequenas gotas de água ou sob humidade atmosférica controlada. O nível de hidratação atingida (g de água / g de proteína) é medido a partir de um espectro de absorção de infravermelho. Para demonstrar a técnica, estudamos a photocycle do bacteriorodopsina da bomba de prótons de luz dirigido em seu ambiente membrana roxo nativo, e do light-gate canal iônico channelrodopsina-2 solubilizado em detergente.

A Figura 1 mostra um espectro de absorção de uma película seca de bR depositado sobre a superfície do diamante elemento de reflexão interna utilizados para a espectroscopia de ATR. Bandas características de vibrações da ligação peptídica (amida A, amida I e amida II) são claramente distinguíveis. A espessura aproximada da película seca pode ser estimada como ~ 1 mM, considerando a quantidade de proteína adicionada (18 mg) e a superfície da ATR (~ 0,2 centímetros 2), e tendo a densidade da proteína como ~ 1,4 g / cm 3, 58 e de lípidos como 1.0 g / cm 3, 59 e uma proporção de lípido / proteína de 1/3 (w / w) de púrpura membrana 60. O filme seco foi re-hidratado com um excesso de 4 M de NaCl, 100 mM de NaPi, pH 7,4 (Figura 3). A concentração de proteína e o nível de hidratação eficaz no volume sondada pela onda evanescente pode ser deduzida a partir do factor de escala necessária para remover digitalmente bandas de absorçãode água. O factor de escala óptima foi de 0,87, o que significa que, neste caso, o tampão ocupa 87% e a amostra de 13% do volume próximo da superfície. Tendo em conta a proteína e densidade lípido e a proporção de lípido / proteína em membranas roxas (ver acima), podemos deduzir uma concentração eficaz da proteína de 125 mg / ml no volume sondada pela onda evanescente. Pode-se deduzir a partir do nível de hidratação, que, neste caso específico, a espessura da película da amostra expandida ~ 6 vezes por re-hidratação, a partir de ~ 1 a ~ 6 um. Para um ângulo de incidência de 45 °, típica para o nosso e para a maioria dos regimes de ATR, a profundidade de penetração de campo evanescente (d p) para um filme de proteína hidratado varia entre 0,3 e 0,6 mM no 1,800-850 cm1 intervalo 61. Uma vez que o campo evanescente é quase insensível a amostra localizado duas vezes acima d p 61, infere-se que a quantidade de proteína utilizada na experiência ATR poderia ser, em princípio, reduzida 5x without qualquer perda significativa de sinal. Ao usar tampões de baixa força iónica da película expande-se mais, e a quantidade de proteína no volume sondado pelo campo evanescente é reduzida (Figura 2). A dependência exacta entre o inchaço de filmes e a força iónica do tampão irá depender, entre outros factores, da natureza dos lípidos. Por exemplo, uma película semelhante inchaço como aqui obtido por Br em membrana púrpura usando NaCl 4 M foi obtida para uma proteína de membrana reconstituído em polar E. lípidos coli utilizando apenas NaCl 0,1 M 62. Se a amostra ocupa menos do que 5% do volume de re-sondado considerar fazendo o passo de hidratação através de um tampão de maior força iónica. Filme inchaço após hidratação requer algum tempo para atingir a estabilização (Figura 4). Para Br em membrana roxo o processo é monoexponencial, com uma constante de tempo de 12 min: ele não leva mais de 30-60 min para ter um filme reidratadas estável <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A Figura 5 mostra um espectro de absorção no infravermelho de uma película de ChR2 hidratado obtido por transmissão. Aqui, a hidratação foi conseguida através da exposição do filme seco de uma atmosfera de humidade controlada fornecido por uma mistura de glicerol / água. O espectro pode ser decomposto em contribuições de água, detergente e proteína. Podemos estimar a quantidade de cada um deles usando extinção espectros coeficiente, dimensionada para caber o espectro experimental. Para a água que tomou o espectro do coeficiente de extinção da literatura 63, e por DM medimos a partir de uma solução de 100 mg / ml (Figura 6). Também utilizados os coeficientes de extinção para duas proteínas da membrana mitocondrial representativos: a transportadora ADP / ATP 64 e BR (Figura 7). O factor de escala indica uma massa de água e DM densidade de superfície de 260 g / cm 2, e 200 ug / cm2 na película, respectivamente. A absorção remanescente (Figure 5, linha vermelha) vem principalmente da proteína, estimada com uma densidade de superfície de 250 g / cm 2, usando o coeficiente de extinção da amida II a partir de duas proteínas de membrana diferentes (ver Figura 6). A proporção molar para a proteína / detergente / água foi calculada como sendo de 1/60/2000 utilizando uma massa molecular de 35 kDa, 480 Da, e 18 Da, respectivamente. Um gráfico 3D a partir do passo de varrimento experimento de FT-IR de resolução por tempo típico de Br é apresentado na Figura 10A, obtida pela ATR e envolvendo 200 min de aquisição de dados. Spectra pode ser extraído em horários específicos, por exemplo, quando o L, M e N intermediários do photocycle bR devem chegar a sua população mais alta (Figura 11). Suas características espectrais foram descritos extensivamente 13,41,65 e não será discutido aqui. Figura 12 mostra os traços de tempo em alguns números de onda selecionados. Ou seja, o aumento da cinética de 1762 cm -1 (t 1/2 ~ 60 ms) relatórios sobre a dinâmica do Asp85 protonação da base Schiff retina 66, e sua decadência a zero indica sua desprotonação após a recuperação do solo-sate 67. O aumento negativo da cinética de 1740 centímetros -1 (t 1/2 ~ 1 mseg) relata sobre a desprotonação da cadeia lateral de Asp96, o dador de protões para a base de Schiff 68. O decaimento da intensidade a zero relatórios sobre a sua reprotonação do citoplasma 67. A dinâmica das alterações de conformação da proteína podem ser sondados por alterações de absorção na região de amida I e II de amida, que atinge uma alteração máxima no ~ 3 mseg à temperatura ambiente 67,69. A aplicação de SVD para espectroscópicas problemas foi revisto antes 55,56. Resumidamente, SVD fatoriza os dados experimentais, dispostas numa matriz A, tal como: A = L S <strong&gt; V T. Esta fatoração pode ser modificado para ter em conta a dependência do ruído em número de onda e penalizar flutuações / desvios na linha de base 57. As colunas de U e V contêm espectros ortonormal e tempos traços vectores para cada componente SVD, respectivamente. S é uma matriz diagonal contendo os chamados valores singulares. Os componentes (resumo) espectro-temporais em U e V são apresentadas na diminuição relevância para descrever os dados experimentais, no sentido dos mínimos quadrados, quantificada pelo valor singular associado. Figura 13A mostra os valores singulares como uma função do número de componentes, e reproduz os primeiros oito colunas / componentes do U (espectros abstrato, Figura 13B) e V (abstrato de tempo traços, Figura 13C). O sinal é concentrado nos primeiros cinco componentes (tal como esperado para um photocycle contendo cinco estados intermediários), com componentes acima amplamente dominado pelo ruído aleatório e outras fontes de erros. Os dados experimentais foram reconstruídos usando apenas as cinco primeiras colunas de U e V, e os primeiros cinco colunas e linhas de S. Os dados reconstruídos por SVD representa a melhor aproximação de mínimos quadrados dos dados experimentais para uma matriz de classificação de cinco. Os dados reconstruídos mostra a melhoria da qualidade (Figura 10B). Ou seja, o ruído é, em grande parte reduzidos, bem como algumas flutuações quase imperceptíveis e desvios na linha de base (comuns em espectroscopia passo-scan resolvida no tempo 25). SVD processamento é especialmente vantajosa para melhorar a qualidade dos tempos traços experimentais no intervalo milissegundo (linhas vermelhas na Figura 12). Dados passo-scan resolvida no tempo para a photocycle ChR2 foram obtidos utilizando o protocolo descrito acima para transmissão<html> experimentos Sion (Figura 14a), envolvendo cerca de 120 horas de medições acumuladas. Os dados resolvido em tempo recolhidos pelo passo-scan estende de 6,25 ms a 125 ms. O photocycle de ChR2 requer cerca de 60 s para a recuperação total. A última parte do photocycle podem ser cobertos com rápida-scan FT-IR, e ambos passo-scan e conjuntos de dados de rápida varredura fundidos, tal como apresentado em outro lugar 48. As mudanças espectrais de ChR2 são ~ 10 vezes menores do que os obter da BR, tornando as medições mais desafiador. Especialmente, as oscilações na linha de base na escala de milissegundos se tornar evidente a essas mudanças de baixa absorção. Estes são devido a pequenas oscilações no espelho móvel na escala de tempo de milissegundos 25. As oscilações, juntamente com parte do ruído, pode ser, em grande parte removido por SVD, melhorar de forma significativa a aparência dos dados (Figura 14B). gura 1 &quot;fo: Content-width =&quot; 5 polegadas &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Espectro de absorção Figura 1. Da BR na membrana roxo seco sobre a superfície do diamante de um acessório ATR. Bandas de vibrações da ligação peptídica (amida I, II, e A) são indicados. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig2highres.jpg" width="500" /> Espectro Figura 2. Absorção de uma película de bR após rehidratação utilizando tampões de várias forças iónicas (diluições de 4 M de NaCl, 100 mM de Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4, pH 7,4). Observe o decréscimo da banda da amida II, ou seja, o aumento inchaço filme, com a diminuição da força iônica do tampão. (Insert) quantidade relativa de proteína próximo da superfície, quantificados pela intensidade da absorvância a 1541 centímetros -1 (amida II máximo) após subtractisobre a contribuição da absorção do buffer. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig3highres.jpg" width="500" /> Espectro de Absorção de Figura 3. De um filme de re-hidratados com tampão bR granel (4,3 M força iónica) e, após subtracção da contribuição de tampão. O factor de subtracção, 0,87, foi escolhido para eliminar a absorção de água forte entre 3,700-3,000 cm -1 e para obter uma linha de base plana entre 2,700-1,800 cm -1. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig4highres.jpg" width="500" /> Espectro de Absorção de Figura 4. De bR após re-hidratação com um tampão de 4,3 M de força iónica (absorção tampão foi subtraído para maior clareza, como na Figura 3). A inserção mostra a evolução da película de inchaço após rehydratde iões, seguindo-se a absorvância da proteína amida II em 1541 centímetros -1. Um ajuste de uma única exponencial indica uma constante de tempo para a película inchaço estabilização de 12 min. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig5highres.jpg" width="500" /> Espectro Figura 5. Absorção de um filme hidratado de ChR2 medido pela transmissão (linha azul). A extinção espectro coeficiente de água (linha laranja tracejada) e DM (linha tracejada cyan) foi escalado e subtraído (linha vermelha). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Reproduzido extinção de massa Os espectros de coeficiente de 25 ° C para a água no estado líquido (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) e por uma película hidratada da portadora / ATP a ADP (AAC) 64 . </s<html> trong&gt; O espectro do coeficiente de extinção de massa foi medida em solução para a MS (100 mg / ml), e em um filme hidratado para bR. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Transmitância do filtro óptico utilizado na varredura-scan medições FT-IR resolvido em tempo. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig8highres.jpg" width="500" /> . Figura 8 Desempenho dos pulsos de laser fornecidos pelo segundo harmônico (532 nm) de um Nd:. YAG Histograma da variação da energia relativa de 1.000 pulsos de laser, e apto para uma distribuição normal com um desvio padrão de 0,05. &quot;Width =&quot; 500 1622/51622fig9highres.jpg &quot;/&gt; Figura 9. Light-induziu alterações de absorção da BR em três números de onda representativos a tempo de espaçamento uniforme intervalos (verde, preto e linhas azuis) e após uma média de quase-logarítmica para ~ 20 pontos / década (linhas vermelhas). Observe a redução de ruído depois média logarítmica, revelando oscilação do tempo traça na gama dos milissegundos. <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig10highres.jpg" width="500" /> Representação em 3D Figura 10. De mudanças de absorvência de luz induzida pela BR gravadas por ATR a pH 7,4 (NaCl 4 M, NaPi 100 mM). A) Os dados brutos. B) Os dados reconstruídos com cinco componentes SVD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig10highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 11. FT-IR espectros de absorção da diferença photocycle bR em três momentos seleccionados, onde o L (12,5 ms), M (300 ms), e N (6 ms) são intermediários mais enriquecidos. <img alt="Figura 12" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig12highres.jpg" width="500" /> Figura 12. Transferência de prótons e proteína dinâmica de backbone no photocycle bR como resolvidos por passo-scan FT-IR diferença espectroscopia resolvida no tempo. As mudanças de absorbância em 1762 centímetros -1 relatórios sobre a dinâmica de protonação / desprotonação do Asp85, e em 1741 centimetro -1 na dinâmica desprotonação / reprotonação de Asp96 (incluindo alterações H-colagem antes de 300 ms). O prazo-traços em 1670 e 1,555 centímetros -1relatam mudanças em amida I e II vibrações, tanto sensíveis para a conformação do esqueleto do péptido. Os traços de volta correspondem aos dados brutos, e os vermelhos aos dados tratados com SVD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig12highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 13" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig13highres.jpg" width="500" /> Figura 13. Decomposição em valores singulares (SVD) dos passo-scan dados experimentais resolvido em tempo FT-IR da photocycle Br (ver Figura 10A). SVD foi realizada depois de pesar os dados experimentais tendo em conta a relação entre o desvio padrão do ruído em número de onda (Figura 15); combinada com o derivado 1 r para reduzir o peso estatístico da variação da linha de base, tal como descrito antes 57. A) &amp; #160; Lote dos valores singulares relativas dos 50 primeiros componentes (círculos pretos). Os primeiros cinco componentes são designados para sinalizar componentes (círculos vermelhos). O resto dos componentes do decaimento exponencial como esperado para barulho componentes (ver linha cinza tracejada). B) Primeiro oito espectros abstrato (U 1 a U 8). C) Primeiro oito abstratas temporais traços (V 1 a V 8). Os espectros de abstrato e de tempo traços atribuídos ao sinal são retratados em linhas vermelhas, e com linhas pretas de outra forma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig13highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 14" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig14highres.jpg" width="500" /> Representação Figura 14. 3D de IR alterações de absorção de luz induzida para ChR2 gravadas por passo-scanno modo de transmissão. Os dados passo-scan se estende até 125 ms, apenas cobrindo uma parte do photocycle. A) Os dados brutos. B) Os dados reconstruídos com cinco componentes SVD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig14highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 15" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig15highres.jpg" width="500" /> Figura 15 nível. Ruído estimado em um Diferença espectro FT-IR. Absorção em 6,25 ms temporais e 8 cm-1 de resolução espectral para um experimento envolvendo uma posição co-addition/mirror (500 fotoreações) ou ~ 200 posição co-addition/mirror (10 5 fotoreações). Os valores são apresentados para a reflexão total atenuada (ATR) ea configuração da transmissão.

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Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Transferência de prótons e Proteína Conformação Dynamics em fotossensíveis Proteínas por Time-resolvido Passo-scan-Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

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17.8K visualizações.  Freie Universität Berlin. Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Engenharia

Detection and Recovery of Palladium, Gold and Cobalt Metals from the Urban Mine Using Novel Sensors/Adsorbents Designated with Nanoscale Wagon-wheel-shaped Pores

Developing low-cost, efficient processes for recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals from urban mine remains a significant challenge in industrialized countries. Here, the development of optical mesosensors/adsorbents (MSAs) for efficient recognition and selective recovery of Pd(II), Au(III), and Co(II) from urban mine was achieved. A simple, general method for preparing MSAs based on using high-order mesoporous monolithic scaffolds was described. Hierarchical cubic Ia3d wagon-wheel-shaped MSAs were fabricated by anchoring chelating agents (colorants) into three-dimensional pores and micrometric particle surfaces of the mesoporous monolithic scaffolds. Findings show, for the first time, evidence of controlled optical recognition of Pd(II), Au(III), and Co(II) ions and a highly selective system for recovery of Pd(II) ions (up to ~95%) in ores and industrial wastes. Furthermore, the controlled assessment processes described herein involve evaluation of intrinsic properties (e.g., visual signal change, long-term stability, adsorption efficiency, extraordinary sensitivity, selectivity, and reusability); thus, expensive, sophisticated instruments are not required. Results show evidence that MSAs will attract worldwide attention as a promising technological means of recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals.

Because of the importance and extensive use of palladium, gold and cobalt metals in high-technology equipment, their recovery and recycling constitute an important industrial challenge. The metal recovery system described herein is a simple, low-cost means for the effective detection, removal, and recovery of these metals from the urban mine.

Detecção e recuperação de paládio, do ouro e cobalto Metais da Mina Urbana Usando novos sensores / adsorventes Designados com poros em nanoescala em forma de roda de carroça

Developing low-cost, efficient processes for recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals from urban mine remains a significant challenge in ...

Integration of Light Trapping Silver Nanostructures in Hydrogenated Microcrystalline Silicon Solar Cells by Transfer Printing

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly known as plasmonic effects, play an important role. Research in this field has, however, been impeded owing to the difficulty of fabricating devices containing the desired functional metal nanostructures. In order to provide a viable strategy to this issue, we herein show a transfer printing-based approach that allows the quick and low-cost integration of designed metal nanostructures with a variety of device architectures, including solar cells. Nanopillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS) stamps were fabricated from a commercially available nanohole plastic film as a master mold. On this nanopatterned PDMS stamps, Ag films were deposited, which were then transfer-printed onto block copolymer (binding layer)-coated hydrogenated microcrystalline Si (&#181;c-Si:H) surface to afford ordered Ag nanodisk structures. It was confirmed that the resulting Ag nanodisk-incorporated &#181;c-Si:H solar cells show higher performances compared to a cell without the transfer-printed Ag nanodisks, thanks to plasmonic light trapping effect derived from the Ag nanodisks. Because of the simplicity and versatility, further device application would also be feasible thorough this approach.

A viable transfer printing-based methodology to introduce plasmonic metal nanostructures in solar cells is described. Using nanopillar poly(dimethylsiloxane) stamps, an Ag-based ordered nanodisk array was integrated with standard hydrogenated microcrystalline Si solar cells, which led to improved device performances due to plasmonic light trapping.

Integração da luz Interceptação de prata Nanoestruturas em células solares de silício hidrogenado microcristalina por Transferência de impressão

One of the potential applications of metal nanostructures is light trapping in solar cells, where unique optical properties of nanosized metals, commonly ...

Characterizing Far-infrared Laser Emissions and the Measurement of Their Frequencies

The generation and subsequent measurement of far-infrared radiation has found numerous applications in high-resolution spectroscopy, radio astronomy, and Terahertz imaging. For about 45 years, the generation of coherent, far-infrared radiation has been accomplished using the optically pumped molecular laser. Once far-infrared laser radiation is detected, the frequencies of these laser emissions are measured using a three-laser heterodyne technique. With this technique, the unknown frequency from the optically pumped molecular laser is mixed with the difference frequency between two stabilized, infrared reference frequencies. These reference frequencies are generated by independent carbon dioxide lasers, each stabilized using the fluorescence signal from an external, low pressure reference cell. The resulting beat between the known and unknown laser frequencies is monitored by a metal-insulator-metal point contact diode detector whose output is observed on a spectrum analyzer. The beat frequency between these laser emissions is subsequently measured and combined with the known reference frequencies to extrapolate the unknown far-infrared laser frequency. The resulting one-sigma fractional uncertainty for laser frequencies measured with this technique is &#177; 5 parts in 107. Accurately determining the frequency of far-infrared laser emissions is critical as they are often used as a reference for other measurements, as in the high-resolution spectroscopic investigations of free radicals using laser magnetic resonance. As part of this investigation, difluoromethane, CH2F2, was used as the far-infrared laser medium. In all, eight far-infrared laser frequencies were measured for the first time with frequencies ranging from 0.359 to 1.273 THz. Three of these laser emissions were discovered during this investigation and are reported with their optimal operating pressure, polarization with respect to the CO2 pump laser, and strength.

We describe the generation of far-infrared radiation using an optically pumped molecular laser along with the measurement of their frequencies with heterodyne techniques. The experimental system and techniques are demonstrated using difluoromethane (CH2F2) as the laser medium whose results include three new laser emissions and eight measured laser frequencies.

A caracterização das emissões laser Far-infrared e da medição de suas frequências

The generation and subsequent measurement of far-infrared radiation has found numerous applications in high-resolution spectroscopy, radio astronomy, and ...

Emission Spectroscopic Boundary Layer Investigation during Ablative Material Testing in Plasmatron

Ablative Thermal Protection Systems (TPS) allowed the first humans to safely return to Earth from the moon and are still considered as the only solution for future high-speed reentry missions. But despite the advancements made since Apollo, heat flux prediction remains an imperfect science and engineers resort to safety factors to determine the TPS thickness. This goes at the expense of embarked payload, hampering, for example, sample return missions. 
Ground testing in plasma wind-tunnels is currently the only affordable possibility for both material qualification and validation of material response codes. The subsonic 1.2MW Inductively Coupled Plasmatron facility at the von Karman Institute for Fluid Dynamics is able to reproduce a wide range of reentry environments. This protocol describes a procedure for the study of the gas/surface interaction on ablative materials in high enthalpy flows and presents sample results of a non-pyrolyzing, ablating carbon fiber precursor. With this publication, the authors envisage the definition of a standard procedure, facilitating comparison with other laboratories and contributing to ongoing efforts to improve heat shield reliability and reduce design uncertainties.
The described core techniques are non-intrusive methods to track the material recession with a high-speed camera along with the chemistry in the reactive boundary layer, probed by emission spectroscopy. Although optical emission spectroscopy is limited to line-of-sight measurements and is further constrained to electronically excited atoms and molecules, its simplicity and broad applicability still make it the technique of choice for analysis of the reactive boundary layer. Recession of the ablating sample further requires that the distance of the measurement location with respect to the surface is known at all times during the experiment. Calibration of the optical system of the applied three spectrometers allowed quantitative comparison. At the fiber scale, results from a post-test microscopy analysis are presented.

Development of new ablative materials and their numerical modeling requires extensive experimental investigation. This protocol describes procedures for material response characterization in plasma flows with the core techniques being non-intrusive methods to track the material recession along with the chemistry in the reactive boundary layer by emission spectroscopy.

Emissão espectroscópica Boundary Investigation Camada durante ablativo Teste de material em Plasmatron

Ablative Thermal Protection Systems (TPS) allowed the first humans to safely return to Earth from the moon and are still considered as the only solution ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted researchers&#39; attention in many fields. Most of the studies focused on macroscopic LCE structures (films, fibers) and their miniaturization is still in its infancy. Recently developed lithography techniques, e.g., mask exposure and replica molding, only allow for creating 2D structures on LCE thin films. Direct laser writing (DLW) opens access to truly 3D fabrication in the microscopic scale. However, controlling the actuation topology and dynamics at the same length scale remains a challenge.
In this paper we report on a method to control the liquid crystal (LC) molecular alignment in the LCE microstructures of arbitrary three-dimensional shape. This was made possible by a combination of direct laser writing for both the LCE structures as well as for micrograting patterns inducing local LC alignment. Several types of grating patterns were used to introduce different LC alignments, which can be subsequently patterned into the LCE structures. This protocol allows one to obtain LCE microstructures with engineered alignments able to perform multiple opto-mechanical actuation, thus being capable of multiple functionalities. Applications can be foreseen in the fields of tunable photonics, micro-robotics, lab-on-chip technology and others.

Free-form Light Actuators &amp;#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Here, we fabricate 3D polymeric micro/nano structures in which both the shape and the molecular alignment can be engineered with nanometer scale accuracy by the use of direct laser writing. Light induced deformation of several types of liquid crystalline elastomer microstructures can be controlled in the microscopic scale.

Atuadores de luz de forma livre - Fabricação e Controle de atuação em escala microscópica

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

The Evolution of Silica Nanoparticle-polyester Coatings on Surfaces Exposed to Sunlight

Corrosion of metallic surfaces is prevalent in the environment and is of great concern in many areas, including the military, transport, aviation, building and food industries, amongst others. Polyester and coatings containing both polyester and silica nanoparticles (SiO2NPs) have been widely used to protect steel substrata from corrosion. In this study, we utilized X-ray photoelectron spectroscopy, attenuated total reflection infrared micro-spectroscopy, water contact angle measurements, optical profiling and atomic force microscopy to provide an insight into how exposure to sunlight can cause changes in the micro- and nanoscale integrity of the coatings. No significant change in surface micro-topography was detected using optical profilometry, however, statistically significant nanoscale changes to the surface were detected using atomic force microscopy. Analysis of the X-ray photoelectron spectroscopy and attenuated total reflection infrared micro-spectroscopy data revealed that degradation of the ester groups had occurred through exposure to ultraviolet light to form COO&#903;, -H2C&#903;, -O&#903;, -CO&#903; radicals. During the degradation process, CO and CO2 were also produced.

Two types of surfaces, polyester-coated steel and polyester coated with a layer of silica nanoparticles, were studied. Both surfaces were exposed to sunlight, which was found to cause substantial changes in the chemistry and nanoscale topography of the surface.

A evolução de sílica Coatings nanopartículas-poliéster em superfícies expostas à luz solar

Corrosion of metallic surfaces is prevalent in the environment and is of great concern in many areas, including the military, transport, aviation, ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials such as organo-lead halide perovskites is presented. The perovskite film thickness and absorption coefficient are initially characterized by profilometry and UV-VIS absorption spectroscopy. Calibration of both laser power and cavity sensitivity is described in detail. A protocol for performing Flash-photolysis Time Resolved Microwave Conductivity (TRMC) experiments, a non-contact method of determining the conductivity of a material, is presented. A process for identifying the real and imaginary components of the complex conductivity by performing TRMC as a function of microwave frequency is given. Charge carrier dynamics are determined under different excitation regimes (including both power and wavelength). Techniques for distinguishing between direct and trap-mediated decay processes are presented and discussed. Results are modelled and interpreted with reference to a general kinetic model of photoinduced charge carriers in a semiconductor. The techniques described are applicable to a wide range of optoelectronic materials, including organic and inorganic photovoltaic materials, nanoparticles, and conducting/semiconducting thin films.

A Time Resolved Microwave Conductivity technique for investigating direct and trap-mediated recombination dynamics and determining carrier mobilities of thin film semiconductors is presented here.

Recombinação Dynamics em Thin-film materiais fotovoltaicos via Condutividade Microondas resolvida no tempo

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...

Measurements of Soil Carbon by Neutron-Gamma Analysis in Static and Scanning Modes

The herein described application of the inelastic neutron scattering (INS) method for soil carbon analysis is based on the registration and analysis of gamma rays created when neutrons interact with soil elements. The main parts of the INS system are a pulsed neutron generator, NaI(Tl) gamma detectors, split electronics to separate gamma spectra due to INS and thermo-neutron capture (TNC) processes, and software for gamma spectra acquisition and data processing. This method has several advantages over other methods in that it is a non-destructive in situ method that measures the average carbon content in large soil volumes, is negligibly impacted by local sharp changes in soil carbon, and can be used in stationary or scanning modes. The result of the INS method is the carbon content from a site with a footprint of ~2.5 - 3 m2 in the stationary regime, or the average carbon content of the traversed area in the scanning regime. The measurement range of the current INS system is &#62;1.5 carbon weight % (standard deviation &#177; 0.3 w%) in the upper 10 cm soil layer for a 1 hmeasurement.

Here, we present the protocol for in situ measurement of soil carbon using the neutron-gamma technique for single point measurements (static mode) or field averages (scanning mode). We also describe system construction and elaborate data treatment procedures.

Medições de carbono no solo por nêutrons-Gamma análise estática e modos de digitalização

The herein described application of the inelastic neutron scattering (INS) method for soil carbon analysis is based on the registration and analysis of ...

Quantitative Analysis of Vacuum Induction Melting by Laser-induced Breakdown Spectroscopy

Vacuum induction melting is a popular method for refining high purity metal and alloys. Traditionally, standard process control in metallurgy involves several steps, include drawing samples, cooling, cutting, transport to the laboratory, and analysis. The whole analysis process requires more than 30 minutes, which hinders on-line process control. Laser-induced breakdown spectroscopy is an excellent on-line analysis method that can satisfy the requirements of vacuum induction melting because it is fast and noncontact and does not require sample preparation. The experimental facility uses a lamp-pumped Q-switched laser to ablate melted liquid steel with an output energy of 80 mJ, a frequency of 5 Hz, a FWHM pulse width of 20 ns, and a working wavelength of 1,064 nm. A multi-channel linear charge coupled device (CCD) spectrometer is used to measure the emission spectrum in real time, with a spectral range from 190 to 600 nm and a resolution of 0.06 nm at a wavelength of 200 nm. The protocol includes several steps: standard alloy sample preparation and an ingredient test, smelting of standard samples and determination of the laser breakdown spectrum, and construction of the elements concentration quantitative analysis curve of each element. To realize the concentration analysis of unknown samples, the spectrum of a sample also needs to be measured and disposed with the same process. The composition of all main elements in the melted alloy can be quantitatively analyzed with an internal standard method. The calibration curve shows that the limit of detection of most metal elements ranges from 20-250 ppm. The concentration of elements, such as Ti, Mo, Nb, V, and Cu, can be lower than 100 ppm, and the concentrations of Cr, Al, Co, Fe, Mn, C, and Si range from 100-200 ppm. The R2 of some calibration curves can exceed 0.94.

During vacuum induction melting, laser-induced breakdown spectroscopy is used to perform real-time quantitative analysis of the main-ingredient elements of a molten alloy.

Análise quantitativa de indução a vácuo de fusão por espectroscopia de degradação induzida por laser

Vacuum induction melting is a popular method for refining high purity metal and alloys. Traditionally, standard process control in metallurgy involves ...