O protocolo a seguir apresenta como configurar um experimento Neutron Spin Echo para medir a função de dispersão intermediária e investigar a dinâmica das proteínas em solução. A principal vantagem da Espectroscopia De Nêutrons Spin Echo é sua capacidade de olhar para o rearranjo de domínios proteicos e subdiversos no pico para escala de tempo nanossegundo; que é a gama de câmeras lentas em proteínas em seu ambiente quase natural, e na solução de proteínas lotadas. Neutron Spin Echo também é sensível à configuração isotópica, o que permite estudos muito específicos e direcionados usando correspondência de contraste.
Insights sobre a dinâmica do domínio proteico é uma parte importante da pesquisa biofísica na difícil tarefa contínua de retransmitir os movimentos de domínio das proteínas com sua funcionalidade biológica. O protocolo aqui apresentado pode ser geralmente aplicado a qualquer medida de Neutron Spin Echo realizada no espectrômetro SNS-NSE, independentemente de sua escolha de amostras, se permanecer dentro do reino dos materiais de matéria macia. Para configurar o experimento comece selecionando a espessura do carregamento da amostra celular, com base na concentração da amostra de proteína, na temperatura necessária para a medição e na quantidade de solução disponível.
Limpe a célula com detergente de prato livre de fosfato, água deionizada e 70% diethanol. Seque a célula no forno de convecção. Carregue quatro mililitros de solução proteica na célula, e feche com tampas.
Use filme de cera ou qualquer selante para selar as células da amostra. Carregue quatro mililitros de tampão de diálise em um recipiente idêntico à amostra de proteína e selo. Transportar amostras para a linha de vigas.
Feche o obturador e entre na área da caverna do gabinete do espectrômetro. Monte a célula amostra no suporte da amostra de alumínio apertando os parafusos e as placas de retenção. Monte a amostra de grafite e a amostra de óxido de alumínio carregada em um recipiente idêntico como a amostra de proteína.
Coloque o mesmo suporte deslizando-o suavemente para a lata do sistema de força de temperatura. Feche a tampa do sistema de força de temperatura e defina a temperatura ao valor desejado acessando a tela interativa do sistema de força de temperatura. Monte a câmera de nêutrons para o alinhamento das amostras ao feixe.
Para coletar os dados da Neutron Spin Echo Spectroscopy, alinhe a amostra no feixe de nêutrons usando a câmera de nêutrons e as quatro aberturas de amostra independentes. Abra o software de coleta de dados Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy e colete estatísticas de amostra executando varreduras de defracção para os ângulos de dispersão desejados e comprimento de onda. Configure os parâmetros de medição com base nas estatísticas coletadas para cada amostra, editando as macros de medição fornecidas pelo Cientista de Instrumentos Auxiliares.
Comece a digitalizar digitando o nome do protocolo no prompter de comando e adquirindo ecos para a amostra. Faça login no cluster neutron Sciences Remote Analysis com as credenciais do usuário ORNL e pressione o botão de sessão de lançamento. No diretório do usuário, abra uma janela de terminal e digite o comando de configuração de software.
Em seguida, digite o comando do ambiente. Crie uma pasta para a redução de dados no diretório inicial e copie os scripts e macros fornecidos do diretório compartilhado. Editar, renomear e salvar a macro de redução fornecida em conformidade.
Digite drspine"no prompter de comando e pressione Enter para iniciar o ambiente de redução de software. Digite o nome da macro de redução no prompter de comando dentro do ambiente de software e pressione Enter. Edite o script Python fornecido pelo Assistente cientista de instrumentos com os nomes dos dados de arquivos reduzidos.
Edite a função para caber na biblioteca fornecida. Digite o nome do script editado no prompter de comando e pressione Enter para ler, encaixar e plotar dados NSE reduzidos. A função de dispersão intermediária medida pela NSE para proteínas IgG e MBP mostra um desvio claro de um simples processo de relaxamento semelhante à difusão na curta escala de tempo de quatro anos, indicando a acessibilidade da dinâmica interna proteica pela NSE, e a necessidade de um modelo mais complexo para descrever os processos dinâmicos observados.
Os resultados dos cálculos de funções de dispersão intermediárias montados pela modelagem atômica de ambas as proteínas utilizando modelos desenvolvidos foram em excelente concordância com os dados experimentais da NSE. Os resultados comprovaram que dinâmicas mais lentas observadas em tempos mais longos podem ser atribuídas aos processos globais de difusão translacional e rotacional, enquanto a dinâmica observada nas escalas de curto prazo pode ser atribuída à dinâmica dos domínios proteicos. Uma coisa importante a se lembrar é a necessidade de amostras bem preparadas e limpas para as medições nse.
Uma boa amostra para um Spin Echo tem uma razão de lançamento superior a três, que é a razão entre dispersão coerente e incoerente da amostra. Também durante a preparação da amostra e o carregamento de amostras nas células NSE, a solução amostral deve ser mantida segura e livre de qualquer contaminação cruzada química ou biológica. Por razões de segurança, a entrada no gabinete do espectrômetro só deve ser tentada após o fechamento do obturador, e um tempo adicional de meia hora foi permitido para o resfriamento da radiação do gabinete.
A dispersão de nêutrons de ângulo pequeno é recomendada para avaliar a forma e a estrutura das proteínas em uma solução concentrada. Pode ser feito antes ou em paralelo com o experimento NSE. Métodos adicionais como dispersão dinâmica de luz e medidas de viscosidade fornecem informações sobre a difusão translacional e a interação hidrodinâmica dentro da solução de proteína concentrada, e também são recomendados.
