A função mitocondrial é fundamental para a auto-renovação das células-tronco hematopoiéticas. A atividade mitocondrial é um refletor do potencial da membrana mitocondrial interna, que pode ser medido por TMRM, um corante cationic fluorescente celular. As bombas de efflux xenobióticos são altamente ativas no HSC e causam extrusão TMRM.
A principal vantagem deste protocolo, é a correção desse efeito, utilizando o Verapamil, um inibidor das bombas efflux. Comece isolando a medula óssea dos fêmures do rato. Use um par de fórceps e uma tesoura afiada para cortar as duas patas posteriores.
Em seguida, faça um pequeno corte na pele ventral do mouse, e estique-o. Extrair o fêmur e a tíbia, tomando cuidado para não desalojar as cabeças do fêmur, e coloque os ossos em uma placa de seis poços, cheia de 1,5 mililitros de tampão de coloração. Remova os músculos dos ossos e corte as extremidades dos ossos, permitindo que a medula óssea saia.
Coloque os ossos limpos em novos poços, com 1,5 mililitros de tampão de coloração. Em seguida, limpe a medula óssea com uma seringa de três mililitros e uma agulha calibre 25, até que o osso fique branco. Colete todas as células em um tubo de 1,5 mililitro, e centrífuga-as por cinco minutos a 180 vezes G, depois descarte o supernascedor.
Resuspenque cuidadosamente a pelota em 300 microliters de tampão de gelo ACK e coloque as células no gelo por um minuto. Em seguida, desative imediatamente a lise adicionando um mililitro de tampão de coloração. Centrifugar as células por cinco minutos a 180 vezes G.Resuspend a pelota celular, que deve parecer branca, em um mililitro de tampão de coloração.
Filtre as células usando uma tampa de coador de celular, com uma malha de nylon de 35 micrômetros, para obter células mononucleares. Comece preparando o coquetel de linhagem, e anticorpos conjugados fluoróvias, de acordo com as instruções do manuscrito. Mantenha os anticorpos no gelo, e protegido da luz.
Em seguida, centrifufique a amostra por cinco minutos a 180 vezes G, e descarte o supernaspeso. Adicione 400 microliters do coquetel de linhagem, e quatro microliters de anticorpos biotinilados CD135 à pelota celular, e vórtice da mistura. Em seguida, incubar-lo no gelo por 30 minutos.
Após a incubação, lave a amostra adicionando três mililitros de tampão de coloração, girando-a por cinco minutos a 180 vezes G, e descartando o supernatante. Em seguida, adicione 400 microliters de solução de anticorpos, e vórtice da mistura. Incubar no gelo por mais 30 minutos e repetir a lavagem com o tampão de coloração.
Para preparar a solução de coloração TMRM, adicione 2,2 microliters de solução de estoque TMRM e 1,1 microliters de Verapamil, a 1,1 mililitros de meio de cultura hematopoiética livre de soro, com trombopoietina e fator célula-tronco. Resuspend a medula óssea em um mililitro da solução de coloração TMRM, vórtice rapidamente, e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Filtre a amostra usando uma tampa de filtro celular, com uma malha de nylon de 35 micrômetros, para evitar entupir o cítmetro de fluxo.
Em seguida, adicione um microliter de DAPI e prossiga com a citometria de fluxo. Execute a amostra de medula óssea, e adquira pelo menos um milhão de eventos. Em seguida, exiba as células mononucleares de medula óssea ao vivo em um gráfico para azul pacífico, para identificar frações CD135 Lin-negativo e Lin-positive.
Plote a fração Lin-negativa para APC/Cy7 versus PE/Cy7 para identificar a fração progenitor multipotente ou MPP. Em seguida, plote a fração MPP para APC versus PerCP/Cy5.5, para identificar a célula-tronco hematopoiética ou a fração HSC. Exibir a fração HSC para FITC, ou CD34, para dividi-la em frações HSC negativas cd34 e CD34 positivas.
Finalmente adquirir a intensidade TMRM em cada população. Para garantir que a coloração TMRM funcionasse corretamente, adicione um microliter de FCCP à amostra, para uma concentração final de um mililitro, e incuba-o a 37 graus Celsius por cinco minutos. Então adquira um milhão de eventos.
Após a adição do FCCP, a intensidade do TMRM deve ser drasticamente aumentada. Este protocolo tem sido usado com sucesso para quantificar o potencial da membrana mitocondrial em várias populações celulares, com corante TMRM. Foi demonstrado que a presença de PBS e FBS no meio de cultura afeta a intensidade do sinal TMRM.
Por isso, é importante realizar a coloração TMRM em meio de expansão sem soro. Células-tronco hematopoiéticas expressam altos níveis de atividade de bombas de efflux xenobióticos que extrudam corante TMRM. Assim, os perfis TMRM também variam na presença de Verapamil ou Ciclosporin H, que bloqueiam as bombas.
Para verificar a precisão da coloração TMRM, o FCCP pode ser despolarizar as mitocôndrias e reduzir a intensidade do TMRM. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar HSC com um corante potencial de membrana mitocondrial diferente, incluindo TMRE ou JC-1. Assim como outros corantes mitocondriais, como MitoTracker ou MitoSOX.
As questões críticas herdadas pela diferente atividade das bombas de efflux entre a população de medula óssea foram apontadas recentemente. Portanto, este protocolo visa reduzir a discrepância entre os achados anteriores.
