We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Declaração de Ética Animal: Os protocolos descritos neste manuscrito seguir as orientações de cuidados de animais estabelecidos pela The University of Auckland e da Universidade de Stanford. P7 crias de ratos foram sacrificados por decapitação rápida. Dissecação do hipocampo é então realizada tal como descrito imediatamente abaixo. 1. Organotípicas Hippocampal Fatia Cultura <ol><li> Preparação <ol><li> Prepare Médio dissecção (usado somente para dissecar o cérebro). Combinar 200 mL de Meio Essencial Mínimo, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 5 ml de solução tampão de HEPES, 2 ml de solução de 1 M de Tris (pH 7,2), e filtra-se esterilizar com filtro de 0,22 nm . Realizar dissecção do hipocampo em meio dissecção gelada. </li><li> Arrefecer o meio de dissecção. Coloque a mídia dissecção no congelador cerca de 1 hora antes do início da dissecção até que o líquido é muito frio. Não permita que grande cr geloystals a se formar. Guarde em gelo até serem necessárias. </li><li> Prepare meio de cultura (usado para tudo, exceto dissecação de hipocampo). Combinar 100 mL de Meio Essencial Mínimo (concentração 1x, líquido) w / sais de Hank, w / L-glutamina, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (líquido, 10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 2,5 mL de HEPES 1 M de tampão solução, 50 ml de solução salina equilibrada de Hank, 50 ml de soro de cavalo (definido, inactivado pelo calor), e filtro de esterilização com filtro de 0,22 um. </li><li> Prepare as placas de cultura. Colocar 1 ml de meio de cultura por prato de cultura de 35 mm, e adicionar um inserto de membrana para cada prato. Coloque até sete desses pratos em um 150 milímetros placa de Petri (adiante designado por um &quot;prato&quot;). Colocar a placa num incubador de CO2 durante pelo menos uma hora antes de começar a dissecção de modo a que o meio de cultura nas placas alcança a temperatura apropriada e pH. </li></ol></li><li> Dissecção do hipocampo de filhotes de ratos no dia pós-natal 7 (P7) <ol><li> Pré-esterilizar todas as ferramentas de dissecção com luz UV antes do procedimento. </li><li> Após a decapitação rápida, retire o cérebro e lugar em meio refrigerado em um prato, em seguida, removê-lo para um pedaço de papel de filtro umedecido para dissecação. Provoque o córtex longe do mesencéfalo usando contundentes espátulas plásticas lisas revestidas de miniatura, expondo o hipocampo. Corte o fundo de saco, e depois trabalhar suavemente a espátula por baixo do hipocampo para lançá-lo para fora (Figura 1A). NOTA: Sucesso culturas fatia pode ser preparado usando animais até P10. </li><li> Aparar o hipocampo isolado do resto do cérebro. Transfira o hipocampo em um novo prato contendo mídia dissecção refrigerados usando um pincel macio umedecido (por exemplo, branco sable # 4). </li><li> Limpar o lado de baixo (isto é, o lado mais liso) do hipocampo do plexo coróide durante a dissecção, uma vez que estes tecidos, meninge tipo esponjoso tornam difícil separar do hipocampoFatias de um outro mais tarde. NOTA: Deixe esses tecidos no lugar, se eles não podem ser esmiuçadas fora suavemente. </li><li> Executa todo o esvaziamento tão rapidamente quanto possível, sem danificar o hipocampo. NOTA: A dissecção cuidadosa é mais importante do que um rápido, desde que as condições experimentais são refrigerados. Corte o hipocampo de ratos três simultaneamente. A fatia de saúde não é afectada, enquanto que o tempo total desde o início quando as fatias plaqueadas entrar na incubadora é menos de 30 min. </li></ol></li><li> Cortando <ol><li> Corte os hipocampos transversalmente em 400 um secções transversais usando um cortador de tecido manual. O método através do qual a operação de corte é realizada não é importante, contanto que não é excessivamente prejudicial para o tecido e produz fatias de espessura consistente com uma arquitectura laminar prontamente disponíveis (isto é, corno de Ammon é facilmente visto ser preservada no tecido). </li><li> Deite o hipocampo no palco do tecidotriturador no topo de uma espessura tripla de papel de filtro # 2. O hipocampo é cortado totalmente sem remover quaisquer fatias individualmente (ou seja, todo o hipocampo é deixado na cena do helicóptero até que todos foram feitos cortes, mas sim como pães cortados neste momento; Figura 1B). </li><li> Transferir o hipocampo em meio de dissecção usando um pincel macio colocado ao lado de cada hipocampo (branco de marta # 2). Com cuidado, empurre cada hipocampo para o lado para quebrar a aderência entre o hipocampo eo papel de filtro subjacente. Role a escova debaixo de cada hipocampo para buscá-lo para fora do palco. Coloque todos os hipocampos no mesmo 35 milímetros placa de Petri de meio de dissecção gelada. Separe o hipocampo em fatias individuais agitando manualmente o prato em alternar movimentos no sentido horário e anti-horário. </li><li> Inspecionar as fatias sob um microscópio de dissecação e descartar qualquer que estiverem danificados, pequeno, ou que não possuem células claramente visívelcamadas do corpo. NOTA: É, muitas vezes, ser o caso de que nem todas as fatias são separados com sucesso a partir de seus irmãos desta maneira. Neste caso, eles podem ser separados por transformá-los na borda e estimulando-as com as pontas dos pinça fina. &quot;Good&quot; fatias são então transferidos para uma outra placa de Petri contendo meio de dissecção limpo gelada usando um cortadas e polidas ao fogo pipeta de Pasteur (Figuras 1C-E). </li></ol></li><li> Armazenamento <ol><li> Coloque as fatias individuais para as inserções de filtro de membrana. Com uma pipeta Pasteur cortado e polido fogo para dar um furo maior, transferir individualmente fatias para as inserções de cultura. NOTA: O tamanho do orifício criado no corte e polimento da pipeta-fogo é importante. Muito pequena e as fatias não será fácil deixar a pipeta para a membrana. Fluido muito grande e em excesso é colocada sobre a superfície da membrana juntamente com a fatia. O melhor diâmetro do furo é tipicamente cerca de metade do diâmetroetro do cano da pipeta. Quando o corte, este diâmetro pode ser escolhido através do corte no local adequado sobre o cone da pipeta. </li><li> Fatia de Transferência <ol><li> Encha a pipeta com o meio em primeiro lugar, e em seguida, aspirar uma única fatia com forças de sucção pequenos. Isto mantém a fatia perto da abertura da pipeta e previne muita expulsão na forma de inserção para colocar a fatia. </li><li> Aplique uma leve pressão sobre a lâmpada para formar uma pequena gota de suspensão, permitir que a fatia de resolver em que gota, e depois toque em que gotículas à membrana e que a fatia &quot;queda&quot; para a membrana. Geralmente três fatias são colocadas em cada pastilha de membrana. NOTA: Se a gota de fluido é muito grande, as gotículas de as três fatias tendem a fundir sobre a superfície da membrana, e, assim, as fatias de recolher tudo para o centro da membrana, tornando-se mais difícil separá-los para a gravação electrofisiológico mais tarde. </li></ol></li><li> Remov Fluidal <ol><li> Aspirar todo o meio em excesso do topo da placa de inserção de cultura para todas as fatias em que o prato (3 fatias por pastilha = 21 fatias por placa), de modo que as fatias não são imersas em ou rodeado por um conjunto de meio de dissecção. </li><li> Realizar isso é com um sem cortes, mas fogo-polido pipeta Pasteur. Permitir a fatia para se estabelecer e aderir à membrana por um minuto antes de pipetar. Tome cuidado para não sugar a fatia para dentro da pipeta. Realizar remoção de fluido para as inserções que são banhados em primeiro lugar, para que haja tempo suficiente para que as fatias de resolver. </li></ol></li><li> Fatia de armazenamento <ol><li> Culturas fatia da loja em um 5,0% de CO 2 incubadora a 37 ° C. Observe o arranjo final das culturas na Figura 1E. As fatias individuais repousar sobre uma placa de cultura de inserção que tem uma membrana porosa de uma parte inferior, e esta inserção se encaixa dentro de um prato de Petri cheio com uma pequena quantidade de meio; por este meio, as fatias não está imerso no medio, mas têm acesso a ele somente através da membrana na parte inferior da placa de cultura de inserção. </li><li> Opcionalmente, as fatias pode remover para estudo, quer por remoção da placa de cultura de inserção ou por corte de uma secção da membrana de inserção contendo uma fatia. </li></ol></li></ol></li><li> Manutenção <ol><li> Trocar o meio em placas de Petri um dia depois fazendo culturas. Transferir a inserção da placa de cultura para uma nova placa de Petri contendo 1 ml de meio de cultura fresco que é equilibrada na incubadora durante pelo menos uma hora antes de serem transferidos. </li><li> Alterar outra vez a forma da mesma maneira, no terceiro dia após a tomada de culturas. No terceiro dia, transferir as culturas para uma incubadora fixada em 34 ° C. Mudar o meio duas vezes por semana (a cada 3-4 dias). </li><li> Identificar culturas saudáveis. Selecione culturas saudáveis ​​para gravações de células inteiras emparelhados. NOTA: As culturas saudáveis ​​têm uma aresta bem definida e uma camada de células piramidais claramente definida. Culturas sagacidadeh áreas escuras (provavelmente necrótica) presente ou um aspecto vacuolizado com bordas achatadas são rejeitados. Empregando estes critérios, normalmente de dois terços das culturas fatia são suficientemente saudável para a gravação. </li><li> Utilize estas culturas dentro de uma relativamente pequena janela de tempo. Do não tecidos usados ​​que são cultivadas durante mais de duas semanas desde os neurónios começam a exibir um comportamento ligeiramente epileptiforme que agrava lentamente com o tempo. O limite superior exacto de sobrevivência neuronal não é conhecido, mas é possível gravar a partir das células piramidais tão tarde como 16 semanas em cultura. </li></ol></li></ol> 2. emparelhados Recordings células inteiras <ol><li> ACSF e Soluções intracelulares <ol><li> Preparar a solução de pré-sináptica por eléctrodo de mistura (em mM) 120 de gluconato de potássio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com KOH; osmolaridade: 290 mOsm). Embora a mesma solução de eléctrodo é usado para os neurónios pós-sinápticos, o gluconato de césio (120 mM) É normalmente utilizado como o principal sal no eléctrodo de pós-sináptico, mais mM QX314 5. NOTA: Isto permite fixação de tensão estável em potenciais positivos para gravar correntes mediadas por NMDAR pós-sinápticos 8-10,13. Também previne a hiper-excitabilidade induzida por potássio do neurónio pré-sináptico da solução interna que flui a partir do eléctrodo de registo antes da pós-sináptica de um selo giga ohm é feita. </li><li> Preparar a solução de pós-sináptico compor eléctrodo (em mM) 120 de gluconato de césio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com CsOH, osmolalidade: 290 mOsm). Puxe microeletrodos de vidro em 5-10 resistência mohms e encher com solução interna filtrada. </li><li> Preparar fluido cerebroespinal artificial (ACSF) compondo (em mM) 119 de NaCl, 2,4 de KCl, 1,3 MgSO4, 2,4 CaCl2, 1 de Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO3, 11 de glucose, pH 7,4, saturado com 95% de O 2, 5 % de CO 2. NOTA: Se r AMPAR mediadaesponses precisa ser bloqueado para exame de NMDAR EPSCs, incluem 10 mM CNQX ou NBQX no ACSF. </li></ol></li><li> Obter gravações de celulares emparelhados inteiras <ol><li> Para examinar a transmissão sináptica entre dois neurônios individuais, designar um neurônio como o neurônio pré-sináptico e segure pinça de corrente para induzir potenciais de ação e iniciar a transmissão sináptica. </li><li> Designar o segundo neurônio, como o neurônio pós-sináptico, e mantê-lo na braçadeira de tensão ou corrente, dependendo das informações exigidas pelo pesquisador. Obter exame detalhado das correntes glutamatérgicos, com EPSCs AMPAR mediadas examinados a -65 mV e EPSCs mediada por NMDAR examinados em 30 mV 6-16, mantendo o neurônio pós-sináptico na braçadeira de tensão </li><li> Estabelecer uma gravação emparelhado. Para estabelecer uma gravação emparelhado, a gravação de células inteiras pré-sináptico é sempre obtido pela primeira vez, permitindo que vários neurônios postsynaptic seqüenciais para ser obtida até aquele que é synaptically connected é obtido. Se se realizarem ensaios de plasticidade sináptica, é especialmente crítica para a obtenção do neurónio pré-sináptico primeira como a indução de LTP no neurónio pós-sináptico deve ser iniciada dentro de 10 min de obtenção de células inteiras das gravações para evitar lavagem de factores citoplásmicos necessários para LTP 8,19. </li><li> Evitar a perda de células induzida pelo movimento. Um desafio importante quando se realiza gravações de células inteiras emparelhadas evitar vibrações e perturbações induzidas pelo movimento do primeiro registo de célula completa, enquanto a obtenção da segunda gravação. <ol><li> Obter o primeiro registo de célula completa e, em seguida, mover a lente do microscópio 10-200 uM no eixo-x de modo que a gravação é estabelecida localizado na borda da área visível no monitor (Figura 2A). </li><li> Levante a lente do microscópio ~ 5-10 mm, assegurando que o ACSF ainda mantém contato com a lente. Monte o segundo eletrodo e orientar no menisco fluido (Figura 2B </sTrong&gt;). </li><li> Mova o eletrodo no plano xy até que esteja diretamente sob o caminho da luz através da lente, mas ainda bem acima do eletrodo de registro estabelecido. Uma vez que o eléctrodo é visível ao microscópio, é assegurar a ponta na extremidade mais distante do monitor de distância a partir do primeiro eléctrodo. </li><li> Movimentar o segundo eléctrodo para baixo em sequência com o foco microscópio até que ambos os eléctrodos estão no mesmo plano focal. É importante que o nível de pressão positiva é suficientemente forte para evitar a obstrução da ponta, mas não demasiado forte de modo a interromper a primeira gravação de células inteiras. Isso se traduz em pressão positiva induzir movimento em 2-3 neurônios do eletrodo quando se entra pela primeira vez da fatia. </li><li> Localizar um parceiro de pós-sináptica num plano focal semelhante à primeira gravação pré-sináptico (Figura 2C). A gravação é geralmente obter gravações entre os neurônios piramidais do CA3 a segunda célula inteira emparelhado de um neurônio 0-200 mm da primeira recording (Figuras 2C e D). NOTA: A transmissão sináptica entre pares neuronais são estáveis ​​ao longo de períodos de até 3-4 horas quando se utiliza estas técnicas de gravação de células inteiras padrão. </li></ol></li></ol></li><li> A plasticidade sináptica: Once Upon a obtenção de um par de células piramidais synaptically conectada sucesso (3A Figures, B), examinar as características da transmissão sináptica e plasticidade. <ol><li> A indução da LTP. <ol><li> Induzir LTP, emparelhando potenciais de ação pré-sinápticos (1 Hz) com a despolarização pós-sináptica de -10 a 0 mV por 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Inicie o emparelhamento dentro de 10 min de break-in para o neurônio pós-sináptico. NOTA: LTP também pode ser induzida com ambos os neurônios, realizada em pinça de corrente através do emparelhamento potenciais de ação pré-sinápticos e pós-sinápticos a 1 Hz por 1 min, com potenciais de ação pós-sinápticos provocou 10 ms após a injecção de corrente para o neurônio pré-sináptico 8 </saté&gt;. </li></ol></li><li> Além disso induzir LTD pela baixa freqüência de estimulação (LFS) a 1 Hz combinada com uma leve despolarização do neurônio pós-sináptico para -55 mV para 5-10 min (Figura 3C) 9. </li></ol></li></ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Aqui nós descrevemos os requisitos para estabelecer gravações de células bem sucedidos emparelhados inteiras em culturas organotípicas do hipocampo. Gravações emparelhados também pode ser realizada em várias preparações, incluindo fatias agudas e sistemas de culturas dissociadas 26,27. Embora o foco aqui foi sobre a indução de mais formas de plasticidade sináptica (nomeadamente LTP e LTD), é importante ressaltar que as gravações de células inteiras emparelhados em organotípica, fatia aguda ...

Os receptores de glutamato mediar a maior parte da transmissão sináptica excitatória nas sinapses no sistema nervoso central. Os dois subtipos principais de receptores de glutamato ionotrópicos localizadas na cabeça da coluna de a membrana pós-sináptica, são N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-proprionic ácido (AMPA). No potenciais de membrana em repouso, os receptores de AMPA carregam a maior parte da corrente pós-sináptica durante a transmissão sináptica. No hipocampo, o receptor de NMDA desempenha um papel importante no desencadeamento de alteração no número de receptores de AMPA na membrana pós-sináptica: actuando como um &quot;detector de coincidência de&quot; 1 para iniciar mudanças na força sináptica 1, o receptor de NMDA, participa nos mecanismos sinápticos que são pensados ​​para apoiar a aprendizagem ea memória em um nível subcelular. Em resposta à despolarização do neurónio pós-sináptico em paralelo com a libertação do transmissor pré-sináptico, cálcio entra através do NMDAreceptor de dar início a inserção ou a remoção do receptor de AMPA 2. Esta dinâmica do receptor subjacentes plasticidade sinapse: um aumento na força sináptica é potenciação de longa duração 2,3 (LTP), enquanto que uma diminuição na força sináptica é a depressão a longo prazo de 4 (LTD). Portanto, o movimento do receptor de AMPA é pensado para ser responsável pela expressão da plasticidade sináptica, enquanto os receptores NMDA são pensados ​​para controlar a sua indução. Determinar os mecanismos precisos subjacentes transmissão sináptica e plasticidade requer estudando pequenas populações de sinapses, idealmente sinapses individuais. Enquanto algumas sinapses são altamente adequados para o estudo, a este nível, por exemplo, a Calyx de Held 5, para as populações mais sinápticas isso é extremamente difícil devido à natureza pequena e difusa das conexões sinápticas. Duas importantes técnicas de eletrofisiologia foram desenvolvidos para examinar as conexões sinápticas individuais: A primeira é a estimulação mínima, where uma fibra pré-sináptica é presumido estimulada extracelularmente. A segunda técnica é emparelhado gravações, onde duas gravações simultâneas de células inteiras de neurônios conectados synaptically é realizada. Uma grande vantagem da estimulação mínima é de que é relativamente rápido e simples de realizar, que envolve a colocação de um eléctrodo de estimulação extracelular no tracto axonal e ao mesmo tempo de gravação de um neurónio pós-sináptico. A principal preocupação quando se utiliza esta técnica é que a estimulação confiável de uma única célula raramente pode ser garantida julgamento após julgamento. Nos últimos 15 anos temos utilizado rotineiramente emparelhado gravações de células inteiras a partir de dois neurônios piramidais synaptically conectados 6-17. A principal vantagem desta técnica é que apenas um neurónio pré-sináptico, é estimulado de forma consistente e fiável. Ele também permite que não só caracterização eletrofisiológica, mas também a manipulação farmacológica do neurônio pré-sináptico 6,18 &lt;/ Sup&gt;. No entanto, a probabilidade de conectividade sináptica entre neurónios é baixa, tornando-os pares conectados difícil obter 19. O uso de culturas organotípicas de cérebro contorna este obstáculo como conectividade sináptica pode restabelecer in vitro e além disso, a natureza da ligação resultante é semelhante ao que no tecido cerebral 20 nativa. Além disso, as culturas organotypic expressar LTP, LTD 7-10,12-15,21 e outras formas de plasticidade sináptica de curto prazo, incluindo a facilitação emparelhado-pulso (PPF) e depressão (PPD) 6,22,23, permitindo que os mecanismos de plasticidade para ser estudada em pares de neurônios. Aqui nós descrevemos a metodologia detalhada envolvido em alcançar sucesso gravações emparelhados neste sistema in vitro. Esta informação pode ser facilmente adaptado a outros sistemas experimentais, incluindo fatias agudas e de outras regiões do cérebro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Conectividade Synaptic é evidente, estimulando o neurônio pré-sináptico para disparar um potencial de ação por meio de um pulso de corrente de despolarização (tipicamente 20-50 aa para 20 ms), através do eletrodo de registro. O rastreio da corrente pós-sináptica é, em seguida, examinadas para a presença de um EPSC monossináptico evocado no curta (&lt;5 ms) e latências consistentes após o pico do potencial de acção pré-sináptico (Figura 3A). Na maioria das experiências múltiplas neu...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K visualizações.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Vídeo: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Neurociência

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...