Agradecemos Amy Chen por sua ajuda na preparação para a filmagem do vídeo e para demonstrar a técnica. Este trabalho realizado pelo ENIGMA: Ecossistemas e redes integradas com os genes e Assembléias Molecular (http://enigma.lbl.gov), um programa científico da área de foco no Lawrence Berkeley National Laboratory, foi apoiado pelo Escritório de Ciência, Instituto de Ciências Biológicas e Pesquisa Ambiental, do Departamento de Energia dos EUA sob Contrato n º DE-AC02-05CH11231.

Nota: O protocolo a seguir é adaptado para determinação de genes alvos do DVU3023 RR da bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Ele pode ser adaptado a qualquer outro regulador transcricional de interesse. 1. Clone e Purify RR <ol><li> Clonar o gene RR, especificamente DVU3023, de D. vulgaris Hildenborough num vector de expressão de Escherichia coli de modo a que o gene é o C-terminal marcado com His e de expressão está sob o controlo de um promotor de T7. Nota: Vários métodos de clonagem pode ser utilizado e é determinado pelo investigador. Também podem ser utilizados marcadores de afinidade alternados. </li><li> Transformar a construção de expressão em E. coli BL21 (DE3) tensão expressão. </li><li> Cresça 1 L da BL21 expressão tensão a 37 ° C. Na fase mid-log, adicionar IPTG a 0,5 mM para induzir a expressão da proteína. Continuar o crescimento à temperatura ambiente durante 24 horas. </li><li> Células centrifugar a 5000 xg por 10 min a 4 ° C. Ressuspender as células em tampão de lise (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 40 mM de imidazole, 1 mg / ml de lisozima, 1x benzonase nuclease). Lise das celulas usando uma imprensa francesa, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 um. </li><li> Lavar uma coluna de 1 ml de Ni Sepharose em um instrumento de FPLC utilizando 10 ml de tampão de lavagem (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 40 mM de imidazole). </li><li> Carregar lisado na coluna. Lavar coluna com 20 ml de tampão de lavagem. </li><li> Eluir DVU3023 usando um gradiente de 0-100% de tampão de eluição (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM). </li><li> Carregar fracções eluídas numa coluna de dessalinização, e lava-se com um tampão de dessalinização (fosfato de sódio 20 mM pH 7,4, NaCl 100 mM). </li><li> Centrífuga amostra de proteína em um filtro de centrífuga de alta molecular de corte de peso para concentrar a proteína. Adicionar DTT a 0,1 mM e glicerol a 50% e armazenar a proteína a -20 ° C. Nota: terão de ser optimizados individualmente para cada proteína sob estudo métodos de purificação. </li></ol> 2. Determine gene alvo para RR Usando Electrophoretic Mobilidade Mudança Assay (EMSA) <ol><li> Amplificar por PCR a região de 400 pb a montante do DVU3025 gene alvo candidato, usando D. ADN genómico vulgaris Hildenborough como molde, e um iniciador não marcado para a frente e um reverso 5&#39;-biotina marcado com iniciador. Nota: Dicas para escolher um gene alvo candidato: Muitas vezes RRS ligar as regiões a montante do seu próprio gene / operon, ou eles podem regular genes codificados proximal. Se a RR tem ortólogos em outras espécies, olhar para genes que são conservados no bairro. Métodos alternativos incluem genes candidatos que escolhem com base em previsões regulão (por exemplo, RegPrecise 5), ou prevendo promotores dependentes de sigma54 6 RRS para que sejam eles próprios sigma54-dependente. </li><li> Executar o produto de PCR num gel de agarose a 1%, cortado a 400 bp produto de tamanho, e purificar o DNA usando uma extração de gel limpar kit. </li><li> Misturar a proteína DVU3023 (0,5 pmol) com 100 fmol de substrato DNA biotinilado em 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, glicerol a 25% e 1 ug / ml de poli dI.dC (non -específica concorrente ADN) num volume total de 20 ul. Também criou uma reação sem qualquer proteína como um controle. Incubar as reações à temperatura ambiente no banco para 20 min. </li><li> Nota: Estas são as condições padrão enumerados e outros componentes da reacção, podem ser adicionados dependendo do RR de interesse. Se a ativação for desejada, adicionar fosfato de acetil 50 mM para a reação (muitas vezes RRS ligará DNA in vitro, sem ativação). </li><li> Pré-executar um mini 6% de poliacrilamida-0.5x gel TBE pré-moldado em tampão TBE 0,5 x a 100 V por 30 min. Adicionar 5 mL de tampão 5x de carga (0,1% de azul de bromofenol, 0,1% xilenocianol, 30% de glicerol em 1x TBE) para as reações de ligação e de carga de 18 mL das reações sobre o gel. Execute a 100 V durante 2 horas. Nota: Para evitar o sobreaquecimento, o que pode conduzir a dissociação dos complexos proteína-ADN, encher a câmara tampão externo no sistema de electroforese com tampão de operação de tal forma que a maior parte do gel é isolado por tampão. Em alternativa, o gel pode ser realizada a 4 ° C. </li><li> Cortar uma membrana de nylon carregada ao tamanho do gel e mergulhe-o em 0,5 x TBE, durante pelo menos dez minutos. Remover o gel a partir da cassete. Cortar quaisquer saliências fora do gel e o gel de sanduiche e a membrana entre dois papéis de filtro de espessura embebido em TBE 0,5 x, e colocar dentro de um aparelho de transferência semi-seco e à temperatura de 20 V durante 30 min. </li><li> Coloque a membrana dentro de um instrumento de luz UV crosslinker comercial e definir o tempo de 3 min. Nota: A membrana podem agora ser armazenados secos à temperatura ambiente durante vários dias antes de prosseguir para o próximo passo. </li><li> Use um kit de detecção quimioluminescente disponível no mercado que emprega um estreptavidina-cavalo rabanete peroxidaçãosi conjugado para desenvolver a mancha como as instruções do fabricante. </li><li> Imagem da mancha utilizando um computador ligado a uma câmara CCD equipado e procurar uma mudança na mobilidade do substrato de DNA na presença do RR, o que indica que a RR liga o ADN a ser testado. Nota: A especificidade da transferência de DNA-proteína pode ser testada através da inclusão na reacção de um excesso de DNA competidor não marcado, que deverá eliminar ou reduzir a mudança de vista. </li></ol> 3. Verifique Alvo Enriquecimento após Genomic DNA-binding protein <ol><li> Reacção de ligação proteína-ADN genómico <ol><li> ADN genómico de cisalhamento até um tamanho médio de 500 pb por sonicaçao de DNA genómico 100 ul (em concentrações de 100-200 ng / ul) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando uma microponta com 9 baixos impulsos de amplitude de um segundo, com 2 seg lacuna entre cada. Nota: Se os respingos de DNA para os lados do tubo, girar o conteúdo a cada 3 pulsos. As condições exatas usadasvariará de acordo com o instrumento de ultra-sons utilizado. Os fragmentos de ADN cortados podem variar de 100-1000 pb, mas o tamanho médio deve ser dentro de 400-600 pb. Demasiada corte pode resultar em menos sítios de ligação intactas, e quer muito ou pouco corte afetará preparação biblioteca durante as etapas a jusante inteiras de amplificação do genoma. </li><li> Misturar 2-3 ug de DNA genómico cortado com proteína RR (0,5 pmol de DVU3023) em 10 mM Tris-HCl pH 7,5, DTT 1 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, 25% glicerol, e 50 mM de fosfato de acetilo. Incubar as reacções a 25 ° C durante 30 min. Transferir 10 uL desta reacção para um tubo de 1,5 ml e rotular como ADN de entrada. Nota: fosfato Acetil é adicionada para activar a proteína in vitro por fosforilação. A fosforilação estimula a ligação ao ADN, mas muitos RRS também ligar o ADN in vitro, sem activação 7. A quantidade de proteína adicionada à reacção dependerá de actividade da preparação de proteína. O EMSA pode ser utilizado para optartimize este montante. </li></ol></li><li> Afinidade purificar o ADN ligado às proteínas <ol><li> Adicionar 30 mL de resina de agarose Ni-NTA para um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Centrifugar a 100 xg durante 1 minuto para recolher a resina na parte inferior, e remover o sobrenadante. Adicionar 100 ul de tampão de lavagem (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 5 mM, KCl 50 mM, glicerol a 25%), o movimento do tubo para misturar e centrifugar a 100 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar os restantes 90 ul da reacção de ligação com a resina de Ni-NTA lavada e incubar num agitador rotativo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 2 min e remove-se o sobrenadante (o ADN não ligado). Adicionar 100 ul de tampão de lavagem, apertar o tubo para misturar o conteúdo, e centrifugar a 100 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante. Repita o passo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Adicionar 35 ul de tampão de eluição (tampão fosfato pH 20 mM de sódio 8, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM) à resina e misturar por vortex. Incubar no banco a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 100 xg por 2 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e rotular como a fracção de DNA ligada à proteína. </li><li> Também adicionar 35 ul de tampão de eluição para o ADN de entrada. </li><li> Purifica-se a entrada e as fracções de ADN ligado à proteína usando um kit de purificação de PCR. </li></ol></li><li> Genoma inteiro amplificar a entrada e amostras de DNA ligadas às proteínas. <ol><li> Adicionar 10 ul de entrada e de DNA ligado a proteínas para separar tubos PCR. Adicionar 1 mL de tampão de fragmentação de 10x, 2 ul de tampão de preparação da biblioteca, e 1 ul de solução de biblioteca de estabilização para cada amostra. Misture bem em vórtice. Aquecer num termociclador a 95 ° C durante 2 min, e frio no gelo. Nota: A quantidade inicial de ADN deve ser de pelo menos 10 ng, a fim de evitar a introdução de viés de amplificação. </li><li> Adicionar 1 ml de preparação de enzima Biblioteca, misturar por pipetagem, e incubar em termociclador a 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C durante 20 min, 75 ° C / 5 min, E espera a 4 ° C. </li><li> Para cada tubo, adicionar 47,5 mL de água, 7,5 ul de amplificação 10x mistura principal, e 5 ul de polimerase. Misturar bem e aquece-se a 95 ° C / 3 min, seguido por 20 ciclos de 94 ° C/15 seg, 65 ° C / 5 min. Segurar reacções a 4 ° C. </li><li> Purifica-se as amostras de DNA amplificado usando um kit de purificação PCR e medir a concentração de DNA por espectrofotometria. </li></ol></li><li> Verifique alvo enriquecimento no ADN ligada a proteína utilizando qPCR <ol><li> Primers Projeto qPCR para amplificar 200 pb da região a montante do gene alvo EMSA-verificada (DVU3025) usando qualquer software de desenho de primers livremente disponível. </li><li> Configure reações de qPCR em triplicado para cada modelo de DNA com cada conjunto de primers. Prepare uma mistura de mestre para cada conjunto de primers. 1x mistura principal contém 10 mL de mistura SYBR Green qPCR 2x, 0,5 uM de cada iniciador e água para um total de 18 ul. Alíquotas de 18 ul da mistura principal por poço de uma placa de 96 poços de PCR. </li><li> Dilute a entrada e amplificados purificados e amostras de DNA ligadas a proteínas de 5 ng / mL com água e usado como molde de ADN. Adicionar 2 l de molde de ADN para os poços. </li><li> Selar a placa com um filme de selagem ultra claro qPCR, spin down placa em uma centrífuga a 200 xg / 1 min. Coloque a placa em uma máquina de qPCR tempo real. Ciclo como se segue, utilizando o software associado qPCR: 95 ° C / 1 min, e 40 ciclos de 95 ° C/10 seg, 59 ° C/15 seg e 70 ° C/35 seg. </li><li> Além disso, definir as reações de qPCR triplicadas com primers para amplificar regiões a montante de um gene relacionado (controle negativo). </li><li> Calcular ôc T subtraindo valor T C do DNA ligada à proteína do que o ADN de entrada. Calcular o enriquecimento de dobragem do gene alvo no ADN ligado à proteína como 2 Ac t. Nota: Se o alvo a região a montante foi enriquecida com o ADN ligado às proteínas contra o ADN de entrada, que indica que as reacções de ligação e purificação por afinidade foram successful. Vá para a etapa 4. Se o enriquecimento de alvo a região a montante não foi observado, repita as reações de ligação (passo 3.1) com diferentes quantidades de proteína. </li></ol></li></ol> 4. Labeling DNA e matriz de Hibridização <ol><li> Etiqueta DNA de entrada com DNA Cy3 e enriquecido com Cy5 ota: Cy3 e Cy5 corantes são sensíveis à luz e os cuidados devem ser tomados para manter a exposição à luz a um mínimo. <ol><li> Misture 1 mg de DNA com 40 mL Cy3/Cy5-labeled 9-meros e ajustar o volume para 80 mL com água. </li><li> Calor desnaturar a 98 ° C durante 10 minutos no escuro (num termociclador). Frio rápida no gelo por 2 min. </li><li> Adicionar 2 l de Klenow da polimerase (3&#39;-5&#39;-exo -, 50.000 U / ml), 5 mM dNTPs, e 8 mL de água a cada reacção, misturar bem e incubar a 37 ° C durante 2 horas no escuro (em um termociclador). </li><li> Adicionar EDTA para 50 mM, para parar a reacção e uma solução de NaCl a 0,5 M. </li><li> Amostras de transferência para tubos de 1,5 ml containing 0,9 volume de isopropanol, incubar no escuro durante 10 minutos, e centrifugar a 12000 xg durante 10 min. A pastilha deve ser rosa para DNA Cy3 marcado e azul para DNA Cy5 marcado. </li><li> Lavar sedimento com etanol a 80% (500 mL) e centrifugar a 12000 xg durante 2 min. Pelotas secarem naturalmente durante 5-10 min no escuro. Nota: Os grânulos podem ser armazenadas a -20 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 25 mL de água. Medir a concentração de DNA por espectrofotometria. </li><li> Piscina juntos 6 ug cada de ADN Cy3 e Cy5 marcado num tubo de 1,5 ml e seco sob vácuo em uma centrífuga em baixo calor no escuro (cobrir a tampa da centrifugadora, se for transparente). Nota: Os grânulos podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para a hibridação. </li></ol></li><li> Microarray Hibridização <ol><li> Ligue o sistema de hibridização em 3-4 horas antes de usar e definir a temperatura a 42 ° C. </li><li> Prepare uma solução de mistura principal hibridização tal que 1x solução contém 11,8 mL 2x Hybriditampão zação, 4,7 ul de Hibridização de componentes A e 0,5 ul de oligo alinhamento. </li><li> Ressuspender as peletes em 5 mL de água. Adicionar 13 ul desta mistura para a amostra. Vortex durante 15 seg, incubar a 95 ° C em um banho seco de 5 min. Manter as amostras a 42 ° C no sistema de hibridação até estarem prontos para carregamento. </li><li> Prepare o microarray montagem slide-mixer, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Coloque o conjunto misturador de slides dentro do sistema de hibridização. Carga de 16 ul de amostra no orifício de enchimento, selar as portas com uma película adesiva, transformar a mistura no no sistema, e hibridar durante 16-20 horas a 42 ° C. </li><li> Prepare 1x tampões de lavagem I (250 ml), II (50 ml) e III (50 ml) por diluição das 10x tampões comercialmente disponíveis em água, e para cada adicionar DTT a 1 mM. Tampão Quente I a 42 ° C. </li><li> Deslize o misturador de slides em uma ferramenta de desmontagem, e coloque dentro de um prato quente contendo Tampão I. Peel a batedeira desligada, enquanto vigorosamente shendo a ferramenta de desmontagem com a mão. </li><li> Coloque o slide em um recipiente com 50 ml de tampão de lavagem I e agitar vigorosamente durante 2 minutos com a mão. </li><li> Transferência de slides para um segundo recipiente com tampão de 50 ml Wash II e agitar vigorosamente durante 1 min com a mão. </li><li> Transferência de slides em um terceiro recipiente com 50 ml de Tampão de lavagem III, e agitar vigorosamente por 15 segundos com a mão. </li><li> Apagar rapidamente as bordas do slide em uma toalha de papel e coloque em um rack slide. Centrifugar a 200 xg durante 2 minutos para secar a corrediça. Coloque dentro de caso slide, envolvê-la com papel alumínio e guarde em um dessecador. </li></ol></li><li> A digitalização da Matriz <ol><li> Colocar a lâmina dentro do scanner de microarray de acordo com as instruções do instrumento. </li><li> Use um software de scanner para definir os comprimentos de onda como 532 nm = Cy3 e 635 nm = Cy5, e os ganhos fotomultiplicadores iniciais entre 350 e 400. </li><li> Pré-visualizar o slide para localizar a matriz no slide. Selecione a região de matriz para a digitalização. </li&gt; <li> Digitalizar a matriz e ajustar as configurações de fotomultiplicadores de tal forma que as características da matriz são principalmente amarelo. O histograma que mostra as curvas de vermelhas e verdes, sobreposto ou o mais próximo possível uns dos outros quanto possível. As curvas devem terminar acima dos 10 -5 contagens normalizadas em saturação. </li><li> Salve ambos os 532 e 635 nm imagens separadamente. </li></ol></li><li> Análise de Dados Matriz <ol><li> Importe as imagens em um software de análise de matriz. Usando o software, criar dois relatórios (par. Par) para cada matriz (por Cy3 e Cy5 imagens). Criar log 2 arquivos relação em escala usando os arquivos par. Use log 2 arquivos relação ao procurar picos usando uma janela deslizante de 500 pb. Mapear o pico loci para as regiões a montante de genes alvos. </li><li> Verifique se o alvo positivo (determinado usando EMSA e confirmado por qPCR, DVU3025 neste exemplo) aparece no top picos. Nota: Se o alvo positivo não está entre os top hits, é possível que a RR em consisideração tem vários genes alvos e replicar DAP-chips pode ser realizado e picos comuns a todas as repetições podem ser utilizados para gerar uma lista de destino. </li></ol></li></ol> 5. Binding Previsão do Site Motif e Validação <ol><li> Recuperar as sequências de regiões a montante (400 pb) para os genes alvos principais como gerado pela análise DAP-chip. Aplicar MEME sobre essas sequências através de micróbios Online (meme.nbcr.net) para prever motivos. Nota: as proteínas de ligação, tais como os reguladores Enhancer sigma54-dependentes podem ligar-se várias centenas de pares de bases a montante do local de início. Para outros reguladores da transcrição, uma região mais curto, tal como de 200 pb a montante será suficiente. </li><li> Projeto superior e oligômeros DNA, fundo que contêm o motivo sítio de ligação previsto ladeado por 10 bases em cada extremidade. Encomende o topo vertente 5 &#39;biotinilado. </li><li> Misturar os oligos de cadeia de topo e de fundo em relação de 1:1,5 em 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM e NaCl a 50 mM emum volume total de reacção de 20 ul em tubos PCR. Aquece-se a 95 ° C durante 5 minutos num termociclador, seguido de arrefecimento lento até 25 ° C. Diluir dez vezes e usar como substrato dsDNA tipo selvagem para EMSA. </li><li> Prepare substratos modificados usando os mesmos passos acima, mas oligômeros projeto para levar 4-6 substituições nas bases conservadas do motivo de ligação. </li><li> Defina-se reacções de ligação com a RR e do tipo selvagem ou substratos modificados e analisar usando EMSA, tal como descrito no passo 2. </li><li> Nota: O motivo predito é validado se o RR liga o substrato do tipo selvagem, mas não a uma modificação. </li></ol> 6. Conservação da Motif em Outras bacterianas relacionadas Espécies <ol><li> Selecione genomas de interesse que contêm ortólogos de DVU3023. Obter arquivos de seqüência e de anotação dos genomas do site do NCBI. </li><li> Use uma linguagem de programação como Perl para escrever scripts que irão utilizar as seqüências motivo de as metas DAP-chip para construir um position matriz ponderada e usar a matriz para marcar motivos semelhantes presentes em outros genomas seqüenciados. </li></ol>

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	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

Os autores não têm qualquer conflito de interesse de divulgar.

O método DAP-chip aqui descrito foi utilizado com sucesso para determinar os genes alvos para vários RRS em Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 dos quais um é mostrado aqui como um resultado representativo. Para RR DVU3023, escolhendo um alvo gene candidato foi simples. DVU3025 está localizado imediatamente a jusante do gene RR, e os genes-alvo e RR são conservadas em diversas espécies Desulfovibrio, e adicionalmente DVU3025 tem um promotor dependente de sigma54 previsto. O EMSA for...

A capacidade das bactérias para sobreviver e prosperar é criticamente dependente da forma como eles são capazes de perceber e responder a perturbações em seus ambientes, e este por sua vez é dependente de seus sistemas de transdução de sinal. O número de sistemas de sinalização uma bactéria codifica tem sido chamado o seu &quot;QI microbiana&quot; e pode ser uma indicação de ambos variabilidade do seu ambiente e da sua capacidade de sentir múltiplos sinais e afinar a sua resposta 1. Dois sistemas de componentes de transdução de sinal (TCS) são os sistemas de sinalização mais prevalentes utilizados por bactérias, e que consistem de uma histidina-quinase (HK), que detecta o sinal externo e transmite através da fosforilação de um regulador de resposta efectora (RR) 2. RRS pode ter uma variedade de domínios de saída e, portanto, diferentes modos efetoras, mas a resposta mais comum é a regulação da transcrição por meio de um DNA domínio 1 vinculativo. Os sinais detectados e as funções correspondentes dos vast maioria dos TCSs permanecem desconhecidos. Embora métodos in vivo, tais como Chip-chip são habitualmente usadas para a determinação de locais de ligação de factores de transcrição do genoma 3, que apenas pode ser utilizado para RRS sistema de dois componente bacteriano, se são conhecidas as condições de activação ou sinalização. Muitas vezes, os sinais ambientais que ativam a TCS são mais difíceis de determinar que os seus genes alvos. O microarray ensaio in vitro com base aqui descrita pode ser utilizada para determinar rápida e eficazmente os genes alvos e prever as funções de TCS. Este ensaio tira partido do facto de RRS pode ser fosforilada e assim activado in vitro utilizando pequenos doadores molécula como fosfato acetil 4. Neste método, chamado DAP-chip para ADN de afinidade-purificada de chip (Figura 1), o gene da RR de interesse é clonado com uma cauda de His no E. coli, e uma proteína marcada subsequentemente purificado é permitido biª a cortado DNA genômico. O DNA ligado à proteína é então enriquecida por afinidade-purificação, o ADN enriquecido e entrada são amplificados, marcado por fluorescência, reunidas e hibridado com um conjunto azulejos que é feito para o organismo de interesse (Figura 1). Microarray experiências estão sujeitos a artefactos e, por conseguinte, são empregues passos adicionais para optimizar o ensaio. Um tal passo é a tentativa de determinar um destino para o RR em estudo utilizando ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) (ver fluxo de trabalho na Figura 2). Em seguida, após a ligação ao ADN genómico e as etapas de DAP, o DNA ligado à proteína e de entrada são examinados por qPCR para ver se o alvo positivo é enriquecido na fracção ligada à proteína em relação à fracção de entrada, confirmando, assim, as condições óptimas de ligação para o RR (Figura 2). Após a matriz de hibridação, os dados são analisados ​​para encontrar os picos de intensidade de sinal mais elevado, indicando locus genómico onde a proteína hanúncio vinculada. As funções podem ser previstos para o RR com base nos genes alvos obtidos. Os loci alvo genómicas são usadas para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, experimentalmente validados usando EMSAs (Figura 2). As previsões funcionais e genes alvos para a RR pode então ser estendido para as espécies que codificam RRS ortólogos por inventariar os genomas de motivos de ligação semelhantes (Figura 2) intimamente relacionados. O método DAP-chip pode fornecer uma riqueza de informações para a TCS onde antes não havia nenhuma. O método também pode ser utilizado para qualquer regulador de transcrição se a proteína pode ser purificada e as condições de ligação de ADN pode ser determinada, e para todo o organismo de interesse com uma sequência de genoma disponível. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. O chip de ADN purificado por afinidade (DAP-estratégia chip) 7. O gene RR a partir do organismo de interesse é clonado com um carboxi-terminal His-tag numa E. tensão expressão coli. Purificado proteína marcada com His é activada por fosforilação com fosfato de acetilo, e misturados com o DNA genómico cortado. Uma aliquota da reacção de ligação é guardado como o ADN de entrada, enquanto o resto é submetido a purificação por afinidade usando uma resina Ni-NTA. A entrada e o DNA ligado a RR são todo o genoma amplificado e marcado com Cy3 e Cy5, respectivamente. O ADN marcado é reunidas e hibridado com uma matriz de ladrilhos, que é então analisado para determinar os alvos do gene. Figura modificada e reimpresso com a licença creative commons de 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Resumo do fluxo de trabalho. Para qualquer Protei marcado purificadon, começar por determinar um alvo usando EMSA. Permitir proteína para ligar DNA genômico e DNA-afinidade-Purify (DAP) e todo o genoma amplificar (WGA) e do DNA de entrada enriquecido. Se um gene alvo é conhecido, usar qPCR para garantir que o alvo conhecido é enriquecido na fracção ligada a proteína. Se nenhum destino poderia ser determinado, prossiga diretamente para rotulagem de DNA e variedade de hibridização. Se o enriquecimento por qPCR não pôde ser observado, em seguida, repita a ligação proteína-gDNA e passos DAP-WGA usando diferentes quantidades de proteína. Use a análise de matriz para encontrar picos e mapeá-los para atingir genes. Use as regiões a montante de genes alvo de prever motivos local de ligação. Validar os motivos experimentalmente usando EMSAs. Use o motivo para digitalizar os genomas de espécies relacionadas que codificam ortólogos da RR em estudo, e prever genes alvo nas espécies também. Com base nos genes alvos obtidos, a função fisiológica da RR e seus ortólogos pode ser previsto. Figura modificada e reimpresso usando o c criativoommons licença de 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

Os métodos in vivo, tais como Chip-chip são técnicas bem estabelecidas usados ​​para determinar genes alvos globais para fatores de transcrição. No entanto, eles são de uso limitado na exploração de dois sistemas de regulação componente bacteriano com condições de ativação descaracterizados. Tais sistemas de regular a transcrição apenas quando activada, na presença de sinais únicos. Uma vez que estes sinais são muitas vezes desconhecidos, o método de microarray com base in vitro descritos neste artigo de vídeo podem ser utilizados para determinar alvos de genes e sítios de ligação para reguladores da resposta. Este método de ADN purificado por afinidade-chip pode ser utilizado para qualquer regulador purificada em qualquer organismo com um genoma sequenciado. O protocolo envolve permitindo que a proteína purificada marcado para se ligar ao DNA genómico cortado e, em seguida, a purificação por afinidade de ADN ligado à proteína, seguido de marcação fluorescente do ADN e hibridação com uma matriz de ladrilhos costume. Precedendo passos que podem ser utilizados para optimizar o ensaio para a especificidadereguladores c também são descritos. Os picos gerados pela análise dos dados de matriz são utilizados para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, validada experimentalmente. As previsões motivo pode ser ainda utilizado para determinar genes alvos dos reguladores de resposta ortólogos em espécies estreitamente relacionadas. Nós demonstramos a aplicabilidade deste método através da determinação dos genes alvos e motivos do site vinculativo e prevendo, assim, a função de um regulador de resposta DVU3023-dependente sigma54 na bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ambiental.

O método acima foi aplicado para determinar os genes alvos globais dos RRS no sulfato de modelo reduzindo bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Este organismo tem um grande número de TCS representado por mais de 70 RRS, indicando a vasta variedade de possíveis sinais que detecta e responde. Análise in vivo sobre as funções destes sistemas de sinalização são difíceis de realizar uma vez que os sinais e, assim, as suas condições de activação são desconhecidos. Aqui o...

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DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes.

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.6K visualizações.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes. 

Vídeo: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the biliary tract in Suncus murinus (S. murinus&#160;). First, the specimen was dissected from S. murinus and fixed in 4% paraformaldehyde (PFA). Second, an enzymatic treatment and potential endogenous peroxidase inactivation were performed. The specimen was then exposed to the primary antibody, anti-neurofilament protein antibody, for 3-6 days. It was then incubated with the secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. The color reaction was revealed by reacting the specimen with a 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) substrate. This method can be applied to analyze the innervation of all visceral organs. Furthermore, this protocol can also be adapted to test other neuronal antibodies, but optimization of the antibodies should be done first. This method was originally introduced by Kuratani and Tanaka1,2,3.

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

A whole-mount immunohistochemical approach, to visualize neurofilament protein expression in the extrahepatic biliary tract in Suncus murinus. is presented here. This protocol can be used to analyze the innervation of all visceral organs in S. murinus or other species.

Usando um método imunohistoquímico de montagem total para estudar a preservação do trato biliar em<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...