A imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento, ou ChIP-seq, é uma técnica que pode ser usada para descobrir os alvos regulatórios de fatores de transcrição, modificações de histona e outras proteínas associadas ao DNA. Em ChIP-seq, as células são colhidas e proteínas de ligação de DNA. é cruzado ligado ao DNA in vivo com formaldeído.
As células são liseadas, liberando o conteúdo da célula e a cromatina é transformada em fragmentos de menos de 1000 pares de base, geralmente entre 200 e 600 pares de base. O DNA, interagindo com a proteína alvo, é imunoprecipitado usando anticorpos e isolado por descodligamento. Os crosslinks de proteína de DNA são invertidos e RNA e proteína são digeridos.
O DNA é purificado, transformado em bibliotecas e sequenciado. Os dados chIP-seq também podem ser usados para encontrar a vinculação diferencial de fatores de transcrição em diferentes condições ambientais ou tipos de células. Inicialmente, o ChIP foi realizado através da hibridização em uma microarray.
No entanto, o sequenciamento do ChIP tornou-se o método preferido devido aos avanços tecnológicos, à diminuição das barreiras financeiras ao sequenciamento e à produção maciça de dados de alta qualidade. Neste protocolo, demonstraremos técnicas de realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, uma das principais fontes de infecções persistentes e crônicas. O ChIP-seq será realizado em células biofilm de salmonela typhimurium e planktônica, visando o regulador mestre de biofilme, CSGD, para determinar a vinculação diferencial nos dois tipos de células.
Neste vídeo, demonstraremos técnicas de determinar a quantidade adequada de biofilme para colher, normalizar para uma amostra de controle planctônico, homogeneizar o biofilme para acesso ao crosslinker e realizar etapas rotineiras do ChIP-seq para obter resultados de sequenciamento de alta qualidade. A salmonela de placa de listras enterica serve nosso typhimurium em uma placa de ágar LB para isolar colônias e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. Inocular cinco mL LB caldo com uma a três colônias da placa de raia e incubar a 37 graus Celsius com agitação por sete horas ou para registrar o crescimento.
Encontre a densidade óptica da cultura do frasco em 600 nanômetros, usando um espectógrafo e adicione um OD 600 equivalente à cultura celular ou 10 às nove células a um frasco de Erlenmeyer contendo 100 mililitros de um por cento de triptona. Incubar a 28 graus Celsius com agitação por 13 horas. As células biofilmes aparecem como flocos agregados e células planctônicas únicas estão na mídia nebulosa.
O biofilme é altamente resistente e gruda nas laterais dos tubos e pontas de pipeta. Usamos mídia condicionada para mover biofilme inicialmente e usamos PBS quente imediatamente antes de cruzar para remover substratos de ligação cruzada de proteínas na mídia. Os pesquisadores podem precisar encontrar uma solução apropriada para suspender o biofilme.
Colete a cultura do frasco em um tubo de centrífuga e centrífuga a 12.000 G por 10 minutos a 10 graus Celsius. Decante o supernatante em uma unidade de filtro de 0,2 micrômetro e filtro de vácuo. Cultura de frasco de aliquot em tubos e centrífuga em velocidade lenta para separar os dois tipos de células.
As células de biofilme estão na pelota na parte inferior do tubo e as células únicas estão no sobrenatante nublado. Pipeta o supernatante contendo células planctônicas em um tubo de centrífuga para mais tarde. 25 microgramas de DNA são recomendados como entrada para experimentos chip-seq.
No nosso caso, 30 miligramas de biofilme produzem aproximadamente 25 microgramas de DNA. Uma vez que os agregados de biofilme têm uma abundância de material extracelular proteináceo, ele compete por crosslinker e pode resultar em produtos interligados desiguais apresentados para imunoprecipitação. Sugere-se um ensaio proteico para determinar o material celular equivalente por concentração de proteínas.
Neste caso, seis células planktônicas OD 600 são colhidas como controle para 30 miligramas de biofilme. O biofilme é colhido pelo peso úmido e as unidades agrícolas de biofilme das colônias podem ser encontradas utilizando o fator de conversão mostrado. Os pesquisadores são encorajados a encontrar o fator de conversão das espécies formadoras de biofilme com as quais trabalham por homogeneização e diluições de gota.
Suspenda a pelota de biofilme em um mililitro de triptona condicionada e mova-se para uma tampa de estalo de dois mililitros pré-pesado ou um tubo de tampa de parafuso. Centrífuga por um minuto a 11.000 G.Remova o supernasal do tubo e pese o tubo com precisão. Subtraia o peso do tubo do peso do tubo com biofilme para encontrar o peso dos agregados.
Deve estar dentro de 10% do peso do biofilme alvo. Adicione um mililitro de PBS e vórtice para suspender de risco os agregados de biofilme. Dispense o supernatante da centrifugação de velocidade lenta em tubos de centrífuga.
Meça a densidade óptica das células planctônicas em 600 nanômetros usando um espectotômetro e calcule o volume necessário para um OD final 600 de seis. Esfrie a centrífuga flora a 10 graus Celsius e pelota as células planctônicas usando a centrífuga Flora. Centrífuga a 10.000 G por 10 minutos a 10 graus Celsius.
Remova o supernatante e suspenda a pelota na PBS. Remeasure o OD 600 das células planktônicas usando um espectrofotômetro e distribua o volume de seis células planktônicas OD 600 em um tubo de tampa de snap de dois mililitros ou tampa de parafuso. Os agregados de biofilm devem ser separados para permitir que o crosslinker acesse células.
As células planctônicas são tratadas da mesma forma que as células biofilmas para reduzir variáveis. O uso de contas metálicas em um moinho de mistura pode ser mais eficaz para quebrar o biofilme do que os homogeneizadores de tecido de vidro. Asepticamente, adicione uma conta de metal esterilizada a cada um dos tubos.
Homogeneize usando uma máquina de batedeira por cinco minutos a 30 Hertz. Observe tubos agregados para confirmar que o biofilme foi quebrado antes de transferir as células homogeneizadas para um novo tubo de 1,5 mililitro, evitando a conta metálica. Leve o volume para um mililitro com PBS.
Neste ponto, é opcional realizar diluições de gota para enumerar células de entrada. Distribua formaldeído fresco em tubos de amostra para uma concentração final de 1%. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente em uma roda giratória.
Adicione a glicina a uma concentração final de 125 milimões para saciar a ligação cruzada e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente em uma roda giratória. Para lavar as células e remover o excesso de crosslinker, centrífuga por três minutos a 8.000 G e remover o supernatante. Suspenda a pelota em inibidores de protease e 500 microliters de PBS esterilizados por filtro.
Suspenda a pelota em 600 microliters de tampão de lise e incubar no gelo por 10 minutos. Mova o liseto parcial para um novo tubo contendo 1,4 mililitros de tampão de diluição IP. Mantenha no gelo por uma hora e meia a duas horas e vórtice ocasionalmente.
Alguns materiais resistentes podem permanecer nos tubos. No entanto, um longo período de incubação e vórtices ocasionais quebrarão o material agregado e o restante será quebrado durante a sônicação. Sintonize o sonicator.
Coloque o tubo de 15 mililitros em um béquer de gelo e coloque a sonda dentro do tubo. Pulso de 20 a 40% para cinco rajadas de sônica de 30 segundos e frio entre as balas de sônica. O liseto celular aparecerá nublado antes da sônica e aparecerá claro após a sônica.
Para remover o material precipitado, centrífuga a 8.000 G por 10 minutos a quatro graus e dispensar o supernasal em um novo tubo, evitando a pelota preta. A transferência de energia do sonicator e a resistência ao tipo celular podem diferir, por isso recomenda-se um ensaio de sônica para encontrar o número de balas de sônica que produzirão a faixa de tamanho do fragmento necessária para a preparação e sequenciamento da biblioteca a jusante. Distribua DNA sonicado em uma alíquota de 1,35 mililitro para imunoprecipitação e uma alíquota de 200 microliter como DNA de entrada.
Mantenha o controle de entrada a menos 80 graus Celsius até descruzar e digerir etapas. Depois de testar os anticorpos para garantir sua especificidade para a proteína alvo, adicione o anticorpo aos tubos de imunoprecipitação e incubar a quatro graus Celsius durante a noite em uma roda giratória. Adicione 50 microliters de contas magnéticas proteína G e incubar a quatro graus Celsius em uma roda giratória por três horas.
Amarre as contas aos lados dos tubos usando um suporte magnético e realize lavagens. Lave duas vezes com 750 microliters de tampão de lavagem IP frio. Lave um com 750 microliters de tampão de lavagem IP frio dois.
E lave duas vezes com 750 microliters de TE frio em pH oito. Mantenha os tubos no suporte magnético durante as lavagens. Adicione 450 microliters de tampão de elução IP a cada tubo e incubar a 65 graus Celsius por 30 minutos com vórtice suave a cada cinco minutos.
Amarre as contas aos lados dos tubos usando um suporte magnético. Aguarde pelo menos dois minutos até que a solução esteja clara e, em seguida, dispense a solução limpa para um novo tubo de 1,5 mililitro. Para reverter os crosslinks e digerir RNA, adicione dois microgramas de RNase oito e adicione cloreto de sódio à sua concentração final de 0,3 molar em cada tubo.
Incubar a 65 graus Celsius por mais de seis horas ou durante a noite. Para digerir proteínas, adicione 180 microgramas de proteinase K a cada tubo e incubar a 45 graus Celsius por três a cinco horas. Purificar o DNA.
Contas magnéticas são preferidas para isolar as pequenas quantidades de DNA recuperadas durante o ChIP com células bacterianas. No entanto, a extração baseada em coluna ou fenilcloroforme pode recuperar adequadamente o DNA ChIP. Após a purificação, as bibliotecas são preparadas a partir de DNA ChIP purificado usando um kit compatível com a plataforma de sequenciamento selecionada.
As bibliotecas de DNA chIP geralmente requerem adicionar a quantidade mínima de adaptadores e realizar o número máximo de ciclos de amplificação pcr. Verifique o tamanho da biblioteca por um bioanalílise e verifique a concentração da biblioteca com um cubit ou um kit de quantificação da biblioteca QPCR. Acumule as bibliotecas e proceda com sequenciamento de acordo com a especificação da plataforma selecionada.
A análise dos dados do ChIP-seq requer pontuação de qualidade base, aparar bases de baixa qualidade, alinhar uma montagem de leituras a um genoma de referência, chamar picos, associar picos com genes e analisar motivos de ligação super-representados. Os dados chIP-seq geralmente têm um baixo nível de fundo. O DNA que é controlado pela proteína alvo da imunoprecipitação será enriquecido e aparecerá como picos que são pelo menos duas vezes acima do fundo.
Neste vídeo, descrevemos métodos para realizar ChIP-seq em biofilme salmonela e células planctônicas únicas que produzem picos de DNA enriquecido em genes controlados pelo fator de transcrição de interesse. Acredita-se que a maioria da vida bacteriana na natureza exista em biofilmes e até 40% das doenças humanas são consideradas relacionadas ao biofilme. Então eles têm enormes impactos médicos e econômicos.
No entanto, o biofilme é resistente e mais difícil de enumerar, abrir e manipular. Os pesquisadores podem usar as técnicas chip-seq que descrevemos para colher uma quantidade adequada de biofilme, homogeneizar o biofilme, células de lise, sonicato, realizar imunoprecipitação, purificar e sequenciar DNA de outras espécies bacterianas formadoras de biofilme.
