This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund&#8211;Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).

1. Manutenção da Mite População Aranha NOTA: Ácaros são criados na Califórnia feijão vermelho (Phaseolus vulgaris). <ol><li> Cultivar plantas a partir de sementes de feijão por 2-3 semanas antes da infestação. </li><li> Intermix essas plantas com plantas infestadas; ácaros adultos vão colonizar rapidamente o material vegetal fresco. </li><li> Remover velhas plantas de feijão infestados cada 7-10 dias, substituindo-os com plantas frescas. </li></ol> 2. Coleta Adulto Feminino Ácaros <ol><li> Mite coleção usando o método de lavagem <ol><li> Para a coleta de ácaros, coloque uma planta de feijão fresco em contato com plantas infestadas de 1 a 2 dias antes do experimento. </li><li> Utilize de 20 a 30 plantas de feijão frescos para coletar 1.000 a 2.000 ácaros adulto do sexo feminino. </li><li> Prepare uma solução de Tween 20 a 0,001%, utilizando a água da torneira à temperatura ambiente. </li><li> Lavar feijoeiro infestadas na solução de Tween 20, utilizando 2-3 plantas de cada vez. </li><li&gt; Cada planta é lavado 2-3x para coletar todos os ácaros das folhas. </li><li> Complete a etapa 2.1.4 dentro de 10 min para evitar a mortalidade dos ácaros. </li></ol></li><li> O isolamento da fêmea adulta ácaros por filtração da suspensão Mite através de peneiras de malha Tamanho Definido <ol><li> Preparar os seguintes peneiras de tamanhos de malha: 500 um (para remover os detritos) e 300 um (para recolher os ácaros adultos fêmeas) (Figura 1A). </li><li> Filtrar a suspensão através do crivo de 500 mM. </li><li> ReFilter a suspensão através da peneira de 300 mM. Ácaros fêmeas adultas serão retidos. </li><li> Mergulhe uma peneira 300 mm com ácaros fêmeas adultas em água corrente limpa para remover o Tween 20. </li><li> Espalhe ácaros em uma única camada na parte inferior da peneira. </li><li> Use papel toalha para remover o excesso de água da rede e dos lados da peneira. NOTA: Isso é feito porque os ácaros precisam secar rapidamente, a fim de se recuperar. </li><li> Preparar um conjunto tal como mostrado na Figura 1B; isso permitirá que os ácaros se mover livremente, mas vai impedi-los de escapar. </li><li> Coloque a peneira com ácaros no topo do crivo que é usado como um suporte. </li><li> Cerque-peneira de fundo com água para evitar os ácaros da dispersão. NOTA: Os ácaros vai começar a recuperar depois de cerca de 5 min. Após aproximadamente 30 minutos, o número de ácaros que se deslocam é suficiente para iniciar a recolha (Figura 1D). Ácaros devem ser recolhidos no prazo de 1 hora, como eles produzem seda que irá interferir com a coleção. </li></ol></li></ol> 3. Fábrica infestação com ácaros NOTA: Uma vez que os ácaros fêmeas adultas se recuperaram, eles podem ser usados ​​para a infestação de plantas. Há dois métodos utilizados para infestar as plantas experimentais com ácaros fêmeas adultas: a) usando um pincel fino (seção de protocolo 3.1) e b), utilizando uma bomba ou linha de vácuo (seção de protocolo 3.2). <ol><li> Mite Infestação usando uma escova NOTA: infestação do ácaro aranhacom uma escova é utilizado para a aplicação de até 30 ácaros para cada planta. <ol><li> Use uma escova de cabelo redonda arte suave de tamanho 00 ou mais fino. </li><li> Molhe a escova com água da torneira RT. </li><li> Gentilmente pegar ácaros da peneira usando a ponta do pincel e transferi-los para a planta. </li></ol></li><li> Infestação do ácaro usando uma bomba NOTA: infestação de plantas com ácaros coletados por uma linha de bomba / vácuo é utilizada quando mais de 30 ácaros são aplicadas. Para este método, uma bomba de vácuo para componentes microelectrónicos captador ou uma linha de vácuo pode ser usado. É importante manter o constante do fluxo de ar e uma resistência suficiente (2-4 psi). <ol><li> Anexar uma ponta de pipeta de 1 ml para o tubo que liga a linha da bomba de vácuo ou usando um corte de 1,5 ml tubo de centrífuga, na parte inferior, como um adaptador entre o tubo de bomba / vácuo e a ponta. </li><li> Coloque um pedaço de toalha de papel entre a ponta da pipeta e o adaptador (1,5 ml tubo de centrifugação). Nota: O objetivo deste é a ácaros armadilha dentro tele ponteira durante o processo de aspiração e também para reduzir o fluxo de ar (Figura 1C). </li><li> Colete ácaros diretamente da peneira usando a ponta da pipeta. </li><li> Alternativamente, recolher os ácaros, um por um a partir de folhas infestadas, usando um estereoscópio. </li><li> Quando foi recolhido o número necessário de ácaros, remover a ponta da pipeta a partir do tubo, fazendo com que o pedaço de toalha de papel na parte de trás da ponta da pipeta não é perturbada. </li><li> Colete ácaros tocando a ponta da pipeta e aglomeração dos ácaros juntos. Em seguida, coloque-os na folha; dentro de segundos, os ácaros vai começar a dispersar-se na folha. </li></ol></li></ol> 4. Gravação e avaliação dos danos Planta <ol><li> Danos às plantas de gravação NOTA: Para A. thaliana, planta dano é avaliada após 4 dias de alimentação do ácaro. O dano é registrada como a superfície total das manchas cloróticas. Para a medição de danos, toda a roseta é cortado e digitalizada.Parâmetros de verificação descritos são para um scanner Epson V30, mas vai agir como um bom ponto de partida para qualquer scanner de mesa similar. Mantenha parâmetros de digitalização constantes para todos os experimentos, permitindo a comparação entre experimentos corridas individuais. <ol><li> Cubra scanner com a folha de transparência para evitar a contaminação da superfície do scanner com material vegetal. </li><li> Corte uma roseta inteira e lugar na mesa do scanner para que lado adaxial (superior) de folhas estão enfrentando a fonte de luz do scanner e elemento de captura. Alternativamente, se rosetas são muito densos para capturar folhas individuais, sem sobreposição, dissecar a roseta em folhas individuais ou grupos de folhas que não se sobrepõem com uma tesoura fina antes de colocar na mesa do scanner. Vários rosetas podem ser digitalizados simultaneamente. </li><li> Cubra rosetas ou folhas com um pedaço de papel branco para evitar a adesão e contaminação da tampa do scanner. </li><li> Feche a tampa do scanner e executar uma varredura com os seguintes parâmetros: Resolução: 1,200 dpi; Modo de cor: Adobe RGB; Brilho: 25; Tipo de Arquivo: JPEG máxima qualidade. </li><li> Salve arquivos de imagem para análise de danos subseqüentes. </li></ol></li><li> Danos Planta Quantificação NOTA: A área de dano é calculado manualmente usando o Photoshop. Devido às grandes diferenças em forma de folha e a intensidade da cor dos sintomas, como resultado da alimentação de ácaro, métodos automáticos eram fiáveis. Assim, um método que serve para avaliar os danos planta: <ol><li> Abra a imagem da planta com Photoshop. </li><li> Crie uma nova camada, em seguida, sobrepor imagem digitalizada com uma grade de 0,25 mm x 0,25 mm divisões (Ver ou Display - Show - Grade, atalho de teclado Ctrl + &#39;). </li><li> Em uma camada sobreposta, marque área foliar danificada usando um ponto (use a ferramenta &quot;Pencil&quot;, atalho de teclado B). Usar um único ponto para cada quadrado da grelha abaixo dos quais não é o dano que cobre mais do que uma metade da unidade de grelha. O tamanho do ponto é definido em pixels (isto é, </em&gt; 52 pixels por ponto). </li><li> Quando todos os quadrados da grade que mostram danos às plantas que cubram pelo menos metade da unidade grade são marcados com um ponto, use a ferramenta histograma (Janela - Histograma) para determinar o número total de pixels na camada. A ferramenta permite que um histograma para medir o número de pixels. Uma vez que cada ponto é representado por um número constante e conhecida de pixels, a ferramenta histograma vai medir o número total de pixels, que representa o número total de pontos, e, por extensão, o número total de quadrados marcados. </li><li> Calcular o número de &quot;pontos&quot; marcadas por meio da seguinte fórmula: Número de pontos = número total de pixels / número de pixels por ponto. </li><li> Calcula-se a área total de lesões através da multiplicação do número de pontos marcados sobre a imagem da área de um quadrado da grelha, tal como um ponto corresponde a um quadrado da grelha. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mites injurious to economic plants. , (1975).</li><li>Migeon, A., Dorkeld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Mites+Web:+a+comprehensive+database+for+the+Tetranychidae.">Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae.</a> http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).</li><li>Croft, B. A., Vandebaan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+and+Genetic-Factors+Influencing+Evolution+of+Pesticide+Resistance+in+Tetranychid+and+Phytoseiid+Mites.">Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites.</a> Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).</li><li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+heteroplasmy+and+the+evolution+of+insecticide+resistance:+Non-Mendelian+inheritance+in+action.">Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).</li><li>Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+mechanisms+in+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae+and+other+important+Acari:+A+review.">Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review.</a> Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).</li><li>Dermauw, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+gene+family+of+Tetranychus+urticae:+Implications+for+acaricide+toxicology+and+a+novel+mutation+associated+with+abamectin+resistance.">The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance.</a> Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).</li><li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+bulk+segregant+mapping+uncovers+resistance+mutations+and+the+mode+of+action+of+a+chitin+synthesis+inhibitor+in+arthropods.">Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).</li><li>Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pair-rule+gene+homologues+in+a+chelicerate:+early+patterning+of+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae.">Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae.</a> Development. 129, 5461-5472 (2002).</li><li>Khila, A., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+the+spider+mite+Tetranychus+urticae:+dsRNA+and+siRNA+parental+silencing+of+the+Distal-less+gene.">Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene.</a> Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).</li><li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mity+model:+Tetranychus+urticae,+a+candidate+for+chelicerate+model+organism.">Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).</li><li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Tetranychus+urticae+reveals+herbivorous+pest+adaptations.">The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations.</a> Nature. 479, 487-492 (2011).</li><li>Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+quantitative+trait+loci+controlling+glucosinolates,+myrosinase+and+insect+resistance+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 161, 325-332 (2002).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+jasmonate+in+response+and+tolerance+of+Arabidopsis+to+thrip+feeding.">Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding.</a> Plant &amp; cell physiology. 49, 68-80 (2008).</li><li>Whiteman, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plant-herbivore+interface+with+a+leafmining+Drosophila+of+Arabidopsis.">Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis.</a> Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).</li><li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).</li><li>Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+indole+glucosinolate+breakdown+products+with+antifeedant+effects+on+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid).</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).</li><li>Adio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+defensive+function+of+Ndelta-acetylornithine,+a+jasmonate-induced+Arabidopsis+metabolite.">Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite.</a> Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+homolog+of+CORONATINE-INSENSITIVE1+is+required+for+the+maternal+control+of+seed+maturation,+jasmonate-signaled+defense+responses,+and+glandular+trichome+development.">The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development.</a> Plant Cell. 16, 126-143 (2004).</li><li>Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+of+spider+mite-induced+direct+and+indirect+defenses+in+tomato+plants.">Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants.</a> Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este vídeo demonstra protocolos utilizados para isolar e infestam plantas com grandes números de ácaros fêmeas adultas. Embora nós apresentamos esse protocolo usando A. thaliana, ele pode ser usado para qualquer sistema de interação planta-ácaro aranha e atualmente está sendo aplicado com sucesso também em plantas de tomateiro e videira (Vitis vinifera). Os rendimentos de protocolo de resultados reprodutíveis, indicando que os ácaros coletados são do estado fisiológico comparável <strong...

Interação planta-praga é um tema de grande importância científica e econômica. Foi estudado historicamente usando as duas plantas de cultivo (como o tomate) e da planta modelo, A. thaliana. Em ambos os casos, a suscetibilidade da planta de herbívoros pode ser medido diretamente por meio de avaliação de fenótipo da planta após o ataque herbívoro ou indiretamente, por meio da avaliação do desempenho de pragas. Medidas diretas de suscetibilidade da planta foram utilizados anteriormente para um número de espécies de insetos-praga usando uma variedade de métodos. Por exemplo, pragas de larvas de lepidópteros é medido como uma estimativa da porção de tecido da planta consumida por qualquer Plutella xylostella (traça de Diamondback) ou Trichoplusia ni (lagarta da couve), a olho nu, com a ajuda de uma grelha 12. Além disso, existem métodos que utilizam a imagem digital de dano foliar com posterior análise de imagem quantitativa. Tais métodos foram utilizados emestudos de A. interação thaliana com Frankliniella occidentalis (tripes flor ocidentais) 13, Scaptomyza flava (drosófila folha de mineração) 14, e T. ni 15. As medidas indiretas de suscetibilidade da planta são amplamente utilizados em estudos de interação planta-praga. Por exemplo, a susceptibilidade de A. thaliana de pêssego pulgão Myzus persicae herbivoria normalmente é avaliada através da análise de fecundidade pragas e descrição da morfologia de uma planta após interação 16,17. Outro indicador indirecto típico de A. thaliana suscetibilidade à praga é uma avaliação de peso seco ou molhado do herbívoro. Este parâmetro é utilizado para caracterizar a herbivoria de lepidoterans, como Pieris rapae (pequeno branco), P. xylostella, ou T. ni em seu larval ou de pupa encena 15,17. Ácaros são-conteúdo da célula feEders. Induzida por danos Mite é reconhecida como uma coleção de manchas cloróticas que variam em cor do branco ao verde pálido. A susceptibilidade de uma planta hospedeira para ácaro herbivoria foi previamente avaliada quer indirectamente através da análise de desempenho ácaro dias pós-infestação 18,19, ou diretamente usando morfologia de plantas semanas pós-infestação de 18 ou usando uma imagem digital de folhas expostas aos ácaros por dias com posterior análise de imagem automatizado 19. Estes métodos foram sendo desenvolvidos e utilizados para estudos de interações entre plantas de tomate e T. urticae, e normalmente usado um pequeno número de ácaros (5-15 por tratamento) que foram coletados a partir da população de ácaros mista e foram colocados na superfície da folha, utilizando uma escova de cerdas macias. No entanto, estes métodos não são adequados para estudos em que um maior número de ácaros precisam de ser aplicados. Além disso, durante o processamento direto de imagens de folhas de software de análise de imagemcomo o Adobe Photoshop (San Jose, CA) ou ImageJ 20 pode ser utilizado para a análise de danos tomate, estes protocolos de modificação precisa, a fim de ser aplicado a folhas, que têm uma maior reflectividade da superfície ou são levemente coloridas e possuem tricomas altamente visíveis ( por exemplo, A. thaliana) que interferem com a seleção automática de manchas cloróticas que marcam danos às plantas. Além disso, a fase de desenvolvimento de ácaros que podem ser facilmente utilizados com os métodos anteriores, é limitada às fêmeas adultas mais prevalentes e facilmente identificáveis ​​e opõe-se a utilização de outras fases de desenvolvimento. O primeiro passo crítico para análise de alto rendimento de interação planta-ácaro aranha é estabelecer, protocolos simples e robustas reprodutíveis para desafiar plantas com ácaros e confiável avaliar os resultados de interação. Neste vídeo, um método eficiente para a coleta rápida e fácil de um grande númemero de ácaros fêmeas adultas, a sua aplicação em uma planta hospedeira experimental ea avaliação dos danos planta devido à alimentação ácaro são descritos. O protocolo apresentado permite a recolha rápida e eficiente de centenas de pessoas, em qualquer estádio de desenvolvimento (ovos, larvas, ninfas, machos adultos e fêmeas) que pode ser utilizado para aplicação experimental subsequente. Além disso, estes protocolos podem ser aplicados a qualquer planta hospedeira ácaro, mas são especificamente demonstrado no caso de A. thaliana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1157">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:231px;">Plant material:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">California red kidney bean</td>
			<td style="width:275px;">Stokes, Thorold, ON, Canada</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:231px;">Chemicals:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P9416</td>
			<td style="width:527px;">1% stock solution is prepared to simplify aliquoting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tap water</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:231px;">Other materials and equipment:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Plastic tray</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Set of scissors</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">2 L beakers</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Paper towels</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sets of sieves</td>
			<td style="width:275px;">Manufactured in house</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Detailed instructions are available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Thin brush</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Pipettes</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Pipette tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">0.2 and 1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Air pump</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Stereoscope</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td style="width:125px;">V30</td>
			<td style="width:527px;">Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Computer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td style="width:125px;">NA</td>
			<td style="width:527px;">Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Adobe Photoshop software</td>
			<td style="width:275px;">Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA</td>
			<td style="width:125px;">various</td>
			<td style="width:527px;">Any version with Histogram tool included.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of two-spotted spider mite tetranychus urticae for plant-pest interaction studies

O ácaro-rajado, Tetranychus urticae, é um herbívoro de artrópodes polífagas onipresente que se alimenta de uma notavelmente ampla gama de espécies, com mais de 150 de valor econômico. É uma das principais pragas das culturas de estufa, especialmente em Solanaceae e Cucurbitaceae (por exemplo, tomates, beringelas, pimentos, pepinos, abobrinha) e plantas ornamentais de efeito estufa (por exemplo, rosas, crisântemos, cravos), culturas anuais (como o milho, o algodão, soja e açúcar de beterraba) e em culturas perenes (alfafa, morangos, uvas, frutas cítricas, e ameixas) 1,2. Além do polyphagy extremo que torna uma importante praga agrícola, T. urticae tem uma tendência para desenvolver a resistência a uma vasta gama de insecticidas e acaricidas que são usados ​​para o seu controlo 3-7. T. urticae é um excelente organismo experimental, uma vez que tem um ciclo de vida rápido (7 dias a 27 ° C)e podem ser facilmente mantidas a uma densidade elevada no laboratório. Métodos de Ensaio para a expressão do gene (incluindo a hibridização in situ e a coloração do anticorpo) e para inactivar a expressão dos genes endógenos de ácaros de aranha com RNA de interferência foram desenvolvidos 8-10. Recentemente, toda a seqüência do genoma de T. urticae foi relatado, criando uma oportunidade para desenvolver este herbívoro de pragas como um organismo modelo com recursos equivalentes genômicos que já existem em algumas de suas plantas hospedeiras (Arabidopsis thaliana eo Solanum lycopersicum tomate) 11. Juntos, esses organismos modelo pode fornecer insights sobre bases moleculares das interações planta-praga. Aqui, um método eficiente para a coleta rápida e fácil de um grande número de ácaros adultos do sexo feminino, a sua aplicação em uma planta hospedeira experimental ea avaliação dos danos planta devido à alimentação ácaro são descritos. O protocolo apresentado enables recolha rápida e eficiente de centenas de pessoas, em qualquer estádio de desenvolvimento (ovos, larvas, ninfas, machos adultos e fêmeas) que pode ser utilizado para aplicação experimental subsequente.

Usando 20 a 30 plantas de feijão infestados, pode-se coletar cerca de 2.000 ácaros adulto do sexo feminino usando peneiras. O tempo necessário para infestar 10 plantas com 20 ácaros por planta é de aproximadamente 15 minutos se estiver usando um pincel para transferir ácaros. Combinações de coleta e os métodos de aplicação são mostrados na Figura 2. Este protocolo gera resultados reprodutíveis de danos às plantas, demonstrando que os ácaros coletados são do e...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies at JoVE.com

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Protocolos para preparação eficiente de amostras homogêneas de ácaros, infestação de plantas experimentais e avaliação de danos às plantas, como requerido para estudos de interação planta-praga foram desenvolvidos.

Aplicação de duas avistou Ácaro<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; De Estudos Planta-praga de Interação

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

application-two-spotted-spider-mite-tetranychus-urticae-for-plant

Research

JoVE Journal

Environment

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

17.6K visualizações.  The University of Western Ontario.  Protocolos para preparação eficiente de amostras homogêneas de ácaros, infestação de plantas experimentais e avaliação de danos às plantas, como requerido para estudos de interação planta-praga foram desenvolvidos. 

Vídeo: Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with specific functions (e.g. carbon sequestration, soil quality improvements, or contaminant sorption). In 2013, the International Biochar Initiative (IBI) made publically available their Standardized Product Definition and Product Testing Guidelines (Version 1.1) which set standards for physical and chemical characteristics for biochar. Six biochars made from three different feedstocks and at two temperatures were analyzed for characteristics related to their use as a soil amendment. The protocol describes analyses of the feedstocks and biochars and includes: cation exchange capacity (CEC), specific surface area (SSA), organic carbon (OC) and moisture percentage, pH, particle size distribution, and proximate and ultimate analysis. Also described in the protocol are the analyses of the feedstocks and biochars for contaminants including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), metals and mercury as well as nutrients (phosphorous, nitrite and nitrate and ammonium as nitrogen). The protocol also includes the biological testing procedures, earthworm avoidance and germination assays. Based on the quality assurance / quality control (QA/QC) results of blanks, duplicates, standards and reference materials, all methods were determined adequate for use with biochar and feedstock materials. All biochars and feedstocks were well within the criterion set by the IBI and there were little differences among biochars, except in the case of the biochar produced from construction waste materials. This biochar (referred to as Old biochar) was determined to have elevated levels of arsenic, chromium, copper, and lead, and failed the earthworm avoidance and germination assays. Based on these results, Old biochar would not be appropriate for use as a soil amendment for carbon sequestration, substrate quality improvements or remediation.

Biochar is a carbon-rich material used as a soil amendment with the ability to sustainably sequester carbon, improve substrate quality and sorb contaminants. This protocol describes the 17 analytical methods used for the characterization of biochar, which is required prior to large scale implementation of these amendments in the environment.

Física, química e biológica dos Seis biochars produzido para a remediação de áreas contaminadas

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

Ambiente

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Caracterização e aplicação de amostradores passivos de monitorização de pesticidas em água

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Limpo Amostragem e Análise do Rio e Estuarina Waters de Estudos de metal de rastreamento

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Remote Sensing Evaluation of Two-spotted Spider Mite Damage on Greenhouse Cotton

The objective of this study was to evaluate a ground-based multispectral optical sensor as a remote sensing tool to assess foliar damage caused by the two-spotted spider mite (TSSM), Tetranychus urticae Koch, on greenhouse grown cotton. TSSM is a polyphagous pest which occurs on a variety of field and horticultural crops. It often becomes an early season pest of cotton in damaging proportions as opposed to being a late season innocuous pest in the mid-southern United States. Evaluation of acaricides is important for maintaining the efficacy of and preventing resistance to the currently available arsenal of chemicals and newly developed control agents. Enumeration of spider mites for efficacy evaluations is laborious and time consuming. Therefore, subjective visual damage rating is commonly used to assess density of spider mites. The NDVI (Normalized Difference Vegetation Index) is the most widely used statistic to describe the spectral reflectance characteristics of vegetation canopy to assess plant stress and health consequent to spider mite infestations. Results demonstrated that a multispectral optical sensor is an effective tool in distinguishing varying levels of infestation caused by T. urticae on early season cotton. This remote sensing technique may be used in lieu of a visual rating to evaluate insecticide treatments.

This manuscript describes a multispectral optical sensor that effectively detected damage to early season cotton artificially infested with varying densities of the two-spotted spider mite populations.

Avaliação de Sensoriamento Remoto do Dois-manchada danos Aranha Mite em Cotton Greenhouse

The objective of this study was to evaluate a ground-based multispectral optical sensor as a remote sensing tool to assess foliar damage caused by the ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropod populations in rice. When used in combination with an enclosure, application of this sampling device provides absolute estimates of the populations of arthropods as numbers per standardized sampling area. The sampling efficiency depends critically on the sampling duration. In a mature rice crop, a two-minute sampling in an enclosure of 0.13 m2 yields more than 90% of the arthropod population. The device also allows sampling of arthropods dwelling on the water surface or the soil in rice paddies, but it is not suitable for sampling fast flying insects, such as predatory Odonata or larger hymenopterous parasitoids. The modified blower-vac is simple to construct, and cheaper and easier to handle than traditional suction sampling devices, such as D-vac. The low cost makes the modified blower-vac also accessible to researchers in developing countries.

Assessment of arthropod abundance in crops is critical for investigating population dynamics and species interactions. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropods in rice.

Modificação e Aplicação de uma Folha Blower-vac para Campo Amostragem de Artrópodes

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Vegetated Treatment Systems for Removing Contaminants Associated with Surface Water Toxicity in Agriculture and Urban Runoff

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may be treated with simple systems designed to promote sorption of contaminants to vegetation and soils and promote infiltration. Two example systems are described: a bioswale treatment system for urban stormwater treatment, and a vegetated drainage ditch for treating agriculture irrigation runoff. Both have similar attributes that reduce contaminant loading in runoff: vegetation that results in sorption of the contaminants to the soil and plant surfaces, and water infiltration. These systems may also include the integration of granulated activated carbon as a polishing step to remove residual contaminants. Implementation of these systems in agriculture and urban watersheds requires system monitoring to verify treatment efficacy. This includes chemical monitoring for specific contaminants responsible for toxicity. The current paper emphasizes monitoring of current use pesticides since these are responsible for surface water toxicity to aquatic invertebrates.

This article summarizes the design attributes and the effectiveness of treatment systems that treat urban stormwater and agriculture irrigation runoff to remove pesticides and other contaminants associated with aquatic toxicity.

Vegetated Sistemas de Tratamento para Remoção de Contaminantes Associados à Toxicidade de Águas Superfícies na Agricultura e Escorrências Urbanas

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are also a useful scientific model to study motion vision and flight dynamics in a controlled laboratory setting. As the larvae develop in organically polluted water, they are useful models for investigating investment in microbial immunity. While large scale commercial breeding for agriculture already occurs, there are no standardized protocols for maintaining captive populations for scientific studies. This is important as commercial captive breeding programs focusing on mass output during peak pollination periods may fail to provide a population that is consistent, stable and robust throughout the year, as is often needed for other research purposes. Therefore, a method to establish, maintain and refresh a captive research population is required. Here, we describe the utilization of an artificial hibernation cycle, in addition to the nutritional and housing requirements, for long term maintenance of Eristalis tenax. Using these methods, we have significantly increased the health and longevity of captive populations of E. tenax compared to previous reports. We furthermore discuss small scale rearing methods and options for optimizing yields and manipulating population demographics.

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

The overall goal of these procedures is to establish, maintain and refresh a captive population of Eristalis tenax in a research setting.

Criação e manutenção de longo prazo de Eristalis tenax Hoverflies para estudos de investigação

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocolo experimental pela análise de perfis de resposta comportamental em peixes Larval: aplicação para a Neuro-estimulantes cafeína

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is an accumulating evidence showing that the expressions of certain miRNAs are altered when grafting, an agricultural practice commonly used by farmers to improve crop tolerance to biotic and abiotic stresses. Bottle gourd is an inherently climate-resilient crop compared to many other major cucurbits, including watermelon, rendering it one of the most widely used rootstocks for the latter. The recent advancement of high-throughput sequencing technologies has provided great opportunities to investigate cold-responsive miRNAs and their contributions to heterograft advantages; yet, adequate experimental procedures are a prerequisite for this purpose. Here, we present a detailed protocol for efficiently generating homo- and heterografts between the cold-susceptible watermelon and the cold-tolerant bottle gourd, in addition to methods of tissue sampling, data generation, and data analysis. The presented methods are also useful for other plant-grafting systems, to interrogate miRNA regulations under various environmental stresses, such as heat, drought, and salinity.

Here we present a detailed protocol for efficiently making homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd, in addition to methods of tissue sampling, data generation, and data analysis, for the investigation of cold-responsive microRNAs.

Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...