We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

NOTA: O seguinte procedimento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Monash e conduzida de acordo com o Código brasileiro de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Científicos (2006). Fêmea Adulta C57BL / 6 utilizados para gerar os resultados representativos foram obtidos a partir dos Serviços Animais Monash. Os ratinhos foram alojados em um agente patogénico livre, a temperatura e humidade ambiente específico controlado com um ciclo de luz-escuro de 12 h. Estes ratos tiveram livre acesso a comida e água. 1 Configuração inicial <ol><li> Conecte o laptop / desktop para a máquina de aquisição de dados para a gravação através de um cabo USB. </li><li> Ligue o amplificador de Ponte de &#39;saída de 1 &quot;a&quot; entrada 1 &quot;da máquina de aquisição de dados através de um cabo BNC. </li><li> Insira o transdutor de pressão em &quot;Canal 1&quot; da Octal Ponte Amp. Desligue a máquina de aquisição de dados e abra o software de análise. O software deve autocamente detectar a configuração do equipamento (ver tabela de materiais e equipamentos). </li><li> Configurações de canal aberto encontrados na barra de ferramenta de configuração do software. Alterar o número de canais que estão sendo gravados para um. </li><li> Configure o barómetro para medir a pressão do quarto e do aparelho de coluna de água para calibrar o amplificador Bridge. O aparelho de coluna de água inclui duas pipetas de seringa de 5 ml serológicos ligados por um tubo de plástico. </li><li> Preencha as colunas com água e garantir os níveis de água são equilibradas com uma régua. Conectar um pedaço de tubo de plástico de topo de cada pipeta. Figura 2 mostra a coluna de água definida acima. </li></ol> 2. Calibração Amplificador Ponte Nota: Para calibrar o amplificador de ponte de uma injecção de ar para dentro da coluna de água é necessária para criar a 1 cm de H 2 O de deflexão. Isto irá ocorrer sob um único conjunto de condições e é dependente do aparelho do utilizador. Para esclarecimento destes passos demonstrate como este laboratório seria realizar a calibração. <ol><li> Retirar uma seringa de 1 ml para 300 ul; fixar a seringa para a torneira de passagem no final do tubo, do lado direito da coluna de água. NOTA: Verifique se a torneira está aberta para a seringa e da coluna de água e fechado para o ar ambiente. Se o nível de água não está em equilíbrio, neste ponto, virar a torneira para que ele seja aberto ao ar ambiente, e a coluna de água, isso vai reequilibrar a água. A tubagem do lado esquerdo da coluna de água deve ser ligada ao transdutor de pressão para medir a alteração da pressão induzida pela queda da seringa. </li><li> Conecte o tubo da coluna de água, no lado esquerdo para o conector do transdutor de pressão (anel superior do transdutor). </li><li> Selecione o menu de rolagem para baixo encontrado próximo ao canal 1 para a tela principal, no lado direito do software e selecione &quot;amp Bridge&quot; (ver tabela de materiais e equipamentos). </li><li> Digiteas configurações a 5 mV, 20 Hz passa-baixa, marque a caixa &#39;invertido&#39; e clique em &quot;zero&quot;. Clique em &quot;zero&quot; para definir o traço em ~ 0 mV. Reduzir o tamanho da janela para 4: 1 para facilitar a visualização. </li><li> Com tudo configurado, pressione a seringa de 1 ml, deixando-o por 3 s. Isto irá mostrar um aumento repentino no software, porque a pressão mudou. Quando os 300 ul é pressionado, a pressão vai passar a água na coluna de água de 1 cm. Este valor conhecido vai ajudar a calibrar o amplificador Bridge. NOTA: O aumento da pressão na câmara devido à depressão 300 ul corresponde ao valor P K usado para cálculos posteriores. </li><li> Escolha das unidades de entrada &#39;encontrado no canto inferior esquerdo da janela do Bridge Amp. </li><li> Realce o &quot;traço fundo&quot; antes do pico também conhecido como o &#39;Zero Região &quot;. <ol><li> Clique na seta ao lado de &quot;ponto 1&quot; e isso vai produzir o background sinal no intervalo de -0,002 0,002 mV-mV (o valor nunca será exactamente a 0 mV). </li><li> Tipo &quot;0&quot; na janela adjacente à janela de sinal de fundo. </li></ol></li><li> Destaque a &quot;região pressão aumentou de gráfico&quot; a partir de quando a seringa é deprimido. Clique na seta ao lado do ponto 2 eo valor deve estar no intervalo de 0,9-1,2 mV. <ol><li> Tipo &quot;1&quot; na janela ao lado da janela &quot;aumento da pressão&quot;. Para um esclarecimento visual passos 2.7 e 2.8, consulte a Figura 3. Valores encontrados fora dos limites especificados pode indicar danos ao Octal Ponte Amp. </li></ol></li><li> Ir para &quot;definir as unidades &#39;encontrado no canto superior direito da janela e selecione&quot; cmH 2 O &quot;. Se esta opção não estiver disponível, podem ser introduzidos manualmente. Clique em OK. </li><li> Voltar para o menu do &#39;Ponte Amp &quot;(vide 2.1). Selecione 1 mV e definir amplificador para &quot;zero&quot;;. Isto irá completar a calibração e da coluna de água pode ser removido com segurança. </li></ol> Função 3 Gravação Lung <ol><li> Pesa-se o rato (g). NOTA: Uma semana antes da avaliação fisiológica introduzir o mouse para o ambiente de câmara pletismografia. Isso vai ajudar na aclimatação e reduzir o estresse ao realizar este procedimento em uma data posterior. Para um esquema geral que demonstra a configuração UWBP, por favor, consulte a Figura 4. </li><li> Medir a temperatura do corpo com um termômetro retal. Lubrifique o termômetro com vaselina antes da inserção. Gravar a leitura da temperatura do lubrificante e limpar-se com 80% (v / v) de etanol. Se usar muito pequenos animais, como filhotes de rato recém-nascidos, o valor médio da temperatura corporal pode ser determinada com um termômetro infra-vermelho em seu lugar. </li><li> Coloque a sonda de umidade / temperatura relativa no final de um buraco da câmara de pletismografia. Registre a temperatura, umidade e barometric pressão dentro da câmara de pletismografia, antes de colocar o rato dentro. </li><li> Posicione o mouse na câmara de pletismografia, cobrir a extremidade aberta ligeiramente. Isso permite que o mouse para aclimatar. Feche a câmara. </li><li> Com a sonda de temperatura / humidade inserido na parte lateral da câmara de pletismografia com um furo, agora introduzir a seringa no transdutor e do outro lado com os dois orifícios. </li><li> Pressione &#39;Start&#39; no programa de software e registro de aproximadamente 15-45 seg. Recorde 5-10 seg de dados onde o animal não estiver em movimento. Movimento de vai alterar basal fisiologia respiratória do animal e fornecer maus resultados. A respiração deve oscilar num movimento linear no programa. Estes dados são utilizáveis. Nota: urinar ou defecar pode levar a um aumento da temperatura e humidade no interior da câmara de pletismografia. Isto irá obscurecer resultados durante a análise. Em caso de urinar ou defecar, parar a gravação imediatamente e limpar o plethysmography câmara com 80% (v / v) de etanol. Consulte a Figura 6 para uma representação visual de resultados abaixo do ideal, onde os dados devem ser rejeitados. </li><li> Após a gravação de 45 segundos, pressione &quot;Stop&quot; no software (ver tabela de materiais e equipamentos) programa. Remover o rato da câmara de pletismografia e gravar imediatamente a temperatura ea umidade câmara. Não gravar continuamente por mais de 45 segundos, pois isso pode estressar o animal. </li><li> Retorne o mouse para sua gaiola, spray e limpe a câmara com 80% (v / v) de etanol. </li><li> Permitir que a câmara para secar e voltar à temperatura e humidade de linha de base, antes de prosseguir para o próximo rato. Repita os passos de 3,1-3,9 para animais subsequentes. Nota: Se vários animais estão sendo estudados, garantir que a temperatura da câmara e retorno aos valores basais umidade perto antes de cada novo animal é colocado na câmara. </li></ol> 4 Análise pletismografia Nãote: Para calcular os parâmetros respiratórios, como volume corrente (V T) e volume minuto as seguintes variáveis ​​precisam ser mensurados: freqüência respiratória (respirações / min), a respiração total de tempo de ciclo (seg), inspiração / expiração tempo (Ti / Te, segundos) e alteração na pressão devido a cada volume corrente (P T). figura 1 ilustra as variáveis ​​que podem ser medidos a partir de um traço. Os passos seguintes utilizam um software (ver materiais e equipamentos de mesa) para medir essas variáveis. Ao analisar, evite regiões do traço contendo cheirar ou movimento. Para obter resultados reproduzíveis, pelo menos, 5 segundos de boa traço respiração é necessária. Para um exemplo de diferentes traços de respiração consulte a Figura 5 e 6. <ol><li> Abra a tela para tela cheia, defina vista a 1: 1 e selecionar 5 seg de dados utilizáveis. Um instantâneo representativo disto é mostrado na Figura 5. </li><li> Abra a janela de mini-pad dados encontrado na parte superior do programa na aba Datapad. Escolha o canal 1 e selecione &#39;medições de ciclo&#39; na coluna da esquerda e &#39;height cíclica média&#39; na coluna da direita. <ol><li> Selecione &#39;Opção&#39; e definir a escala para a detecção de pico mínima de 1 (ms). Isto irá permitir a detecção de todos os valores de pico e torna-se extremamente importante na utilização de pequenos animais que produzem pequenas oscilações. </li><li> Clique em &#39;OK&#39;. Isto irá apresentar «deformação Pressão devido a cada volume corrente&quot; medida (P T). </li></ol></li><li> No bloco de dados mini, selecione &#39;medições de ciclo &quot;seguido de&quot; contagem de eventos&#39; e clique em &#39;OK&#39;. Isto irá apresentar o «frequência» (f) medição. <ol><li> Frequência precisa de ser convertido em respirações / min. Isto é feito através da multiplicação do valor por 60 seg e dividindo a resposta pelo tempo total de gravação (min). </li></ol></li><li> No bloco de dados mini, selecione &#39;cymedições cle &#39;seguido de&#39; período &#39;e clique em&#39; Ok &#39;. Isto irá apresentar o &quot;tempo total do ciclo de respiração &#39;(T tot, sec) de medição. </li><li> Os próximos passos são usados ​​para criar um macroinstruction para gerar inspiração e expiração valores de tempo de pico. Verifique se o cursor estiver diretamente sobre o máximo do pico / cocho e adicionar um comentário em 9 picos seqüenciais e depressões. Comece com o pico da oscilação, como mostrado na Figura 5. </li><li> Posteriormente, selecione janela: Almofada de dados e coluna 1 Na janela que aparecer, clique em &quot;informações de seleção&quot; na coluna da esquerda, &quot;duração&quot; na coluna da direita e clique em &#39;OK&#39;. </li><li> Selecione macro encontrada na parte superior do programa e, em seguida, iniciar a gravação. Agora selecione comandos: &#39;Encontrar&#39;, &#39;Go&#39;, &#39;Start of File &quot;e clique em&#39; Pesquisar &#39;. </li><li> Selecione os comandos: &#39;Find&#39; e &#39;Find comentários&#39;. Digite a mesma frase digitada para a caixa de comentário na caixa &#39;contendo&#39; fornecido. Escolha o &#39;Selecione a ponto anterior&#39; guia e &#39;Pesquisar&#39;. </li><li> Selecione os comandos: &quot;Adicionar ao bloco de dados&quot;. Em seguida, selecione macro: comandos de macro e começar a repetir. A janela de contagem de repetição que aparece deve ser fixado em 9. </li><li> Selecione o comando: &#39;Encontrar próximo&#39;. Escolha um comando: &quot;Adicionar ao bloco de dados&quot;. Finalmente, selecione comandos de macro e final da repetição. <ol><li> Agora, selecione a macro e parar a gravação. Salve e nomeie a macro depois que o número de animais. NOTA: A configuração do macro para cada animal permite que a macro a ser utilizado para estudos longitudinais e economiza tempo. </li></ol></li><li> A macro agora pode ser executado para obter o Inspiration (T i) e expiração (T e) tempo entre cada comentário. Os dados serão exibidos em canal 1 da datapad. Expiração e inspiração ocorre consecutivamente e os dados aparecerão nesta ordem. <ol><li> Os dados precisam ser divididas manualmente em valores de inspiração e expiração. Calcule a média dos quatro valores de dados de cada parâmetro para se obter a média i o t e t e. </li></ol></li><li> Uma vez que os valores primários foram derivados do volume corrente (V T, ml) pode ser calculado. Para obter o volume corrente a equação de Drorbaugh Fenn e 8 é usado: V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((temperatura central (P B - P C)) / (temperatura central (P B - P C) - T C (P B - P CORE))) Onde V T: Volume Tidal P k: desvio de pressão devido a cada injeção de 1 ml (Consulte o passo 2.5) T core: temperatura do núcleo de cada animal P C: pressão de vapor de água na câmara de temperatura X Umidade relativa em chamber T C: temperatura na câmara de animais P central: Pressão à temperatura do corpo (pressão do vapor de água à temperatura do corpo x 1.0) P t: desvio de pressão devido a cada volume corrente V k: Volume de injeção para a calibração P B: pressão barométrica </li><li> Uma vez que o volume corrente tem sido calculados os seguintes parâmetros também podem ser determinados: <ul><li> Volume minuto (ml / min) = V T xf </li><li> Volume minuto (ml / min / kg) = (V xf T) / Peso corporal (kg) </li><li> V T (ml / kg) = V T (ml) / peso do corpo (kg) </li><li> Ciclo inspiratória (%) = T i / T tot </li><li> Inspiratória Vazão (ml / seg) = V T / T i </li><li> Proporção de tempo de inspiração para tempo de expiração = T i / T e </li><li> O tempo total do ciclo (sec) = tempo de Inspiração (s) + tempo de expiração (seg) </li></ul></li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing interests. The authors have no conflicts to disclose.

A técnica descrita aqui é um método não-invasivo para avaliação de parâmetros respiratórios de ratos sem restrições e não anestesiados. Os pontos fortes deste protocolo incluem sua simplicidade e precisão para medir a função pulmonar longitudinalmente com artefatos mínimos. Existem, no entanto, algumas limitações e passos críticos para ser notado sobre o procedimento. Em primeiro lugar e mais importante, o mouse deve manter a calma dentro da câmara por um período mínimo de cinco segundos. Adicionado...

A disfunção pulmonar é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. A condição é caracterizada por troca de oxigênio inadequada, sinônimo de tosse, dores no peito e dispnéia. Contas de doença respiratória para ~ 10% de mortalidade em todo o mundo 1. Segundo a Organização Mundial de Saúde, as taxas de mortalidade são definidos a subir devido à persistência do tabagismo, poluição e irritantes ocupacionais. UWBP é uma adição útil para o estudo da fisiologia pulmonar, que complementa fortemente bioquímicos tradicionais e análises histológicas 2. Outros procedimentos utilizados para a avaliação de pulmão não oferecem as mesmas vantagens que UWBP. Pletismografia invasiva é uma técnica comumente utilizada, que exige que o animal seja anestesiado 3,4 e, portanto, as medidas respiratórias decorrentes não são necessariamente reflexo de um estado natural. Além disso, a exigência de desafios de ventilação mecânica e química impede futuras medições 3,4.Outro método de coleta de dados respiratória é de oscilações forçadas, o que é mais sensível às mais refinadas alterações nos parâmetros respiratórios em comparação com UWBP 5. Oscilação forçada é, no entanto, uma técnica invasiva e requer terminação dos animais para coleta de dados 5-7. UWBP envolve a colocação de um animal dentro de uma câmara especializada. Durante a inspiração, o ar é aquecido de maré e humidificado dentro dos pulmões aumento da pressão do vapor de água e faz com que a expansão térmica do gás 8. Este efeito provoca uma alteração líquida no volume de ar criando um aumento da pressão no interior da câmara 8 pletismógrafo. O oposto ocorre durante a expiração criar uma forma de onda respiratória do animal. Análise de forma de onda é, então, usado para medir a partir do traço respiratória: freqüência respiratória (respirações / min), tempo total do ciclo respiratório (seg), inspiração / expiração tempo (Ti / Te, sec) e alterações na pressão devido a cada volume corrente (P T). <strong&gt; A figura 1 ilustra cada origem medições de um rastreio respiratório. Estas medições são simples de calcular e vários parâmetros respiratórios podem ser derivadas a partir destas medições. Estes parâmetros incluem: O volume corrente (o volume de ar deslocado entre a inalação e exalação normal), volume minuto (volume de gás inalado pelos pulmões por minuto), ciclo inspiratório (a percentagem de tempo de inspiração para a duração total do ciclo de respiração) e taxa de fluxo inspiratório (a quantidade de ar inspirado em um dado momento). UWBP fornece uma análise precisa, não-invasiva, quantitativa da fisiologia respiratória em modelos animais e pode ser utilizada para medir a progressão da doença respiratória e função pulmonar 6,9. Ao contrário de outras técnicas de pletismografia, UWBP evita o uso de anestesia, restrições e manipulações invasivas que produzem artefatos e experimental 6,9 variabilidade. A anestesia pode suprimir a respiração,alterar a freqüência cardíaca e pode ser um desafio para regular 10. Restrições induzir um aumento na respiração devido ao estresse adicional via corticosterona e adrenalina liberar 11,13. A principal característica do UWBP é repetido avaliação fisiológica tornando-se passíveis de estudos longitudinais. UWBP é altamente recomendável para a avaliação longitudinal de fisiologia pulmonar e oferece uma valiosa habilidade para futura avaliação do medicamento respiratório. Bleomicina, ovalbumina, e hipoxia têm sido utilizados para induzir desafios respiratórias em diversos estudos e UWBP mediu sucesso pulmão precisas avaliação fisiológica 7,9,13-16. O protocolo descrito foi concebido para ratos de laboratório normais de adultos. No entanto, UWBP foi adaptado a outros animais tais como ratos, cobaias, e primatas não-humanos 17-20. UWBP não se restringe apenas à avaliação da disfunção pulmonar, mas também tem sido utilizada para a avaliação da maturação pulmonar 3.A versatilidade, simplicidade e reprodutibilidade dos UWBP estabeleceram uma excelente técnica para avaliar a função pulmonar em animais. Software Vários (ver materiais e equipamentos de mesa) serão obrigados a seguir este procedimento. Um cientista experiente seria capaz de realizar este protocolo com um rato dentro de 1 hora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">LabChart 7 software (for Macintosh)</td>
			<td style="width:139px;">ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLU60/7</td>
			<td style="width:475px;">used in protocol step 4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerLab 8/30 (model ML870)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Octal Bridge Amp (model ML228)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>FE228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Black BNC to BNC cable (1m)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLAC01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Macintosh OS&#160;</td>
			<td>Apple Inc.&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:475px;">Mac OS X 10.4 or later</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Surgipack Digital Rectal Thermometer&#160;</td>
			<td>Vega Technologies</td>
			<td>MT-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Grass volumeteric pressure transducer PT5A</td>
			<td>Grass Instruments Co.</td>
			<td style="width:155px;">Model number PT5A; serial No. L302P4.</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1ml Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">5ml serological syringe pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606160</td>
			<td style="width:475px;">Connected via plastic tubing</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Balance/Scales</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>SHIMAUW220D</td>
			<td style="width:475px;">Any weighing balance with of 0.1 gram resolution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HM40 Humidity &#38; temperature meter&#160;</td>
			<td>Vaisala&#160;</td>
			<td>HM40A1AB</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Barometer</td>
			<td>Barometer World</td>
			<td>1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Laboratory tubing</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>508-101</td>
			<td style="width:475px;">Used to connect water column to the syringe and pressure transducer</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;width:263px;">Cylindrical Perspex Chamber</td>
			<td>Dynalab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:475px;">Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">80% Ethanol (4L)</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>BDH1162-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography

A disfunção respiratória é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo e as taxas de mortalidade continuam a subir. A avaliação quantitativa da função pulmonar em modelos de roedores é uma ferramenta importante para o desenvolvimento de futuras terapias. Comumente utilizadas técnicas de avaliação da função respiratória, incluindo pletismografia invasivo e de oscilações forçadas. Embora essas técnicas fornecem informações valiosas, a coleta de dados pode ser repleta de artefatos e variabilidade experimental, devido à necessidade de anestesia e / ou instrumentação invasiva do animal. Em contraste, a desenfreada pletismografia de corpo inteiro (UWBP) oferece uma maneira precisa, não-invasivo, quantitativo por que analisar parâmetros respiratórios. Esta técnica evita o uso de anestesia e apoios, o que é comum para as técnicas tradicionais de pletismografia. Este vídeo vai demonstrar o procedimento UWBP incluindo o equipamento configurado, calibração e pulmão gravação função. Eleirá explicar como analisar os dados recolhidos, bem como identificar os outliers experimentais e artefatos que resulta da circulação de animais. Os parâmetros respiratórios obtidos utilizando esta técnica incluem o volume corrente, volume minuto, ciclo inspiratório, fluxo inspiratório ea relação entre tempo de inspiração para tempo de expiração. Não UWBP não dependem de habilidades especializadas e é barato para executar. Uma característica fundamental do UWBP, e mais atraente para os potenciais utilizadores, é a capacidade de executar medidas repetidas da função pulmonar no mesmo animal.

Quando este procedimento foi seguido corretamente, um traço oscilante consistente é criado no software de análise de dados. O procedimento prevê um traço respiratória em poucos minutos após a configuração com cálculos simples de computação para determinar parâmetros respiratórios indicados. Figura 5 representa um traço respiratória adequada de um controle (saudável) do mouse. Dados oscilante adequado é produzido quando o animal não está em movimento activamente. <p class="jove_co...

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Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

A avaliação da fisiologia respiratória, tradicionalmente invocado técnicas, que exigem contenção ou sedação do animal. Unrestrained pletismografia de corpo inteiro, no entanto, fornece uma análise precisa, não-invasivo, quantitativo de fisiologia respiratória em modelos animais. Além disso, a técnica permite a avaliação repetida respiratório de ratos permitindo estudos longitudinais.

Medir a função respiratória em ratos usando Unrestrained pletismografia de corpo inteiro

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

measuring-respiratory-function-mice-using-unrestrained-whole-body

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K visualizações.  Monash Institute of Medical Research.  A avaliação da fisiologia respiratória, tradicionalmente invocado técnicas, que exigem contenção ou sedação do animal. Unrestrained pletismografia de corpo inteiro, no entanto, fornece uma análise precisa, não-invasivo, quantitativo de fisiologia respiratória em modelos animais. Além disso, a técnica permite a avaliação repetida respiratório de ratos permitindo estudos longitudinais. 

Vídeo: Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Measuring Blood Pressure in Mice using Volume Pressure Recording, a Tail-cuff Method

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume. A specially designed differential pressure transducer and an occlusion tail-cuff measure the total blood volume in the tail without the need to obtain the individual pulse signal. Special attention is afforded to the length of the occlusion cuff in order to derive the most accurate blood pressure readings. VPR can easily obtain readings on dark-skinned rodents, such as C57BL6 mice and is MRI compatible. The CODA system provides you with measurements of six (6) different blood pressure parameters; systolic and diastolic blood pressure, heart rate, mean blood pressure, tail blood flow, and tail blood volume. Measurements can be made on either awake or anesthetized mice or rats. The CODA system includes a controller, laptop computer, software, cuffs, animal holders, infrared warming pads, and an infrared thermometer. There are seven different holder sizes for mice as small as 8 grams to rats as large as 900 grams.

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. This tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume.

Medição da pressão arterial em ratos usando Recording Volume de pressão, um método de cauda-manguito

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualização da função respiratória mitocondrial usando Citocromo C Desidrogenase Oxidase / Succinato (COX / SDH) Histoquímica rotulagem dupla

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Todo o corpo de nanopartículas de aerossóis exposições por inalação

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

Medição in vivo da função muscular extensor do joelho em camundongos

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...