Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant HL093196 (RCR) e da Pesquisa Atlanta e Education Foundation (AREF).

I. sensibilização a alérgenos e Challenge (ver Figura 1) A. Para o desafio intratraqueal <ol><li> Para a sensibilização inicial, injectar macho ou fêmea C57BL / 6 ou ratinhos BALB / c (6-8 semanas de idade) por via intraperitoneal no dia 0 e novamente no dia 7, com 20 ug de ovalbumina (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionado em 0,2 ml de fosfato estéril tamponada salina (PBS) contendo 2 mg de hidróxido de alumínio (Sigma-Aldrich) ou com 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril como controle. </li><li> Desafio com o antigénio, conforme apropriado (por exemplo, nos dias 14, 16, 18, e 20). Procedimento desafio seguinte. </li><li> Anestesiar rato com uma injecção intraperitoneal (ip) de uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Garantir o rato é completamente anestesiados durante pelo menos 10 min. </li><li> Superfície operação ângulo de 45 graus ou mais. Coloque o rato sobre esta superfície mantendo lado ventral para cima e cabeça para cima. </li><li> Gancho thread sob incisivos da frente para segurar a cabeça para trás. Nível das patas com um outro para garantir a traquéia é reta e usar a fita etiqueta para segurar as pernas. Mergulhe sítio cirúrgico com 70% EtOH e cotonete. </li><li> Aplicar bupivicaine (0,1 a 0,2 ml de solução a 0,25%) topicamente no local da incisão. </li><li> Nip pele na garganta com uma pinça e puxe-o delicadamente para fora. Faça uma pequena incisão vertical com uma tesoura cirúrgica. Minimize o tamanho da incisão. </li><li> Prepara-se uma seringa de 1 ml com 50 ul de PBS ou OVA 0,1% em PBS e inseri-lo de uma pipeta de repetitivo (Tridak Stepper, Torrington, CT). Tomar a pipeta numa mão e usar o outro para segurar o tecido para trás com as pinças e expor a traqueia. </li><li> Segure a seringa como paralela à traquéia possível, inserir a agulha através da parede da traquéia e injetar a solução. </li><li> Manter mouse em uma injeção vertical orientação a seguir para permitir tempo para solução para resolver nos pulmões. </li><li> Área da ferida levemente e esterilizada estreita compinças e selo com sutura. </li><li> Coloque o rato esterno para baixo sobre uma almofada de aquecimento e permitir-lhe recuperar até que esteja totalmente ambulatorial. Após a recuperação, retornar o mouse para a instalação de cuidados com animais e monitorá-lo diariamente para detectar sinais de seroma, inflamação ou infecção, deiscência da ferida e até que a ferida estiver totalmente curado. </li></ol> B. Por Desafio por nebulização <ol><li> Sensibilizar ratinhos no dia 0 por injecção intraperitoneal de 20 mg de OVA (Sigma-Aldrich) emulsionada em 0,2 ml de PBS estéril contendo 2 mg de hidróxido de alumínio (Sigma-Aldrich) ou com 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril como controle . </li><li> No dia 14, aumentar a sensibilização por injecção ip como descrito acima. </li><li> No dia 21 r, 22, 23, 24 e 25 após a sensibilização inicial th, os ratinhos de desafio por exposição durante 30 min a OVA nebulizada 1% ou PBS sozinho entregue através de um nebulizador ultra-sons (Buxco Research Systems, Wilmington, NC). </li><li> Colocar os ratinhos câmara principal de WBP; aclimatar-los dentro da câmara de pletismografia durante pelo menos 10 min. </li><li> O local de 1 ml de OVA 0,1% em PBS estéril ou PBS estéril sozinho, como descrito nos passos 4-6 abaixo, através de uma ampola. Nebulização durante 30 min. </li><li> Remova o copo de nebulizador e descartar a solução restante. </li><li> A nebulização pode ser realizada em todos os ratinhos simultaneamente usando uma câmara de nebulização. </li></ol> II. Determinação da hiperresponsividade brônquica à metacolina A. Medição não-invasiva de hiperresponsividade das vias aéreas por pletismografia de corpo inteiro (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC) <ol><li> Permitir que a garrafa de metacolina em pó a aquecer até à temperatura ambiente antes da abertura (metacolina é muito higroscópico e irá formar grumos inúteis se permitido para absorver água). Prepara-se uma de 200 mg / ml de solução concentrada em PBS estéril, em seguida, fazer de série 2-diluições (por exemplo, 100, 50, 25, 12,5 e 60,25 mg / ml). Mantenha soluções frio. </li><li> Configure o equipamento como se segue: ligue entrada principal do WBP para nebulizador, o viés de fluxo de entrada de ar da bomba, e saída WBP a armadilha de gás usando apertadas tubos de borracha. Anexar transdutor de pressão para colmatar as saídas das câmaras principais e referência do WBP. Ligue transdutor de pressão de pré-amplificador com os cabos fornecidos, e se conectar pré-amplificador para PC utilizando o cartão de aquisição de dados específico. </li><li> Calibrar o pré-amplificador utilizando o software de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Colocar os ratinhos câmara principal de WBP; aclimatar-los dentro da câmara de pletismografia durante pelo menos 10 min, em seguida, as leituras da linha de base de registo (Penhbase) durante 3 min. </li><li> O local de 1 ml de PBS estéril no copo do nebulizador. Nebulização durante 2 min e, em seguida, monitorar as variáveis ​​respiratórias para um min 6 adicional durante a fase de secagem. Remova o copo de nebulizador e descartar qualquer PBS restante. </li><li> O local de 1 ml de 6,25 metacolina mg / ml no copo do nebulizador e REPEAT nebulização durante 2 min mais um ciclo de controlo 6-min. </li><li> Repita medição com 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml de metacolina, usando o mesmo período de nebulização 2-min e 6-min ciclo de controlo. </li><li> Retire os camundongos das câmaras e devolvê-los às suas gaiolas. </li><li> Refil nebulizador copo com 1 ml de PBS estéril e executar outra seqüência para lavar a tubulação. </li><li> Desligue os fluxos de ar, desmontar, e limpe todas as câmaras antes de executar um segundo conjunto de animais. </li></ol> B. medida invasiva da responsividade das vias aéreas pelo computador controlado ventilador (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canadá) <ol><li> Pesar o rato e anestesiar por injecção intraperitoneal (ip) de 60 mg por kg de peso corporal de sódio pentobarbital. </li><li> Após anestesia adequada posição, os ratos ventro-dorsal para traqueostomia. </li><li> Desinfectar a pele do pescoço com etanol 70%. Aplicar bupivicaine (0,1 a 0,2 ml de solução a 0,25%) por via tópica no incision local. Incisão e abrir a pele do pescoço. Separar os músculos do pescoço e expor a traquéia. </li><li> Faça uma 1 - a 2 mm incisão na traquéia com uma tesoura fina (ter a certeza de não cortar a traquéia) e inserir o tubo traqueal com cautela. Amarre uma sutura ao redor da traquéia para evitar uma fuga de ar. </li><li> Coloque o mouse na câmara pletismógrafo de corpo e conectar o tubo inserido traqueal ao ventilador. </li><li> Iniciar ventilação mecânica. Ajuste a taxa respiratória apropriada e volume corrente / acidente vascular cerebral (AVC 150 / min e 200 ul, respectivamente, para um rato 20-g). Certifique-se que o tórax está se movendo em sincronia com o ventilador. Se o mouse está &quot;lutando&quot; com o ventilador (respiração auto-), injetar mais anestésico e esperar a sincronização. </li><li> Após medidas de base, manter os ratos sob ventilação linha de base para outro 3 min, e então tomar a 2 ª série de medições de impedância. Este 2 º conjunto de medidas de base é usada para calcular os valores basais. </li><li> Entregar PBS ou metacolina (MCH) desafios (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml) pela canalização de fluxo inspiratório do ventilador através de um nebulizador ultra-sónico. </li><li> Após cada desafio com MCH (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml), retornar o pistão para entregar uma Vt de 10 ml / kg a 120 ciclos / min e tomar medidas de impedância. </li></ol> III. Medição da infiltração celular no espaço aéreo A. Perform lavado broncoalveolar (LBA) <ol><li> Após a medição da AHR, eutanásia camundongos com CO 2, e posicione cada rato em sua parte traseira no bloco cirúrgico. </li><li> Mergulhar a área com EtOH a 70%. </li><li> Começando na parte inferior do abdome, corte abrir a cavidade abdominal e remover a pele / músculo superior, subindo em direção às costelas. </li><li> Uma vez que as costelas são visíveis, use uma tesoura para cuidadosamente punção do diafragma. Os pulmões devem entrar em colapso para longe do diafragma. Tenha especial careful não nick dos pulmões ou coração. </li><li> Cortar a caixa torácica para expor totalmente os pulmões / coração (evitar o corte de todas as grandes vasos sanguíneos para manter o sangue de encher o site). </li><li> Utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 27 (BD seringas, Franklin Lakes, NJ), a punção dos ventrículos cardíacos e lentamente e cuidadosamente puxar para trás da seringa para recolher o sangue. Tome cuidado para evitar o colapso do coração. </li><li> Recolher o soro de sangue utilizando este protocolo padrão. Armazenar a -70 ° C até à utilização. </li><li> Cortar pele e do tecido a partir da garganta até a traqueia é revelada. Limpar o tecido suficiente para trabalhar facilmente dentro do campo (mais uma vez, evitar o corte de todas as grandes vasos sanguíneos). </li><li> Com uma tesoura curva, corte sob a traquéia para limpar o caminho. </li><li> Passar o ponto de uma pinça curvos sob a traqueia e agarrar a extremidade de um pedaço de sutura. Desenhe o fio de sutura sob a traquéia. </li><li> Amarre um meio nó frouxo-sobre a traquéia, baixa na garganta. </li><li> Carefully corte de um entalhe, suficiente em tamanho para a cânula, acima do fio de sutura. </li><li> Cuidadosamente inserir a cânula no orifício e para baixo da traqueia para além do ponto do fio de sutura. Pressione suavemente para frente até que a cânula surge apenas na entrada para os pulmões (muito longe: pulmões punção; muito curtos: traquéia colapso ao tentar recuperar BAL). </li><li> Apertar fio de sutura e nó completa para selar traqueia em torno da cânula. </li><li> Bloqueio da seringa (contendo 1 ml de PBS) sobre a cânula, e pressionar suavemente o fluido para o pulmão. Lobos pulmonares devem individualmente inflar lentamente. Não excesso de preenchimento. Para um crescimento total de mouse 0,9-1,0 ml é o máximo absoluto. 0,8 ml pode ser mais seguro. Bloquear seringa vagamente a cânula, caso contrário, é susceptível de causar danos ao tentar desengatar. </li><li> Retirar fluido a partir de pulmões. Se a resistência for encontrado (tecido sugado para dentro da cânula), prima cânula lentamente mais para dentro do pulmão e retomar a remoção. Tente também girar a cânula no lugar. Se todos os else não, retirar do caminho parte cânula, a traquéia é muito mais provável a entrar em colapso neste caso. </li><li> Retire uma seringa de cânula, depósito LBA no recipiente, e repetir 2 vezes com solução PBS fresco. </li><li> Manter a solução BAL em gelo até centrifugadas. </li><li> Use o LBA e soro para medir a IgE OVA específica utilizando comercialmente disponível do mouse IgE ELISA kits (Bioproducts MD, St. Paul, MN). </li></ol> B. contagem de células e determinar os diferenciais de <ol><li> Centrifugar a BAL fluido 5 min a ~ 600 × g, 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento de células suavemente em PBS e manter em gelo. </li><li> Coloque um hemocitômetro de Neubauer padrão com a suspensão diluída de células e contagem das células. </li><li> Remover alíquotas de 2 × 10 4 células em 10 a 40 volumes ul para cytospins. Diluir as células, se necessário. </li><li> Para cytospins, misture 2 × 10 4 células, 130 PBS ul e 10 ul FBS. Adicione a mistura de célula inteira para DOUBle cytospin funil e centrifugar 10 min a 700 rpm, utilizando cytoslides duplas para amostras em duplicado. </li><li> Permitir que as lâminas para secar à temperatura ambiente durante 1 h antes da coloração. </li><li> Coloração das lâminas usando Diff-Quick mancha (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Os resultados representativos Constrição das vias aéreas excessiva após estímulos provocativos é uma característica proeminente do clínico da asma. Descrevemos dois métodos para medir a hiper-responsividade das vias aéreas, tais à metacolina em ratinhos OVA-sensibilizadas e desafiados: corpo inteiro pletismografia (Figura 2) e oscilações forçadas utilizando o sistema de flexiVent (Figura 3). Ambos os métodos demonstram que a sensibilização OVA e desafio produz hiper-responsividade das vias aéreas em ratinhos. Eosinófilos rico inflamação das vias aéreas é outra característica marcante de ambos clínico da asma e doença alérgica das vias aéreas em ratos. Como mostrado na Figura 4 </strong&gt;, a sensibilização OVA e desafio aumenta grandemente o número total de células que podem ser recuperados a partir da vias respiratórias por BAL. Os números de eosinófilos e, em menor extensão, os neutrófilos são especialmente aumentada. Evidências indicam que os resultados das vias respiratórias alérgicas doença de excesso de anticorpos IgE a antígenos sensibilizantes. Sensibilização e desafio com OVA, utilizando os protocolos aqui descritos aumenta os níveis de IgE em ambos soro e fluido BAL de ratinhos tratados (Figura 5). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema experimental para OVA induzida asma alérgica. Ratos foram sensibilizados por duas vezes ip com 20 mg de OVA emulsionado em 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril, ou 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril sozinho, seguido no pontos de tempo indicados por isso o desafio com 0,1% de OVA ou solução de PBS estéril ou por ex diária<html> posure durante 30 minutos a nebulizada OVA a 1% em PBS ou PBS sozinho entregue através de um nebulizador ultra-sons (Buxco). Vinte e quatro horas após a exposição OVA final, responsividade das vias aéreas foi determinado. Subsequentemente, o fluido BAL, amostras de sangue, as células do pulmão, e os tecidos foram recolhidos para análise posterior. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figura 2. Ratos de avaliação de alérgeno-induzida hiperresponsividade das vias aéreas por método não invasivo. (N = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, hiper-responsividade das vias aéreas à metacolina inalado foi determinada utilizando todo o corpo pletismografia como descrito no protocolo. Penh foi determinada e expressa como Penh ratio (média Penh durante o intervalo de tempo de 8 min com metacolina, dividido pelo Penh média, durante o intervalo de 8-min com PBS). *, P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Ratos de avaliação de alérgeno-induzida hiperresponsividade das vias aéreas através de um método invasivo (oscilação forçada). (N = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, hiper-responsividade das vias aéreas a concentrações crescentes de metacolina inalado foi determinada pelo oscilações forçadas (flexiVent) Método como descrito no protocolo. A, B) a resistência das vias aéreas; C) elastância pulmonar. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figura 4. Contagem de células BAL fluido. Ratinhos (n = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, (Top) As células foram recolhidas e BAL células totais foram contadas como descrito no protocolo. (Bottom) slides citospina foram preparado e corados com Diff-Quick. Tot = total de células; Eos = eosinófilos; Neu = neutrófilos, macrófagos MAC =; LYM = linfócitos. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figura 5. OVA-IgE específica. Os ratinhos (n = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, IgE foi medido no fluido BAL e no soro do sangue recolhido por punção cardíaca, tal como descrito no protocolo. *, P &lt;0,05 vs PBS.

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Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo VAMC Atlanta IACUC Comissão sob o protocolo n V010-10.

Os modelos animais de doença alérgica das vias aéreas proporcionar ferramentas importantes para estudos relevantes para a asma clínica. Um certo número de modelos diferentes, empregando espécies variando e antigénios, têm sido desenvolvidos. O mouse, uma espécie de laboratório atraentes e freqüentemente usado, também oferece uma série de vantagens para os modelos de doença alérgica das vias aéreas. 9,10 Embora tais modelos não simulam asma em todos os aspectos, 11, com aspectos da ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ovalbumina </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de alumínio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetil-β methylcholine-cloreto </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Sal de sódio pentobarbital </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Pletismografia de corpo inteiro (WBP) sistema </td><td> Buxco Systems Research Wilmington, North Carolina </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Canadá </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Microscópio de luz </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, NC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick mancha </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta repetitivo </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

murine model of allergen induced asthma

A asma é uma das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo. 1 Mais de 8% da população dos EUA tem asma, com o aumento da prevalência. 2 Tal como acontece com outras doenças, modelos animais da doença alérgica das vias aéreas facilitar grandemente compreensão da fisiopatologia subjacente, ajudar a identificar potenciais alvos terapêuticos, permitindo testes pré-clínicos de possíveis novas terapias. Modelos de doença alérgica das vias respiratórias foram desenvolvidos em várias espécies animais, mas modelos murinos são particularmente atraentes devido ao baixo custo, disponibilidade, e bem caracterizadas sistemas imunitários desses animais. 3 disponibilidade de uma variedade de estirpes de transgénicos aumenta ainda mais a capacidade de atracção destes modelos. 4 Descrevemos aqui dois modelos murinos de doença alérgica das vias aéreas, tanto a ovalbumina empregando como o antigénio. Após a sensibilização inicial, por injecção intraperitoneal, um modelo emitiu qualquerers o desafio antigénio por nebulização, a outra por entrega por via intratraqueal. Estes dois modelos oferecem vantagens complementares, com cada imitando as principais características da asma humana. 5 As principais características da asma aguda incluem uma resposta das vias aéreas exagerada a estímulos, como metacolina (vias aéreas hiper-responsividade; AHR) e eosinófilos rico inflamação das vias aéreas. Estes são também efeitos proeminentes de desafio alérgeno nos nossos modelos murinos, 5,6 e nós descrevemos técnicas para a sua medição e, assim, avaliar os efeitos da manipulação experimental. Especificamente, descrevem ambas as invasivos 7 e não-invasivo 8 técnicas de medição de hiper-responsividade das vias aéreas, bem como métodos para avaliar a infiltração de células inflamatórias para as vias aéreas e do pulmão. Células das vias respiratórias inflamatórias são recolhidos por lavagem broncoalveolar enquanto pulmão histopatologia é utilizado para avaliar os marcadores de inflamação por todo o órgão. Estestécnicas fornecem ferramentas poderosas para o estudo de asma de maneira que não seria possível em seres humanos.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

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39.8K visualizações.  Emory University and Atlanta VA Medical Center. Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

Um modelo murino da doença da encefalite viral aguda induzida pelo vírus da dengue

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

Análise sistemática de pontuação para inflamação intestinal em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio murine dextran

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...