TKMcG é apoiado por uma bolsa de estudo da Sociedade Torácica canadense. CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES Todos os autores participaram da concepção do trabalho. Além disso, TKMcG iniciou o projeto, coletados resultados experimentais, contribuiu para a redação do manuscrito e sua análise crítica. AR coletados e analisados ​​os resultados experimentais, elaborou o manuscrito e contribuíram para a sua revisão crítica. LF coletadas resultados experimentais e contribuiu para a revisão crítica do manuscrito. TFS e JGM contribuiu para a revisão crítica do manuscrito.

Os procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de Cuidados McGill University Institutional Animal, em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care (CCAC). 1. Passos Preparatórios <ol><li> Soluções: <ol><li> Metacolina: Prepara-se uma solução estoque a 50 mg / ml e as diluições em série (1:1) com base nas concentrações a serem testadas 5. Permitir que a solução atinja a temperatura ambiente antes de nebulização de 5. </li><li> Agentes anestésicos: regimes diferentes foram relatados na literatura em várias linhagens de camundongos (Tabela 1) Nota:. Regime 1 foi utilizado ao abrigo do presente protocolo. </li></ol></li><li> Equipamento: O presente protocolo aplica-se a qualquer uma das duas gerações flexiVent suportadas pelo software flexiWare 7. As funções de software estão agrupados em três módulos: Estudo de Definição e Planejamento, Experimentação Session e Review &amp; Reporting. <ol><li> Ligue o sistema (apenas flexiVent FX) e / ou iniciar o software. </li><li> Na primeira sessão de experimentação ou em qualquer momento, antes disso, abra a definição do estudo e do módulo de Planejamento de predefinir a estrutura estudo. </li><li> Clique no botão Criar um novo estudo e siga o assistente para criar um estudo, delinear o protocolo e definir os grupos experimentais e os assuntos a serem estudados. </li><li> Iniciar uma sessão de experimentação, abrindo o módulo Sessão Experimentação e seguindo a sequência de arranque para estudo e seleção de modelo. </li><li> Atribuir um assunto para o local da medição e confirmar o seu peso. </li><li> Prosseguir com a calibração do sistema, seguindo as etapas descritas no software operativo. Você será solicitado em um ponto para fixar a cânula a ser utilizado (passo 1.3.3) para o Y-tubulação para a calibração. </li><li> Passo crítico. REPEAt passo 1.2.6, se os valores de calibração obtidos estão fora do intervalo aceitável. (Consulte o flexiVent FX ou manual de usuário flexiWare 7 para os limites aceitáveis ​​do módulo específico de valores de calibração). </li><li> Cancelar instruções para iniciar a ventilação e gravação de dados, a menos pronto para começar o experimento. Estes podem ser iniciadas em um momento posterior. </li></ol></li><li> Assuntos: <ol><li> Anestesiar o assunto com doses adequadas de agentes anestésicos (Tabela 1). </li><li> Verifique se o assunto chegou a um nível de anestesia cirúrgica. O assunto deve mostrar nenhuma reação a uma pitada do dedo do pé e sua respiração deve ser regular e não trabalhou. </li><li> Realizar uma traqueotomia e canulação da traquéia. <ol><li> Colocar o animal em suas costas e fornecer uma fonte de calor (por exemplo, temperatura cobertor de aquecimento controlado ou uma lâmpada com uma lâmpada de 60 watt situado a cerca de 45 cm do mouse para evitar o aquecimento excessivo). </li><li> Limpo ªe a área da garganta com álcool e expor a traqueia, fazendo uma incisão na pele e separar cuidadosamente a glândula submandibular e a camada muscular cobrindo-o. </li><li> Suavemente levantar a traqueia usando um par de fórceps e micro-sutura passe por baixo. </li><li> Corte entre dois anéis de cartilagem mais próxima da laringe para fazer uma pequena incisão na traqueia sem corte ele. </li><li> Inserir a cânula previamente calibrado na incisão e avançar o suavemente para dentro da traqueia do comprimento de aproximadamente cinco anéis Nota:. As presentes experiências foram realizadas utilizando um 1,2 cm de comprimento de metal cânula de calibre 18. </li><li> Passo crítico. Segurar a cânula no local usando o fio de sutura. O acessório deverá formar uma vedação hermética em torno da cânula. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ventilação Mecânica <ol><li> Traga o animal perto do ventilador. </li><li> Iniciar a ventilação mecânica, selecionando um predefinidoou um perfil personalizado ventilação na janela de encaixe de ventilação. </li><li> Ligue o animal ao ventilador através da tubagem de Y-. </li><li> Passo crítico. Alinhar o animal ao ventilador e garantir que a cânula traqueal é, ao mesmo nível que o ventilador para evitar uma possível torção ou oclusão cânula traqueal. </li><li> Passo crítico. Executar uma perturbação profunda Inflação clicando duas vezes sobre o nome perturbação para verificar a inserção da cânula e do apego. Na ausência de um vazamento, o sistema deve ser capaz de manter uma pressão de 30 cmH 2 O sobre a 3 segundo período, sem deslocamento de volume excessivo (Figura 1). O volume registrado e traços de pressão também deve ser lisa, sem sinais de deslocamento ou deformação pois estes podem indicar uma obstrução de cânula ou extravio. </li><li> Se necessário, ligue transdutores de sinais vitais para a frequência cardíaca e controlo da temperatura corporal. Gravação de dados pode ser iniciada either manualmente ou automaticamente através de um script. </li></ol> 3. Medidas da função pulmonar Medidas ou comandos (por exemplo, a ativação de nebulização, marcadores de eventos) pode ser automatizado usando scripts pré-definidos ou personalizados para um processo experimental altamente controlado e repetível (Figura 2). Seis famílias de perturbações que dão origem a uma série de parâmetros podem ser utilizados para descrever o mecanismo do sistema respiratório sujeitos no início do estudo e após um dado desafio (Tabela 2). <ol><li> Passo crítico. Quando estiver pronto para começar a tomar medidas, executar uma inflação profunda para recrutar áreas pulmonares fechadas e padronizar história do volume pulmonar. </li><li> Passo crítico. Verificar a ausência de esforços inspiratórios espontâneos, executando um teste de medição (por exemplo, PVs-P ou PVs-V). Observar os traços de sinal de pressão na vista Dataset selecionados. Com curvas PV passo a passo,planaltos de pressão deve ser bem definido, sem desvios para baixo. Um movimento para baixo da pressão poderia indicar um esforço de inspiração do animal (Figura 3). </li><li> Inicie o script selecionado clicando duas vezes em seu título. Scripts usados ​​no presente estudo geralmente incluídos para medições: <ul><li> Uma seqüência de medições de referência em triplicado. </li><li> A activação do nebulizador para a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada Nota:. Quando solicitado pelo sistema, carregar aproximadamente 100 ul de solução salina ou de uma solução de metacolina no nebulizador. Nebulização vai iniciar e parar automaticamente. </li><li> Uma sequência de medições espaçadas (cada 10-15 seg) durante um período de cerca de 3 minutos após a activação do nebulizador. </li><li> Um aviso para executar um outro desafio e repetir uma sequência de medições Nota:. Secagem do interior do monte nebulizador com um cotonete em bdesafios ntre pode ajudar a prevenir ou condensação de gotículas edifício-up na linha inspiratória. </li></ul></li><li> No fim do experimento, parar a ventilação e retirar o objecto. </li><li> Alternar para o próximo assunto no software operacional e confirmar o seu peso. </li><li> Passo crítico. Lavar e secar nebulizador, adaptador, Y-tubulação, e cânula entre os sujeitos. </li><li> Repita os passos 3.6 a 1.2.6. </li><li> No final do dia, fim da sessão experimental. Recorde enxaguar e secar nebulizador, adaptador, Y-tubos e cânula e para limpar o sistema de válvula de expiração antes de deixar o laboratório, seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> 4. Análise de Dados O software calcula automaticamente e exibe os parâmetros associados com uma perturbação. Ele também fornece um coeficiente de determinação (COD), o que reflecte o encaixe do modelo matemático com os dados. Cada conjunto de dados com um insuCOD fficient é rotulado como excluídos pelo software. Revisão de sessões experimentais, os dados re-análise e criação de cenários de exportação são feitos no módulo de Análise e Relatórios do software. <ol><li> Abra o módulo de Análise e Relatórios e criar um cenário de exportação, tendo o cuidado de incluir apenas os conjuntos de dados que têm um COD suficiente. </li><li> Exportar como parâmetros necessários, curva de pressão ou fluxo-volume, sinais de conjunto de dados brutos ou informações sujeitas a um aplicativo de planilha (ver Tabela 3). </li><li> Média de medições de linha de base para cada um dos parâmetros e de trama de todas as medições como uma função do tempo (ver Figura 4). Em seguida, pode escolher para calcular a área sob a curva, analisar o perfil geral das curvas ou realizar uma análise estatística. </li><li> Para expressar os resultados da responsividade das vias aéreas como uma função da concentração de metacolina, determinar para cada sujeito, e da condição do parâmetro experimental ou de algumponto (eg pico) ou um tempo específico após cada metacolina. Calcular médias de grupo e relatórios ou resultados enredo para cada condição experimental (Tabela 4, Figura 5). </li><li> Pode também considerar o cálculo da concentração que produz uma duplicação de um determinado valor de referência do parâmetro (PC 200; Figura 5C), aplicando-se uma normalização (% da linha de base, por exemplo) ou a realização de uma análise estatística. </li></ol>

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AR, LF, TFS são empregados por SCIREQ científicos respiratória Inc. TFS também possui estoque. Livre acesso a este artigo é patrocinado pela SCIREQ Scientific respiratória Equipment, Inc.

O estudo contínuo da disfunção das vias aéreas, uma vez que refere-se a asma e outras doenças pulmonares permanece fundamental para a compreensão dos mecanismos subjacentes da doença e para o desenvolvimento de opções de tratamento. A utilização de ratos modelo para a doença das vias aéreas tem sido essencial na obtenção de entendimento para estes mecanismos de doença. Ao considerar a disfunção das vias aéreas avaliar em um assunto tão pequeno como um rato, ter ferramentas confiáveis ​​e precisos para medir a função pulmonar é crítica. Além disso, ter ferramentas capazes de fornecer conhecimentos sobre a localização da disfunção das vias aéreas ou efeito terapêutico é inestimável. A técnica TOF combina todos estes atributos e proporciona uma abordagem poderosa, integrativa e translacionais para avaliar as alterações fisiológicas. Para ter sucesso com este tipo de medição em ratinhos, deve ser dada especial atenção aos poucos passos, a saber, a calibração do sistema, a resistência do ca endotraquealnnula, do tipo de nebulizador (bem como as suas configurações de funcionamento) o posicionamento do animal e a normalização da história do volume pulmonar. Além disso, é imperativo, para obter conjuntos de dados válidos, que o sistema respiratório do objecto permanece passivo durante as medições. Isto pode ser conseguido pela administração de um agente paralisante muscular, trabalhando num plano de anestesia profunda ou abafando o sujeito para induzir apneia (ver Tabela 1). Os investigadores podem começar por dominar o sistema e seu software operacional, se desejar, com cargas de ensaio, ao adquirir as habilidades necessárias para medições em camundongos. Seria então lógico para gerar resultados reproduzíveis em animais ingênuos antes de passar para modelos de doenças ou ratos tratados. Uma vez que uma proporção importante de modelos de doenças respiratórias em pesquisa envolvem exposição dos animais aos agentes, tais como alérgenos, toxinas, poluentes, fumaça de cigarro ou gases, a variabilidade nos resultados obtidos com os MEDIÇÃOt técnica descrita neste artigo poderia, portanto, ser influenciada pelo processo de exposição utilizado. Padronização dos processos experimentais fundamentais (por exemplo, usando a exposição controlada por computador e sistemas de medição de 6, 13, 14) poderia ter um impacto significativo na redução da variabilidade. Os exemplos apresentados neste artigo representam uma seleção de resultados típicos de ingênuos e cloro experimentos ratos expostos ao destacar os pontos fortes, bem como as limitações da técnica. Como pode ser visto, por exemplo, na Figura 6, a técnica é capaz de gerar medidas de função pulmonar reprodutíveis. Enquanto os valores de resistência de base semelhantes foram relatados entre linhagens de camundongos, as diferenças de elastância foram no entanto observadas 15. Mudanças substanciais também são esperados entre a criança e camundongos adultos 16. Quanto aos outros em avaliação fisiológica vivo, resultados de alta precisão, tais como those gerado pelo FOT, vem com uma concessão quanto ao estado natural dos indivíduos. Este princípio, que é conhecido como princípio da incerteza de fenotipagem 1, aplica-se ao presente protocolo, no sentido de que as medições devem ser feitas em anestesiados, traqueostomizados (ou oralmente entubado) e ventilação mecânica assuntos. Outra limitação da técnica é observável na Figura 5D-5F em que os dados não estão disponíveis para as concentrações mais elevadas para o grupo cloro-exposto porque o ajuste do modelo de fase constante para os dados é pobre acima dos níveis moderados de broncoconstrição. No entanto, os animais gravemente bronchoconstricted podia ser avaliada através da análise ZRS directamente 15, ou usando um software de terceiros pós-análise para ajustar modelos matemáticos mais complexos, por exemplo, tendo em conta a heterogeneidade da função mecânica 17. Excluídos conjuntos de dados também pode ser observado se as vias aéreas do animal não são suficientemente passive ou se a resistência da cânula é muito alta. Como uma regra geral, a resistência da cânula não deve exceder a resistência do animal no início do estudo. Trabalhando com uma cânula de diâmetro interno maior e / ou mais curto comprimento vai ajudar a reduzir a resistência da cânula. Finalmente, o presente demonstração de medições TOF em ratinhos pode ser percebido como uma metodologia demorada e, por conseguinte, menos eficiente ou menos aplicável a estudos longitudinais em comparação com técnicas menos invasivas. No entanto, o último está associado com uma grande dose de incerteza quanto à base dos seus resultados e são vistos por muitos como sendo um falho. Medidas invasivas repetidas são possíveis em animais por via oral entubado, embora tecnicamente mais desafiadora 17. A partir dos exemplos apresentados, os resultados demonstraram a equivalência das duas gerações do sistema flexiVent a produzir medições de mecânica respiratória, assim como da via aérea hyperreactividade e hipersensibilidade à metacolina inalada seguindo cloro-exposição em camundongos. Quando usado para caracterizar ou compreender as mudanças fisiológicos ou modelos de doenças, o aspecto detalhadas de medida relacionada com a técnica pode contribuir para prolongar o estado atual do conhecimento.

Caracterização adequada das propriedades mecânicas dos pulmões em pequenos animais tornou-se essencial uma vez que a germinação de modelos murinos na ciência respiratória. Quando realizada por meio da técnica de oscilações forçadas (TOF), uma técnica também usada em seres humanos, essas medidas fornecem uma abordagem poderosa, integrativa e de translação para estudar alterações fisiológicas significativas. FOT medições são tipicamente obtidos através da análise de sinais de pressão e de volume adquiridos em reacção a um predefinido, pequena amplitude de oscilação da forma de onda do fluxo de ar (também referida como perturbação ou sinal de entrada), aplicado na abertura das vias aéreas do sujeito 1. Na sua forma mais simples, uma perturbação TOF seria uma única forma de onda sinusoidal com uma frequência bem definida. Perturbações mais complexas tipicamente consistem de uma superposição de uma seleção de específico (mutuamente prime) formas de onda de freqüência que cobre um amplo espectro. A decomposição do multi-frequênciaos sinais de entrada e saída em seus constituintes, utilizando a transformada de Fourier permite o cálculo da impedância de entrada do sistema respiratório (ZRS), ou seja, a função de transferência entre os sinais de entrada e saída, em cada frequência incluído na perturbação 2. Portanto, FOT permite a avaliação simultânea da mecânica respiratória em uma faixa de freqüências em uma única manobra 2. Modelos matemáticos avançados de montagem (por exemplo, o modelo de fase constante 3) para os dados de impedância, em seguida, permitir a separação da resposta em vias aéreas (central e periférico) e pulmão parâmetros dependentes do tecido do parênquima 1, 3. Porque muitos fatores que influenciam a resposta fisiológica (por exemplo, freqüência respiratória, volume corrente, volume pulmonar, das vias aéreas superiores, os esforços de respiração espontânea, o tempo das medições) são controlados e padronizados pelo sistema de medição e procedimentos experimentais, a técnica é um capcapaz de gerar medidas precisas e reprodutíveis, desde que seja realizada correctamente. O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada e cronológica do procedimento necessário para executar tais medições em camundongos. O protocolo consiste em quatro partes: etapas preparatórias (reagentes, equipamentos e matérias), ventilação mecânica, medidas de função pulmonar e análise de dados. Exemplos de resultados representativos da mecânica do sistema respiratório gerado usando um ventilador pistão controlado por computador (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Quebec, Canadá) são fornecidos. Estes foram obtidos a partir de ratinhos ingénuos, bem como a partir de um modelo orientado de estresse oxidativo de danos nas vias aéreas caracterizadas por inflamação das vias aéreas, danos em células epiteliais e aumento da capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada na forma de aerossol 4. Embora este protocolo é frequentemente utilizado para avaliar a capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada, estende-se a outros resultados e various patologias, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), enfisema, fibrose pulmonar, lesão do pulmão, bem como em modelos de ratinhos transgénicos de patologias semelhantes à doença humana. Os resultados da pesquisa utilizando esta ferramenta pode contribuir para uma melhor caracterização e entendimento das mudanças fisiológicas ou de modelos de doenças, bem como a expansão para novas áreas de pesquisa.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetyl-&beta;-methylcholine chloride </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A-2251</td>
 <td>Methacholine</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Adson forceps, serrated 12 cm</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11018-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria MC31 forceps, serrated-curved</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-31</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14058-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spring scissors-2.5 mm blades, straight</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15000-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-sterile blunt needle (18g x &frac12;")</td>
 <td>Brico Medical Supplies Inc.</td>
 <td>BN1805</td>
 <td>Endotracheal cannula</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-sterile 5-0 silk suture</td>
 <td>Seraflex</td>
 <td>IDI58000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffered solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14190-144</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>Starstedt</td>
 <td>SS-4001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml TB syringes</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>309626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l filter tips</td>
 <td>Biosphere</td>
 <td>70.760.211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>flexiVent FX</td>
 <td>SCIREQ Inc. </td>
 <td>sales@scireq.com</td>
 <td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank">www.scireq.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aerogen Aeroneb nebulizer</td>
 <td>SCIREQ Inc.</td>
 <td>sales@scireq.com</td>
 <td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank">www.scireq.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique

A técnica de oscilações forçadas (TOF) é uma poderosa ferramenta de integração e de translação permitir a avaliação experimental da função pulmonar em ratos em uma detalhada forma abrangente, preciso e reprodutível. Ele fornece medições da mecânica do sistema respiratório através da análise de sinais de pressão e do volume adquirido em reação ao pré-definida, pequena amplitude, oscilatório fluxo de onda, que são tipicamente aplicados na abertura das vias aéreas do sujeito. O presente protocolo detalhes os passos necessários para executar adequadamente as medidas de oscilações forçadas em ratos usando um ventilador pistão controlado por computador (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Quebec, Canadá). A descrição é dividido em quatro partes: etapas preparatórias, ventilação mecânica, medidas de função pulmonar e análise de dados. Ele também inclui detalhes de como avaliar a capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos anestesiados, uma aplicação comum deste technique que também se estende a outros resultados e várias patologias pulmonares. As medições obtidas em ratinhos ingénuos, bem como a partir de um modelo orientado de estresse oxidativo de danos nas vias aéreas são apresentados para ilustrar a forma como esta ferramenta pode contribuir para uma melhor compreensão e caracterização de alterações fisiológicas estudadas ou modelos de doença, bem como a aplicações em novas áreas de investigação.

Sistema respiratório medições mecânica. Tabela 4 mostra os resultados típicos da naive A / J mice obtidos na linha de base e após a broncoconstrição induzida por metacolina (12,5 mg / ml), utilizando qualquer uma das duas gerações flexiVent suportadas pelo software flexiWare 7. Mecânica do sistema respiratório, ou seja, em condições tórax fechado, foram avaliados por uma alternância de perturbações da frequência de famílias individuais e em banda larga de oscilações forçadas de forma espaçadas (SnapShot-150, Quick Prime-3, respectivamente). Uma vez que a ventilação é interrompida durante as medições, a rápida Prime-3, que abrange uma faixa de freqüência semelhante ao do Primeiro-8, mas tem uma duração mais curta (3 vs 8 sec), foi selecionado a fim de encurtar o período de apnéia, minimizar o efeito de a perturbação dos gases sanguíneos e proporcionar uma melhor resolução da resposta. Os parâmetros associados com cada perturbação foram calculados automaticalmente pelo software operacional. Os resultados mostram que as duas gerações do sistema flexiVent produzido medidas equivalentes da mecânica respiratória. Sítio de resposta do pulmão. Distinguir o site de resposta do pulmão permite ao investigador identificar regiões mais afetadas, bem como para identificar possíveis pontos de intervenção farmacológica 6. Por exemplo, sem tratamento prévio A / J ratinhos mostram um aumento da resistência de linha de base quando a pressão expiratória final contra o qual são feitas as medições é aumentada de 3 a 9 cm H 2 O (Figura 6A, instantâneo-150). No presente exemplo, o uso de medições de banda larga (TOF rápida Prime-3) fornecidos detalhes para esclarecer a base para a alteração na resistência: A alteração na pressão expiratória final resultou numa diminuição da resistência das vias aéreas (R N) consistente com a efeitos broncodilatadores de volume pulmonar superior e da imprensa inflação maiorure (Figura 6D), e um aumento do tecido de amortecimento (G, A Figura 6E), um parâmetro estreitamente relacionada com a resistência do tecido, que reflete a viscoelasticidade do tecido e, possivelmente, a resistência das vias aéreas pequenas 7. Este último é conhecido por aumentar com o aumento do volume do pulmão. Hiperresponsividade das vias aéreas. Após exposição ao gás cloro, a capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada aumenta em comparação com a exposição de ar em ratos Balb / c, como resultado de dano nas vias aéreas 4 (Figura 2). O cloro é conhecida por induzir o estresse oxidativo, levando à destruição das células estruturais das vias aéreas, em especial as células epiteliais, e induzir o recrutamento de células inflamatórias. Tal como representado na Figura 5, as alterações em todos os parâmetros que descrevem a mecânica do sistema respiratório pode ser observado na resposta a desafios crescentes de metacolina. Em comparação com os ratos expostos ao ar, os ratos expostos a cloraçãogás ne apresentarem maiores respostas máximas em todos os parâmetros da TOF (Figura 5A, 5B, 5D-5F), bem como um deslocamento para a esquerda estatisticamente significativa da curva de concentração-resposta exemplificado por uma diminuição da concentração de metacolina necessária para provocar uma duplicação da resistência e elastância (PC 200; Figura 5C). Esses resultados ilustram, respectivamente, a hiper-responsividade das vias respiratórias e hipersensibilidade a metacolina inalada, após exposição ao gás de cloro. Outras medições. Além TOF, o sistema flexiVent também pode ser usado para recolher outros tipos de função pulmonar ou 8-10 11 medições cardiovasculares. Figura 7 mostra uma curva representativa gradual, pressão orientada pressão-volume em naive A / J ratinhos sob condições basais . A porção superior do membro deflação da curva é ajustada à equação Knowles Salazar-12 </<html> sup&gt; e os parâmetros são calculados automaticamente pelo software. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="Tabela 1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabela 1. Exemplos de regimes anestésicos utilizados em camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ampliar a tabela</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="Tabela 2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> Tabela 2. Perturbações utilizados para medições da função pulmonar em camundongos. * Extensão necessário ao sistema. O assunto também precisa estar em uma câmara fechada pletismógrafo durante as medições.escorrido &quot;&gt; Clique aqui para ver maior mesa. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="Tabela 3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabela 3. Exemplo de parâmetros exportados a partir da freqüência de perturbação famílias de oscilações forçadas individuais e em banda larga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ampliar a tabela</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="Tabela 4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabela 4. Comparação do sistema. Comparação dos parâmetros mecânicos de pulmão coletadas utilizando as duas gerações do sistema flexiVent operados por software flexiWare 7. Os resultados foram obtidos em ratinhos naive A / J (n = 5 /<html> grupo) no início do estudo e após broncoespasmo induzido pela metacolina (HCM 12,5 mg / ml). * Os grupos foram comparados usando uma ANOVA de duas vias para medidas repetidas eo log 10 das respostas individuais para homogeneidade das variâncias (GraphPad Prism, versão 5.03, GraphPad Software, San Diego, EUA). <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> Figura 1. Capturas de uma inflação do pulmão profundo. O painel superior mostra o volume deslocado pelo pistão do ventilador (traço vermelho) e o volume entregue ao sujeito (cinza de rastreio). O painel inferior mostra o aumento da pressão do cilindro para uma pressão ajustada, de 30 cm H 2 O, durante um período de 3 segundos, e mantido constante durante o mesmo período de tempo. 172/50172fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Exemplo de um roteiro típico usado para avaliar a mecânica do sistema respiratório no início. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Esforços inspiratórios espontânea durante a execução de uma curva de pressão-volume gradual. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> Figura 4. Tempo de-curso seguinte resposta de metacolina desafios inalados aumentando. Resultados são expressos como a média (± desvio padrão) de um grupo de 5 naive espontaneamente hiperresponsivas A / J mice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> Figura 5. Mudanças na mecânica do sistema respiratório seguintes desafios crescentes de metacolina em cloro e ar expostos camundongos Balb / c. Valor de pico foi identificado para cada parâmetro em cada assunto e condição experimental. Médias de grupo foram então calculada (média ± desvio padrão, n = 4-6). Diferenças entre os grupos foram avaliados por análise de variância usando o log 10 das respostas individuais para homogeneidade das variâncias. A concentração de metacolina, produzindo uma duplicação da linha de base (PC 200) foi obtida ajustando uma polinomial de segunda ordem de curvas de dose-resposta individuais e interpolação da curva ajustada. Os pontos de dados estão em falta no D, E e F nos ratos cloro expostasnas duas maiores concentrações de metacolina, devido à insuficiente altos coeficientes de determinação refletindo um ajuste ruim do modelo matemático com os dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> Figura 6. Particionamento da resposta respiratória em vias aéreas e mecânica de tecido pulmonar. Traço Experimental de um ingênuo A / J ratos ilustrando único (2,5 Hz) e banda larga (1-20.5Hz) freqüência de oscilação forçada medições da mecânica respiratória em triplicado em dois pressões expiratórias finais diferentes (3 e 9 cmH 2 O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> </a&gt;. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="Figura 7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> Figura 7. Curva pressão-volume em ingênuos A / J camundongos em condições basais. Curvas de pressão-volume foram gerados usando uma perturbação pressão orientada passo a passo (PVs-P) para garantir que cada rato pulmões foram inflados com a mesma pressão, independentemente de sua condição. Salazar-Knowles parâmetros da equação extraídos de curvas pressão-volume individuais também foram calculados e relatados em um formato de tabela. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão (n = 6).

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Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

O presente protocolo fornece uma descrição passo-a-passo detalhado dos procedimentos necessários para a execução de medidas de mecânica do sistema respiratório, bem como a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos utilizando a técnica de oscilações forçadas (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

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Research

JoVE Journal

Biology

56.0K visualizações.  McGill University. O presente protocolo fornece uma descrição passo-a-passo detalhado dos procedimentos necessários para a execução de medidas de mecânica do sistema respiratório, bem como a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos utilizando a técnica de oscilações forçadas (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Biologia

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

Medir a função respiratória em ratos usando Unrestrained pletismografia de corpo inteiro

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Induction of Right Ventricular Failure by Pulmonary Artery Constriction and Evaluation of Right Ventricular Function in Mice

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of RVF. Previous rat models imitating RVF progression have been described. Compared with rats, mice are more accessible, economical, and widely used in animal experiments. We developed a pulmonary artery constriction (PAC) approach which is comprised of banding the pulmonary trunk in mice to induce right ventricular (RV) hypertrophy. A special surgical latch needle was designed that allows for easier separation of the aorta and the pulmonary trunk. In our experiments, the use of this fabricated latch needle reduced the risk of arteriorrhexis and improved the surgical success rate to 90%. We used different padding needle diameters to precisely create quantitative constriction, which can induce different degrees of RV hypertrophy. We quantified the degree of constriction by evaluating the blood flow velocity of the PA, which was measured by noninvasive transthoracic echocardiography. RV function was precisely evaluated by right heart catheterization at 8 weeks after surgery. The surgical instruments made inhouse were composed of common materials using a simple process that is easy to master. Therefore, the PAC approach described here is easy to imitate using instruments made in the lab and can be widely used in other labs. This study presents a modified PAC approach that has a higher success rate than other models and an 8-week postsurgery survival rate of 97.8%. This PAC approach provides a useful technique for studying the mechanism of RVF and will enable an increased understanding of RVF.

Here, we provide a useful approach for studying the mechanism of right ventricular failure. A more convenient and efficient approach to pulmonary artery constriction is established using surgical instruments made inhouse. In addition, methods to evaluate the quality of this approach by echocardiography and catheterization are provided.

Indução de insuficiência ventricular direita por constrição da artéria pulmonar e avaliação da função ventricular direita em camundongos

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of ...