Este projecto foi apoiado em parte por uma doação para os Institutos Nacionais de Saúde NIAID (para AJB e LGA, R01 AI076246). A coleção mutante Salmonella foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (para MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 e R01 AI075093-01), em parte pelo National Institutes of Health (para HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Agradecemos Steffen Prowollik para réplica de placas e confirmando os mutantes na coleção.

1 Murino RAW264.7 de macrófagos Cultura celular <ol><li> Grow baixo número passagem macrófagos murinos, RAW264.7 (O Número ATCC ®, TIB-71) em um frasco de cultura de células T-tampa ventilada 75 no filtro de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) , 0,5% de NaHCO3, e 1% de aminoácidos não essenciais 100X (NEAA), a 37 ° C, em 5% de uma incubadora de CO 2. </li><li> Depois das células atingirem uma confluência de 60-80% no frasco, utilizar um raspador de células para colheita de células, e contar as células num hemacitómetro e calcular a concentração de células. </li><li> Ressuspender as células e dilui-se a concentração de células em 2,5 x 10 5 / ml em meio DMEM fresco de cultura de células. Use pipetas multicanal ao prato 200 ul de meio de cultura DMEM contendo célula 5 x 10 4 células em cada poço de placas de 96 poços de cultura de células. </li><li> Placa quatro poços de cada cepa de Salmonella sp. Configure três placas separadas por um conjuntode ensaio de invasão de células fagocíticas, e marcá-los com &quot;associação&quot;, &quot;invasão&quot; e &quot;replicação&quot;, respectivamente. </li><li> Colocar as placas em 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C ON para permitir que as células de macrófagos para anexar ao fundo dos poços. </li></ol> 2 Preparação de Salmonella de tipo selvagem e mutantes <ol><li> No mesmo dia, de preparar as células de macrófagos RAW264.7, escolher colónias individuais de tipo selvagem (WT) de Salmonella enterica sorotipo Typhimurium 14028s, DinvA mutantes, DphoP mutantes, e as cepas teste mutantes desejados e cultura-los em Luria-Bertani ( LB) suplementado com antibióticos, conforme apropriado. Use cada conjunto de ensaios de invasão de células fagocíticas para testar até 10 cepas mutantes (DinvA mutante e DphoP mutante estão com defeito na invasão e replicação intracelular, respectivamente). </li><li> Crescer as bactérias durante 14 horas a 37 ° C, com sHaking a 220 rpm, em 5 mL de cada um de caldo LB na frouxamente tapado 14 ml num tubo de polipropileno de fundo redondo. Caldo LB contém antibióticos apropriados, no nosso caso, a maior parte das estirpes mutantes são resistentes à canamicina, 50 mg / ml </li><li> No dia seguinte, cada uma das subculturas em culturas de estirpes de Salmonella em deslizamento 5 ml de caldo LB na proporção de 1:50 durante 4 horas adicionais, com agitação a 220 rpm. </li><li> Leia OD 600 valores de cada cultura bacteriana em um espectrofotômetro, e cada leitura deve variar 0,6-1,2 para otimizar Salmonella ilha de patogenicidade-1 tipo III sistema de secreção (SPI-1 TTSS) a expressão do gene para a invasão. </li><li> Utilizar a fórmula de uma OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / mL para estimar a concentração de bactérias, em seguida, dilua bactérias para uma concentração de 5 x 10 6 CFU / mL em DMEM fresco meio de cultura celular. </li></ol> 3 Ensaio de Invasão em 96 poços da placa Cultura <ol><li> Remova três cel 96 poçosplacas de cultura de l a incubadora de CO 2 e lavar uma vez com cada poço 200 ul de tampão PBS 1x. </li><li> Após a lavagem e a remoção completa de PBS, adicionar 200 uL de bactérias em meio DMEM (ver acima) para cada poço. Isto resulta em um x 10 6 células de Salmonella em cada poço e multiplicidade de infecção (MOI) de 20: 1. </li><li> Centrifuga-se as placas a 1.000 xg num veículo selado, durante 10 min, em seguida substituir placas (tempo zero) de 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 30 min. Para cada cepa, criou pelo menos quatro poços duplicados. </li><li> Após 30 min, remover placas do incubador e lavar três vezes com 200 ul de 1x PBS para remover as bactérias não associados. </li><li> Após a lavagem, exceto a placa marcado com &quot;associação&quot; para tratamento. Adicionar 200 ul de meio de DMEM contendo 100 ug / ml de gentamicina a cada poço das placas marcadas com &quot;invasão&quot; e &quot;de replicação&quot; em ordem to matar Salmonella extracelular. Devolver as placas a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante uma hora adicional. </li><li> Guardar um poço de cada estirpe infectada para gravar a contagem de células de macrófagos, tratar o resto dos poços na placa de &quot;associação&quot; com 200 ul de 1x PBS contendo 1% de Triton X-100 durante 10 min. A solução de Triton irá lisar células de macrófagos e libertar Salmonella associada. </li><li> Colheita de Salmonella em cada poço e colocá-los em tubos de 1,5 ml de Eppendorf. Realize três 10 diluições vezes com 900μl 1x PBS sobre as amostras colhidas de cada poço, vortex é realizada entre cada diluição. </li><li> Placa a terceira diluição 10 -3, em ambos LB (WT) ou LB Kan (mutantes) placas. Rotular as placas com nome apropriado Salmonella tensão, número de diluição, ponto de hora e data. </li><li> Após turbilhonamento do terceiro tubo de diluição, dispensar amostra de 10 ul sobre a superfície do agar e repetição fnossos tempos para um total de 5 gotas. Certifique-se de espaço a cinco 10 mL cai uniformemente nas placas de Petri prato 7. </li><li> Depois de absorver as gotas sobre o agar, as placas de transformar e incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Tratar poços guardados para a contagem de macrófagos com 150 1xPBS ul contendo 0,25% de Tripsina-EDTA durante 10 minutos. </li><li> Após tripsinização, macrófagos lugar em tubos de 1,5 ml de Eppendorf e tratá-los com 50 mL de FBS para neutralizar a solução de tripsina / EDTA, corar as células com 0,4% de azul de Tripan e marcou-los através da utilização de hemacitómetro. </li><li> Quando a incubação de uma hora tenha decorrido, remova a &quot;invasão&quot; e placas de &quot;replicação&quot; da incubadora de CO 2, e lavar cada bem como &quot;Passo 3.4&quot;. </li><li> Guarde a placa de &quot;invasão&quot; de tratamento adicional como &quot;Passo 3,6-3,12&quot;. </li><li> Adicionar 200 ul de meio DMEM contendo 10 ug / ml de gentamicina aa placa &quot;de replicação&quot; para manter a distância de Salmonella no meio extracelular. Retornar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 para uma incubadora de 22,5 horas adicionais. </li><li> No dia seguinte, remove a placa &quot;de replicação&quot; de 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora, e lava-se cada poço como &quot;Passo 3.4&quot; e tratá-los como &quot;Passo 3,6-3,12&quot;. </li><li> Por fim, retire as placas de agar após incubação durante a noite em 37 ° C incubadora e marcar o número de colônias de bactérias. </li><li> A distribuição boa colônia deve estar entre 10 e 100 colônias, cada ponto contém cerca de 2 a 20 colônias, que seria difícil de marcar, se houvesse mais de 20 colônias em um ponto. Se a contagem é muito baixa ou muito alta, replate a amostra com 10 diluições mais altas ou mais baixas, conforme necessário. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Calcular os (unidades formadoras de colônia por ml) CFU de cada placa com base no costadovolume e factor de diluição. </li><li> Determina-se o número de Salmonella por macrófagos através da contagem de células de macrófagos registada a partir de cada estirpe. </li><li> Calcular as médias geométricas de CFU por macrófagos a partir de pelo menos três experiências independentes para a associação celular, invasão ou replicação, respectivamente, e ainda mais para normalizar o WT para o valor relativo. </li><li> Analisar os dados de associação, invasão e replicação por teste t de Student, respectivamente, comparando cada cepa de WT, e determinar a significância estatística pelo valor p. </li></ol>

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

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O ensaio de protecção de gentamicina é amplamente utilizado para estudar a invasão e replicação de agentes patogénicos bacterianos intracelulares dentro da célula hospedeira, e é especialmente uma ferramenta importante para o estudo de organismos patogénicos biológico, como a Salmonella, cuja invasão é o passo de pré-requisito para o estabelecimento de infecção de 1. O ensaio padrão de proteção gentamicina na comunidade de pesquisa Salmonella é implementado em 24 bem plac...

Nontyphoidal Salmonella são importantes causas de doenças entéricas em todos os vertebrados. A salmonelose em humanos está entre as principais doenças de origem alimentar bacteriana 1. Caracterização dos mecanismos moleculares que estão na base das interações de Salmonella com seus hospedeiros animais é alcançada principalmente através do estudo da Salmonella Typhimurium enterica sorotipo (STM) em modelos de cultura de tecidos e animais de infecção. Busca de insights nas interações STM-hospedeiro nos ajudará a entender como Salmonella sobreviver e crescer dentro das células hospedeiras. O primeiro desafio em estudar essas interações é identificar o maior número de fatores de participantes possível, tanto acolhimento e patógeno, mas estes esforços são em grande parte obstruída pelas dificuldades significativas de lidar com dois sistemas biológicos complexos independentes simultaneamente, ou seja, de acolhimento e de Salmonella, sob condições fisiológicas. Além disso, o grande Repertoirê de Salmonella e genes do hospedeiro potencialmente fatores envolvidos na interação hospedeiro codificam exigem alto throughput plataforma biológica para enfrentar este desafio. A modificação, teste padronizado para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em macrófagos com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido para examinar um grande conjunto de genes provavelmente envolvidos em interações Salmonella -host. O ensaio de protecção de gentamicina foi desenvolvido em 1973 2, mas foi completamente descrita em primeiro lugar, em 1994 por Elsinghorst 3,4. Ela tornou-se uma ferramenta padrão para o estudo de muitos patógenos bacterianos intracelulares ex vivo, incluindo Salmonella 5,6. Bactérias internalizadas evitar ser morto por alguns antibióticos, como a gentamicina, que não podem penetrar as células eucarióticas 3. Tirando proveito desse fenômeno, o ensaio de proteção gentamicina mede a sobrevivência eo crescimento das ba intracelularpatógenos cterial. Três eventos durante a infecção, por exemplo, a associação com células eucarióticas, invasão e replicação, pode ser avaliada por agentes patogénicos bacterianos intracelulares, com base no intervalo de tempo entre a infecção, o tratamento de gentamicina, e após incubação (Figura 1). Linhagens de células eucarióticas proporcionar um ambiente fisiológico que é menos complexo do que os modelos animais relevantes para estudos de interação patógeno-hospedeiro. O ensaio de proteção gentamicina é uma plataforma adequada para estudar as interações STM-hospedeiro, mas o ensaio padrão de 24 poços cultura prato tem capacidade baixa taxa de transferência. Análise computacional de conjuntos de dados in vivo identificou 149 produtos de genes Salmonella que estão previstos para interagir com cerca de 300 produtos de genes de acolhimento (dados não publicados). O ensaio de protecção de gentamicina padrão não tem a capacidade de fenótipo este número de mutantes de forma eficiente. Em additião, o ensaio de protecção de gentamicina pode teoricamente detectar a invasão de mesmo uma única bactéria. Devido a esta sensibilidade inerente, os dados em bruto são susceptíveis a variações técnicas quando repetido em diferentes momentos. Os controles internos e de apresentação dos dados relativos após a normalização são essenciais para a interpretação significativa dos resultados. Dadas estas considerações, um ensaio de proteção gentamicina padronizado modificado foi desenvolvido para aumentar a capacidade de teste e aumentar a precisão. O protocolo seguinte é pormenorizada e ilustrada de realizar o ensaio de protecção de gentamicina modificada de 96 poços utilizando placas de cultura e a linha celular RAW264.7 de macrófagos de murino. Comparado com o protocolo padrão em pratos de 24 poços de cultura, o protocolo modificado tem as seguintes vantagens: 1) Utilização de 96 poços de cultura de placas permite que até 10 estirpes mutantes diferentes para ser fenotipados incluindo os controlos positivos e negativos internos, com potência estatística suficiente;2) A variância dos resultados é significativamente reduzida, porque as estirpes mutantes são testados no mesmo prato de cultura e, ao mesmo tempo; 3) O uso de pipetas multicanal aumenta a produtividade enquanto reduz a fadiga do operador. Por último, em comparação com 24 poços placas de cultura, as preocupações de menos células hospedeiras por poço em 96 poços prato de cultura foram abordadas através de otimização de protocolos e padronização. Em resumo, a modificação, o ensaio in vitro padronizado para Salmonella fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas aumenta a precisão e alcança a capacidade de elevado rendimento, reduzindo a fadiga do operador.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Espécies de Salmonella são patógenos zoonóticos e principais causas de doenças de origem alimentar em humanos e animais domésticos 1. A compreensão dos mecanismos subjacentes às interacções Salmonella -host são importantes para elucidar a patogênese molecular da infecção por Salmonella. O ensaio de proteção gentamicina para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em células fagocíticas foi adaptado para permitir a seleção de alto rendimento para definir os papéis dos mutantes de deleção de Salmonella enterica sorotipo Typhimurium em interações de host utilizando matérias 264,7 macrófagos murinos. Sob este protocolo, a variância em medições é significativamente reduzida em comparação com o protocolo padrão, porque o tipo selvagem e estirpes mutantes múltiplas pode ser testado no mesmo prato de cultura e, ao mesmo tempo. O uso de pipetas multicanal aumenta a produtividade e melhora a precisão. Além disso, as preocupações relacionadas com a utilização de menos host células por cavidade em 96 cavidades de cultura prato foram abordados. Aqui, o protocolo do ensaio modificado in vitro a invasão de Salmonella usando células fagocíticas foi empregue com sucesso para o fenótipo 38 individuais de Salmonella mutantes de deleção de associação, invasão e replicação intracelular. Os fenótipos in vitro são apresentados, alguns dos quais foram posteriormente confirmadas ter em fenotipos in vivo num modelo animal. Assim, a modificação, o ensaio padronizado para o fenótipo associação Salmonella, invasão e replicação em macrófagos com capacidade de alto rendimento poderia ser utilizada de forma mais ampla para estudar as interações de bactérias hospedeiras.

Veja resultados representativos (Figura 2) após os dados são plotados com base no ensaio de invasão de células fagocíticas modificado. Os dados incluem cinco estirpes diferentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A e B. mutante Δ invA, conhecido por ser defeituoso para a invasão, e ΔphoP conhecido por ser defeituoso para a replicação 8, são usados ​​como controles positivos para avaliar a validade experimental . Com efeito, no ensaio de invasão modificado,...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Um ensaio de elevado débito para a Salmonella in vitro o fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas, com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido. O método foi empregado para avaliar knockout gene Salmonella cepas mutantes de seus envolvimentos na interação patógeno-hospedeiro.

De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K visualizações.  Texas A&M University.  Um ensaio de elevado débito para a Salmonella in vitro o fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas, com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido. O método foi empregado para avaliar knockout gene Salmonella cepas mutantes de seus envolvimentos na interação patógeno-hospedeiro. 

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Imunologia e Infecção

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Um protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Com<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...