Macrófagos associados ao tumor desempenham papéis importantes no microambiente tumoral. Entenda como diferentes mutações genéticas nas células tumorais afetam o recrutamento de macrófagos é fundamental para projetar tratamento personalizado para pacientes com câncer. Este ensaio fornece uma maneira fácil e robusta de avaliar a interação entre células tumorais e macrófagos in vitro.
Este ensaio pode ser modificado para avaliar as interações entre as células tumorais e outras células imunes in vitro. Para iniciar este procedimento, aqueça o meio de células-tronco sem soro colocando-o em um banho de água a 37 graus Celsius por 20 minutos. Pulverize a superfície da capa da cultura tecidual com 70% de etanol e limpe a superfície pulverizada com toalhas de papel.
Em seguida, borrife as garrafas de solução de descolamento de células e médias com 70% de etanol e limpe-as com toalhas de papel. Transfira as garrafas limpas para o capô da cultura tecidual. Recupere a célula tumoral e transfira-a para a capa da cultura tecidual.
Aspire o meio e lave as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione dois mililitros de solução de descolamento celular ao frasco. Coloque o frasco no capô, verificando cada minuto para ver se as células tumorais se reuniram.
Uma vez que as células tumorais se arredondam, bata suavemente na lateral do frasco para ajudar as células a se desprenderem. Depois disso, pipeta oito mililitros de meio celular sem soro no frasco e pipeta para cima e para baixo três vezes para misturar. Transfira esta suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Aspire o supernatante. Em seguida, lave as células em 10 mililitros de PBS, certificando-se de pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes para misturar. Centrifugar as células a 200 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.
Aspire o supernasce, e resuspenda as células em 10 mililitros de meio livre de soro. Pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes para misturar. Misture 10 microliters desta suspensão celular com 10 microliters da solução Trypan Blue.
Em seguida, pipeta 10 microliters do Trypan Blue e mistura celular em um slide de contagem, e usar um contador automático de células para quantificar o número de célula viva. Use meio celular sem soro para ajustar a densidade celular para 2,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro. Em seguida, semente dois mililitros das células em cada poço de uma placa de seis poços de cultura.
Ao mesmo tempo, prepare seis poços com apenas dois mililitros de meio de células-tronco livres de soro. Depois disso, incubar as placas de seis poços a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Primeiro pulverize a superfície da capa da cultura tecidual com 70% de etanol e limpe a superfície pulverizada com toalhas de papel.
Em seguida, borrife as garrafas de solução de descolamento de células e médias com 70% de etanol e limpe-as com toalhas de papel. Transfira as garrafas limpas para o capô da cultura tecidual. Depois disso, recupere as placas de seis poços da incubadora.
Pipeta cuidadosamente a mídia condicionada em tubos de centrífugas estéreis de 15 mililitros e coloquem os tubos no gelo. Adicione 0,5 mililitros de solução de descolamento celular em cada poço das placas de seis poços, e verifique a cada minuto se as células tumorais se reuniram. Uma vez que as células tumorais se arredondam, bata suavemente na lateral da placa para ajudar a desprender as células.
Em seguida, 2,5 mililitros de meio de manutenção de células tumorais no poço e pipeta para cima e para baixo três vezes para misturar. Transfira as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Misture 10 microlitadores de células com 10 microliters da solução Trypan Blue, e transfira 10 microliters dessa mistura para o slide de contagem.
Use um contador automático de células para quantificar o número de células vivas, e use o meio de células-tronco sem soro que foi incubado a 37 graus Celsius durante a noite para ajustar o volume da mídia condicionada de acordo com o número da célula. Filtre a mídia condicionada através de filtros de 0,45 micrômetros e coloque a mídia condicionada no gelo. Para começar, aqueça o meio IMDM em um banho de água a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Limpe a capa da cultura tecidual com 70% de etanol e limpe a garrafa de meio e transporte-a para o capô como descrito anteriormente. Em seguida, transfira o frasco de células MV-4-11 para o capô. Pipeta 10 mililitros de células em um tubo centrífuga de 15 mililitros.
Use Trypan Blue e um contador automático de células para quantificar o número de células vivas como descrito anteriormente. Em seguida, centrifugar as células a 200 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspire o supernasce e lave as células com 10 mililitros de PBS.
Centrifugar novamente a 200 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspire o supernasce, e resuspenda as células em meio IMDM a uma densidade celular final de um milhão de células por mililitro. Primeiro leve os materiais necessários à temperatura ambiente.
Adicione 250 microliters das células MV-4-11 preparadas a cada inserção. Em seguida, adicione 400 microliters do meio condicionado ou médio apenas às câmaras inferiores da placa de 24 poços, certificando-se de adicionar as amostras em triplicado. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por quatro horas.
Em seguida, toque suavemente na inserção na parede interna do mesmo poço e descarte a pastilha. Pipete suavemente as células nos poços para cima e para baixo três vezes para misturar. Transfira 225 microliters desta suspensão celular para os poços de uma placa de 96 poços de paredes pretas adequada para medição fluorescente.
Depois disso, diluir o corante CyQUANT com tampão de 4x lysis em uma proporção de um a 75. Vórtice brevemente e girar a solução. Transfira 75 microliters desta solução para cada poço da placa de 96 poços e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.
Usando um leitor de placa de fluorescência, leia a fluorescência e analise os dados conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, um ensaio in vitro é usado para estudar a interação do macrófago tumoral. Amostras com altos valores de fluorescência indicam que a mídia condicionada tem alta capacidade de recrutar macrófagos.
Dependendo da necessidade experimental, controles adicionais podem ser incluídos. Por exemplo, pode-se usar anticorpos neutralizantes para tratar a mídia condicionada para abolir a quimiotaxis macrófago e executar da mesma forma. Pode-se também adicionar quimioterapias extras à mídia condicionada, que servem como um controle positivo.
É importante controlar as diferenças de número de células para este ensaio, porque diferentes tipos de células podem crescer em velocidades diferentes. A confirmação in vivo dos resultados in vitro são críticas. Pode-se injetar células tumorais em camundongos e analisar os tumores com citometria de fluxo, imunostaining e CyTOF para confirmar os resultados.
