This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

NOTA: Preocupações de segurança de laboratório Em consonância com as melhores práticas de laboratório padrão, observe o seguinte. Guarde todos os solventes orgânicos em locais apropriados. Mantenha todos os materiais de resíduos em contentores de resíduos químicos com uma rotulagem clara de composições químicas. Como vários reagentes utilizados nestes protocolos são potenciais agentes cancerígenos ou gerar gases combustíveis voláteis, lidar com todos os reagentes em um exaustor com ventilação. Use equipamento de proteção individual, como luvas, jaleco e proteção para os olhos quando se trabalha com solventes orgânicos. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" /> Figura 1. Processo para O-glycomics em gel. (A) As proteínas de interesse são resolvidos por SDS-PAGE, detectada por procedimentos de coloração apropriados (Coomassie ou prata), e excisadas. Pedaços de gel são excisadas fatiasem pequenos cubos, descorados, e lavou-se com acetato de etilo, para reduzir os contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS. Uma porção da porção de gel pode ser reservada para em gel de digestão tríptica e subsequente caracterização proteómica por LC-MS / MS. (B) glicanos ligados a O são libertados a partir de glicoproteínas resolvidos por eliminação redutiva β-em-gel. Passos essenciais incluem dessalinização e remoção de borato de azeótropo com metanol. (C) glicanos libertados pela eliminação redutiva β-O-ligada são permetilado e posteriormente repartiu-se em fases aquosa e orgânica. Sulfoglycans são quantitativamente recuperado na fase superior (aquosa) enquanto partição glicanos neutros e sialilados no (DCM) camada inferior. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2. Detalhe fluxograma para glycomics em-gel. Cada experimenTal passo mostrado na Figura 1 é ilustrado individualmente. (A) descoloração gel e extração AcOEt, (B) dirigir redutora β-eliminação em gel para liberação glycan O-ligados, e (C) permetilação e fase de partição. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.</a> 1. Gel excisão e remoção de contaminantes Gel derivadas <ol><li> Antes de iniciar o procedimento, preparar produtos químicos e reagentes listados na Lista de Materiais. </li><li> Resolver proteína em gel de SDS-PAGE utilizando sistemas de tampão de Tris-Glicina padrão. Stain proteínas com ou Coomassie Brilliant Blue ou prata Stain resolvido. Em geral, a recuperação de glicanos ligados em O a partir de géis corados com prata é aproximadamente 80-90% da recuperação conseguida a partir de géis corados com Coomassie. </li><li> Após a electroforese, colocar o gel sobre uma placa de vidro e t especial de consumoEle região de interesse utilizando um bisturi limpo ou lâmina de barbear. </li><li> Para aumentar o rendimento de O-glicanos, transferir a banda gel de interesse para outra placa de vidro e cortar o pedaço gel extirpado em aproximadamente dois milímetros cubos. Evitar fazer pedaços de gel menor do que 1 milímetro porque os cubos de recuperação de glicano é reduzida. Transferir os pequenos pedaços do gel para um tubo de vidro de tampa de rosca (13 x 100 mm) com um microspatula aço inoxidável. </li><li> Adicione 1 ml de 25 mM de bicarbonato de amônio (Ambic, NH 4 HCO 3) para o tubo de amostra, tampar o tubo de vidro com um parafuso de topo revestido de teflon, e misture delicadamente sacudindo o tubo antes de deixar repousar por 10 min. Não se empregar agitação vigorosa, a fim de evitar rasgar os pedaços de gel. </li><li> Remova cuidadosamente Ambic do tubo de vidro usando uma pipeta de vidro Pasteur ou pipeta equipado com uma ponta de plástico extra-longa. Evite esmagamento e transferindo os pequenos pedaços de gel durante a remoção da solução Ambic. </li><li> Adicionar 1 ml de acetonitrilo (ACN) para otubo de vidro, tampa, e misture delicadamente sacudindo tubo antes de deixar descansar por 10 min. Certifique-se de que as peças de gel são completamente coberto com solvente. Se necessário, empurre pedaços de gel fora da parede do tubo e em solvente com ponteira. </li><li> Pipeta off ACN do tubo de vidro e repita os passos 1,5-1,7 até que a cor azul brilhante é eliminado. Repetir um mínimo de cinco lavagens seqüenciais Ambic / ACN, se necessário. Para prata manchada géis, use um kit destain. Vá para a próxima etapa, quando a peça se transforma em gel enquanto uniformemente branca em ACN. </li><li> Pipetar qualquer líquido do tubo de vidro, recapitular o tubo, adicionar 1 ml de Ambic e deixe descansar por 5 min. </li><li> Remover Ambic e adicionar 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) para o tubo de vidro. Recapitulando tubo com tampa forrada de Teflon e colocar a 4 ° C durante a noite com agitação ao longo de ponta a ponta ou, alternativamente, executar três lavagens de EtOAc à temperatura ambiente durante 30 min cada. Quanto maior for a lavagem de EtOAc, o mais eficiente a remoção de contaminantes. </li><li> RemoverEtOAc a última lavagem e executar três lavagens cada uma com 2 ml de H 2 O. A remoção completa de EtOAc irá assegurar uma reacção de eliminação redutiva β-robusta. </li><li> Pipetar fora H2O e desidratar o gel por lavagem uma vez com 1 mL de ACN. NOTA: Após a secagem, os géis são desidratados pronto para β-eliminação em gel. Pedaços de gel desidratados podem ser armazenados a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Parar o processo de lavagem em qualquer passo e armazenar os pedaços de gel a 4 ° C durante a noite, independentemente de qual tampão ou solução é aplicada ao gel (Ambic, ACN, H 2 O). Reinicie a preparação da amostra a qualquer momento dentro dos próximos dois dias. </li><li> Usar uma porção dos pedaços de gel descorado e desidratados para identificação de proteínas por abordagens proteomic padrão. </li></ol> 2. Em gel de-O-glicano A libertação por redutiva β-Eliminação <ol><li> Prepara-se uma solução stock de 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), utilizando NaOH a 50% ou NaOH sólido e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. <ol&gt; <li> Tirar 5,2 ml de NaOH a 50% (ou 4 g de NaOH sólido) e ajustar o volume para 100 ml para fazer uma solução M de NaOH. Dilui-se a solução stock de NaOH a 1 M NaOH a 100 mM, que podem ser armazenadas a 4 ° C, até 6 meses, sem perda de eficiência em reacções β-eliminação redutiva. </li></ol></li><li> Adicione 2 M de boro-hidreto de sódio (NaBH4) em NaOH 100 mM. Dissolve-se 38 mg de NaBH4 em 0,5 ml de NaOH 100 mM. Geralmente, usam 0,5-1,0 ml da solução de boro-hidreto para cada amostra. Variar o volume da solução de reacção sobre a quantidade de pedaços de gel seco preparado no passo 1. Esperar para utilizar 0,5 ml de solução de boro-hidreto por 1-2 pedaços excisados ​​do gel (passo 1.3). </li><li> Adicionar 500 mL de NaOH 100 mM para os pedaços de gel desidratados e deixar repousar durante 3-5 min em gelo, a fim de equilibrar o gel às condições básicas que melhoram a recuperação de glicano. </li><li> Adicionar 500 ul de 2 M NaBH4 em NaOH 100 mM, resultando em concentrações finais de 1 M NaBH <sub&gt; 4 em NaOH 100 mM. Misturar suavemente o tubo e incubar a 45 ° C durante 18 h. <ol><li> Durante a primeira hora de incubação, misturam suavemente o tubo a cada 15 min. Evitar agitação forte, uma vez que pode fragmentar os pedaços de gel. Realizar a reacção num incubador / forno bem equilibrada ou num bloco de aquecimento. Assegure-se que os pedaços de gel são cobertos com uma solução de reacção. </li></ol></li><li> Parar a reacção por remoção do tubo de amostra a partir da incubadora ou do bloco de aquecimento e colocando-a em gelo. NOTA: Depois de se deixar a reacção β-eliminação prosseguir durante 18 h, o processo de dessalinização deve ser realizada no mesmo dia. </li></ol> 3. Cromatografia em Dessalinização permutadora de catiões <ol><li> Enquanto se mantém o tubo de amostra em gelo para evitar a formação de calor excessivo, adiciona-se lentamente 10% de ácido acético (AcOH) gota a gota a neutralizar a base. Gentilmente vortex o tubo de amostra entre as adições de AcOH. Tenha o cuidado de adicionar ácido lentamente e gota a gota, como o additino de ácido irá produzir um &quot;vulcão&quot; das bolhas. Centrifuga-se o tubo para eliminar as bolhas e evitar transbordamento, se necessário. <ol><li> A fim de remover a grande quantidade de sódio na mistura de reacção, passar a mistura de reacção através de uma coluna de permuta catiónica pequena (ou resina Dowex AG-50W-X8, na forma H +). </li><li> Lava-se a resina de permuta catiónica com NaOH e 1 M de HCl 1 M, antes da utilização, a fim de remover os contaminantes que interferem com a análise por MS, mesmo se a resina é de grau analítico. </li><li> Soak a resina em NaOH 1 M e remover a solução por decantação. Adicionar água deionizada, remover a água, em seguida, adicione 1 M HCl. </li></ol></li><li> Repita essas etapas até que a solução acima da resina é incolor. Lava-se a resina limpas com água deionizada e armazenar em 5% de AcOH a 4 ° C. </li><li> Para fazer com que uma pequena coluna de vidro, zero e quebrar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro usando um cortador de cerâmica, de modo que a inclinação da ponta da pipeta é cerca de 1 cm de comprimento. Provocar uma separação de um tampão de lã de vidro e empurrar no sentido da ponta formando um suporte para o leito de resina. Fixe a coluna pipeta com uma pinça ou prendedor de roupa e coloque sobre um tubo de ensaio de vidro. </li><li> Lava-se a pipeta de vazio com 1 ml de metanol (MeOH) e 3 ml de 5% de AcOH. Redemoinho H + Dowex ou pasta de resina de permuta catiónica AG50 armazenado em 5% de AcOH e transferir suficiente da lama para produzir um volume de leito de 1 ml na coluna pipeta de Pasteur. </li><li> Lavar a coluna com cinco volumes de 5% de AcOH. Verifique fluir através do aparecimento de partículas de resina e não use a coluna de resina se for detectado. </li><li> Coloque coluna sobre um novo tubo de tampa de rosca de vidro (16 x 125 mm) e amostra de carga. Recolhe-se o fluxo através de glicanos e eluir com, pelo menos, 3 volumes de 5% de AcOH no mesmo tubo. </li><li> Cobrir o tubo com Parafilm e fazer pequenos furos com uma agulha. Colocar o tubo de amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Uma vez congelado, secar a amostra por liofilização. Armazenar o material seco a -20 °C até à sua utilização. </li></ol> 4. Remoção Borato <ol><li> Prepare a 10% de AcOH em MeOH. Tomar 10 ml de ácido acético glacial e ajustar o volume a 100 ml com metanol. Guarde este reagente em um frasco de vidro com tampa forrada de Teflon para até 6 meses. </li><li> Adicionar 300 ul de AcOH a 10% em MeOH à, liofilizada tubo de amostra seca e vortex. Remover o borato de trimetilo resultante por evaporação sob uma corrente de N 2. NOTA: Mistura de sais borato com metanol sob condições ácidas produz borato de trimetilo, que é um composto volátil. </li><li> Seca-se sob fluxo de N2, a 37 ° C. Após a secagem, adiciona outra aliquota de AcOH em MeOH como se descreveu na etapa 4.2. Seca-se o líquido durante 5 min sob atmosfera de azoto (N 2) fluxo a 37 ° C. <ol><li> Repetir a ressuspensão e secagem, pelo menos, 3 vezes. Armazenar o material seco a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 5. C18 Clean-up <ol><li> Equilibrar a coluna de cartucho C18(Tamanho 1 ml, 100 mg de resina), utilizando três volumes de ACN e cinco volumes de 5% AcOH. Acelerar a passagem das soluções equilibrantes através da aplicação de pressão positiva de ar suave. </li><li> Adicionar 500 ul de 5% de AcOH para o tubo de amostra dessalinizada e livre de borato dissolver e por vórtice. </li><li> Carga da amostra ressuspensa numa coluna C18, equilibrada e recolher o fluxo através de um tubo em vidro com tampa de rosca (13 x 100 mm). Eluir O-glicanos com 3 ml de 5% de AcOH para o mesmo tubo. </li><li> Parafilme o tubo, fazer pequenos buracos com uma agulha pequena ou use a tampa forrada de PTFE frouxamente fechada para cobrir o tubo, e congelar a amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Remover o solvente por liofilização. Armazenar a amostra seca a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 6. Preparação Base para permetilação NOTA: A fim de alcançar permetilação robusto, preparar NaOH pasta fresca. Toda a vidraria utilizado para reacções de permetilação deve ser extensivamente limpo. <ol><li> Para preparar o reagente de base para permetilação, adicionar 400 ul de NaOH a 50% para um tubo de tampa de rosca de vidro limpas (13 x 100 mm). Adicionar 800 mL de MeOH anidro e vortex. </li><li> Adicionar 4 ml de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) e vortex para gerar um precipitado branco. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 1 min para sedimentar o precipitado. Pipeta off sobrenadante e descartar. Adicionar um adicional de 4 mL de DMSO anidro para o sedimento. Vortex. </li><li> Repita o passo 6.2 e 6.3, no mínimo, mais três vezes, ou até que forme um precipitado branco. </li><li> Dissolva a base peletizada em 3 ml de DMSO anidro e misture delicadamente por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur limpa. </li><li> Utilize a base imediatamente para a reacção seguinte como a permetilação não pode ser armazenado. </li></ol> 7. permetilação de glicanos libertados <ol><li> Adicionar 200 ul de DMSO anidro para a amostra C18-purificado e vortex ou sonicado para ressuspender. </li><li> Adicionar 300 ul da resusppasta base de ended para a amostra e imediatamente adicionar 100 ml de iodometano (MEI). Selar tubo com tampa forrada de Teflon e vigorosamente para misturar 5 min por vórtice. </li><li> Para parar a reacção permetilação, adicionar 2 ml de 5% de AcOH em gelo e vortex. Pipeta solução cima e para baixo cinco vezes para reduzir o volume restante de MeI por evaporação. NOTA: O AcOH neutraliza a solução de MeI e remoção aumenta a eficiência da extracção de glicanos sulfatados para a fase aquosa durante a-partição de fase. </li><li> Adicionar 2 ml de diclorometano (DCM) e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min à temperatura ambiente para separar as fases aquosa e orgânica. </li><li> Transferir a camada superior (fase aquosa que contém a maioria dos glicanos sulfatados permetilado) para um novo tubo de vidro (13 x 100 mm). </li><li> Adicionar 2 ml de H 2 O para a fase orgânica e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min para separar as fases aquosa e orgânica e combinar esta segunda fase aquosa com o abetofase aquosa st (passo 7.5). </li><li> Repetir o passo 7.6 e 7.5 mais três vezes, mas não há necessidade de guardar as fases aquosas resultantes das partições subsequentes. </li><li> Retirar a camada final de topo (fase aquosa), tanto quanto possível a partir da camada inferior (fase orgânica) e transferir a camada inferior (fase orgânica) para um tubo de vidro de novo separada usando uma pipeta de Pasteur limpa. </li><li> Seca-se a fase orgânica sob fluxo de N2 a 42 ° C. </li><li> Cobrir o tubo com parafilme e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 8. C18 Clean-up de permetilado Sulfatado O-glicanos da fase aquosa <ol><li> Equilibrar a coluna de cartucho C18 com três volumes de ACN e cinco volumes de 5% de AcOH. </li><li> Carregar as fases aquosas recolhidas e combinadas a partir dos passos 7.5 e 7.6 na coluna. </li><li> Lava-se a coluna com 10 ml de H 2 O para dessalinização. </li><li> Eluir a permetilado sulfatado O-glicanos para um novo tubo de vidro com 2 mlde 50% de ACN. Use uma eluição adicional com 85% de ACN para melhorar a recuperação de permetilado sulfatados O-glicanos em oligossacarídeos maiores. </li><li> Eluatos secos sob corrente de azoto a 42 ° C. </li><li> Armazenar o material seco a -20 ° C até 6 meses antes da análise por MS. </li></ol> 9. Espectrometria de Massa de permetilado O-glicanos <ol><li> Analise permetilado O-glicanos por infusão directa para um espectrómetro de massa adequado usando uma fonte de nanoelectrospray a um caudal de 0,40-0,60 seringa ul / min a 210 ° C de temperatura de capilar. Para fragmentação por CID em MS / MS e MS n de um instrumento ion trap, aplicar 30-40% da energia de colisão. </li><li> Para o modo de ião negativo, reconstituir permetilado sulfatado O-glicanos em 50 mL de metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM de acetato de amónio aquoso (16: 3: 3: 2 em volume). Para o modo de ião positivo, reconstituir permetilado neutros / O-glicanos sialilados em 50 ul de 1 mM de sódio hidrohidróxido O em metanol / água (1: 1). </li><li> Use o mapeamento de íons (TIM) e varredura de perda neutra (varredura NL) funcionalidade do pacote de software Xcalibur versão 2.0 para análise MSN para caracterizar estruturas O-glicano individuais 13,19. </li></ol>

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J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular 1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de 4,5 glicosilação celular e tecidual. A fim de compreender a contribuição de glicoproteína de glicosilação para a fisiologia e patofisiologia tecido, robusto, sensível e técnicas analíticas glycomic abrangentes tornaram-se cada vez mais importante. Na análise proteômica, identificações de proteína são geralmente alcançado por LC-MS/ MS de péptidos trípticos 6. Digestão de proteínas pode ser realizada utilizando uma proteína ou proteínas purificadas resolvidas por SDS-PAGE após digestão em gel com proteases tais como tripsina 7-9. Pré-enriquecimento da mistura de proteína por SDS-PAGE aumenta a profundidade e precisão de identificação de proteínas. O desenvolvimento de estratégias análogas para análise glycomic de glicoproteína glicosilação se encontra na vanguarda da glycoscience. As duas principais classes de glicanos estão ligados a espinha dorsal de proteínas, quer através de ligação ou N-O-ligação. Glicanos ligados a N estão ligados a asparagina (Asn) resíduos encontrados como parte de um sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X é qualquer aminoácido excepto prolina), e pode ser libertado por digestão enzimática com N pï¿½tido -glycanase (PNGaseF ou A), quer em solução, em gel, ou sobre-blot 10-12. Glicanos ligados a O estão ligados principalmente a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos. No entanto, apenas uma enzima foi idenficada que é capaz de libertar os glicanos ligados em O de glicoproteína e tem uma especificidade de glicano extremamente limitada, libertando apenas os glicanos ligados em O mais simples. Estratégias de liberação química continuam sendo o método de escolha para a liberação completa de glicanos ligados em O de glicoproteínas. Β-eliminação redutiva ou não-redutora, ou hidrazinólise são técnicas de liberação química bem caracterizados e são atualmente as abordagens mais comumente usadas para a liberação glicanos ligados em O de glicoproteínas 13,14. Embora β-eliminação redutiva foi usado para libertar os glicanos ligados em O a partir de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, as abordagens anteriores necessária separação por HPLC para análise subsequente 15-17. Análise multidimensional MS (MS n) fornece atualmente a mais rica fonte de dados estruturais para a caracterização de glicanos libertados de glicoproteínas isoladas nos valores esperados da maioria das fontes biológicas. A profundidade da EMcaracterização estrutural baseado é muito facilitada por permethylating os glicanos divulgados antes da sua análise. Permetilação aumenta ionização e tende a igualar as respostas sinal molares através de uma ampla gama de estruturas de glicano 18,19. Além disso, permetilação inequivocamente Tag metades monossacarídeos terminais e substituídos com massas distintas, aumentando assim elucidação estrutural 20-23. Por exemplo, glicanos ácidas são geralmente difíceis de detectar, como espécies não permetilado por MS. Embora glicanos ácidas pode ser detectado no modo de iões negativos por MS, é impossível detectar ambos os glicanos ácidas e neutras no mesmo modo de ião. Uma grande vantagem do permetilação glicano é que todos os grupos hidroxilo livres (OH) em substituintes de monossacárido de um glicano vai ser tapado com um grupo metilo (OCH3 ou OMe), assim taxas de sialilados de glicano são neutralizados, tornando-os como detectável como permetilado neutro (ásialo) glicanos. No entanto, os hidroxilos de metades de sulfato em sulfoglycans são resistentes a permetilação, resultando na retenção de carga aniónica, o qual suprime a ionização e diminui a sensibilidade. Esta supressão impede actualmente análise glycomic abrangente de glicoproteínas muito complexas tais como mucinas, que carregam uma alta abundância de glicanos sulfatados 24-26. As recentes notícias sobre purificação sulfatada glicanos usado cobrado, cromatografia de fase reversa para purificar e glicanos permetilado separados antes da análise MALDI. Este método baseia-se na separação completa de glicanos sulfatados e não sulfatados com diferentes fases móveis para a eluição, o que temos encontrado para ser menos rigorosas do particionamento fase orgânica. Portanto, as novas técnicas adequadas para a detecção e enriquecimento de sulfoglycans são apresentados aqui. Estas técnicas permitem a recuperação quantitativa de glicanos sulfatados na fase aquosa de água seguinte: DCM (diclorometano)de extracção, que é realizado rotineiramente no final de reacções de glicano 27 permetilação. É importante ressaltar que esta separação robusto de sulfoglycans permetilado partir de uma mistura de glicanos não-sulfatados permetilado enriquece concomitantemente para espécies carregadas ao mesmo tempo, simplificando MS dois padrões de fragmentação. Também é apresentado um protocolo global para melhorar a análise de glicanos ligados-O em-gel. O protocolo melhorado aumenta a recuperação de glicano, aumenta a informação estrutural obtida através de análise de MS n glicanos permetilado, e melhora a sensibilidade das análises sulfoglycomic aplicadas às glicoproteínas essenciais isolados a partir de fontes biológicas. Este protocolo destina-se a análise de glicano ligado em O de extractos de glicoproteínas integrais ou de uma glicoproteína específica de interesse resolvidas por SDS-PAGE e é composto por três procedimentos experimentais; A) gel de limpeza, B) redutora β-eliminação em gel, e C) permethy glycanlação. O objectivo é a obtenção de dados glycomic ligados a O abrangentes para glicoproteínas colhidas a partir de fontes primárias de interesse biológico (Figura 1). As glicoproteínas separadas por SDS-PAGE são visualizadas por coloração e as bandas de interesse são excisadas e a banda de gel resultante é cortado em pequenos pedaços. Os pedaços de gel são descorado e sujeito a lavagens de acetato de etilo para remover contaminantes de gel (Figura 2A). Libertação de glicano é conseguida por eliminação redutiva β-em-gel (Figura 2B) e os glicanos libertados são permetilado. Aquoso-orgânico de extracção seguinte permetilação quantitativamente particiona os aniónicos sulfatados glicanos longe de glicanos neutros não-sulfatados (Figura 2C). Em gel de redutiva-β-eliminação acoplado a extracção aquosa-orgânica permite a caracterização e de glicanos ligados em O sulfoglycans libertados a partir de pequenas quantidades de glicoproteína separadas por SDS-PAGE. A visão estratégica é summarized na Figura 1 e os detalhes estão apresentados na Figura 2. Além disso, uma porção dos pedaços de gel descorado e lavados pode ser utilizada para identificação da proteína por técnicas de proteómica LC-MS / MS padrão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Efeito de acetato de etilo Tratamento Antes de Na-gel redutiva β-Eliminação Um espectro de massa representativo do permetilado amostras de glicano ligadas em O libertados de bovino usando mucina redutiva β-eliminação no-gel é mostrado na Figura 3. A lavagem de EtOAc dos pedaços de gel de SDS e remove eficazmente poliacrílicos contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS 27. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

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Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Unit 1

Nucleophilic Substitution and Elimination Reactions of Alkyl Halides

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Química

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Análise de Moléculas Complexas e Suas Reações em Superfícies por meio da espectrometria de desormetria/desonização induzida por cluster

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Abordagens de espectrometria de massa de eletroforese capilar para caracterização da proteína e corona metabólica adquirida por nanomateriais

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterizando modificações de RNA em neurônios únicos usando espectrometria de massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...