This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos. 1. Modelos de Investigação <ol><li> Cultura celular <ol><li> Manter as células embrionárias de rim humano (HEK-T293) as células em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Cultivar células em frascos T75 e permitir-lhes chegar a 90% de confluência. </li><li> Levar a cabo a divisão celular através de tripsinização (0,25% de tripsina-EDTA) durante 3-5 min a 37 ° C em 5% de CO 2 </sub&gt;, A inactivação da tripsina com um volume igual de meio celular, e centrifugação das células durante 5 min a 700 xg a 4 ° C. </li><li> Aspirar a mídia e colocar o agregado de células em meios de cultura. </li><li> Semear as células em placa ou o frasco apropriado de 7 x 10 4 células para um frasco T75 48 h antes da citocina de tratamento. Isso deve dar ~ 70% de densidade no momento do tratamento. </li><li> Células morrem de fome de soro 24 horas mais tarde, aspirando a mídia e substituí-lo com o mesmo volume de meios livres de soro (DMEM, estéril). </li><li> Prepare o TNF-α, IL1-β, e IFN-γ, de pó liofilizado com água ultra-pura em concentrações úteis de 5 pg / mL, 10 ng / mL, e 10 ng / mL, respectivamente, e adicioná-los aos poços / frascos. </li><li> Soro mimo células fome pela adição de citocinas solubilizadas directamente ao meio de cultura de células de frascos apropriados. Os tratamentos consistiram de citocinas individuais, um cocktail de todos os 3 (designado por &quot;* 3&quot;), ou sterile água como um controlo (referido como &quot;0&quot;). </li><li> Incubar as células tratadas durante 24, 48 ou 72 horas antes da avaliação e colheita. </li></ol></li><li> Avaliação da viabilidade celular <ol><li> Adicione uma solução de 5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) em PBS 1x. </li><li> Para placas de 12 poços, adicionar 100 ul de solução de MTT a cada poço e agitar suavemente para assegurar uma distribuição uniforme. </li><li> Incubar as placas durante 15 min-1 hora a 37 ° C em 5% de CO 2, e verificar sob um microscópio para a presença de uma coloração púrpura. Se nenhum roxo está presente, agite novamente e permitir que as células para incubar em intervalos de 5 minutos até que roxo é observado. A quantidade de tempo necessária, deve ser determinada por cada investigador. </li><li> Usando uma pipeta de repetição, adicionar 700 ul de MTT solvente (HCl 4 mM e NP40 a 0,1% em isopropanol) a cada poço e agitar a placa (s) à temperatura ambiente durante 5-10 minutos, ou até toda a cor púrpura tinha deixado as células . Se o roxocor não sai das células, adicionar um adicional de 200 mL de solvente e continuar a girar. </li><li> Para a análise, levar 100 uL de cada poço e colocar numa placa de 96 poços e lidas num leitor de placas usando 570 nm e um comprimento de onda de referência de 630 nm, 595 nm no entanto também é aceitável, desde que as leituras são tomadas a configurações consistentes. </li></ol></li><li> Modelo Animal de ALS <ol><li> Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos. </li><li> Realizar genotipagem com primers padrão contra SOD1 mutante 25. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento de mitocôndrias ATENÇÃO: É importante trabalhar com rapidez e manter tudo em gelo durante todo o procedimento. <ol><li> Preparação de tampão de isolamento mitocondrial (MIB), tampão de isolamento da medula espinal (SC MIB) e tampão experimental (EB) <ol><li> Prepare as seguintes soluções de antecedência para MIB e EB. </li><li> Adicione 1 M Tris / MOPS por dissolução de 12,1 g de base Tris em 70 ml de H 2 O. Adicionar MOPS secos para obter o pH a 7,4. Ajustar o volume para 100 ml final. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li><li> Faça 1 M Kphos misturando 80,2 ml de K 2 HPO 4 e 19,8 ml de KH 2 PO 4. Guarde-o em temperatura ambiente. </li><li> Adicione 0,2 M de EGTA / Tris, adicionando 3,8 g de EGTA a 10 ml de H 2 O. Adicionar 1 M Tris / MOPS até dissolvidos, ~ 30-40 ml. Ajuste para 50 ml, filtro estéril e armazenar em temperatura ambiente. Note-se que o pH ser ~ 6,7. </li><li> Adicione 1 M glutamato, fazendo 10 ml de1 M de solução de ácido glutâmico. Esterilizar por filtração e armazenamento de 4 ° C. </li><li> Adicione 1 M Malato fazendo 10 ml de 1 M de solução de ácido málico. Adicionar Tris / MOPS a 50 mM. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione MIB a uma concentração de 200 mM de sacarose, 10 mM de Tris / MOPS, pH 7,4, e 1 mM de EGTA / Tris. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione MIB SC a uma concentração de 250 mM de sacarose, 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, e cocktail inibidor de protease. </li><li> Adicione EB, a uma concentração de KCl 125 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamato, 2,5 mM de malato, 1 mM de fosfato de K, pH 7,4, e 10 mM de EGTA / Tris. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equipamento de preparação, antes da colheita das células. <ol><li> Lavar um pequeno recipiente de vidro e homogeneização pilão três vezes com água estéril e colocar em gelo. </li><li> Reúna os itens necessários, como uma broca standard, scra celularpers, 1,5 ml, 15 ml e 50 ml de tubos e soluções. </li></ol></li><li> As mitocôndrias Isolation <ol><li> Células cultivadas <ol><li> Para cada tipo de amostra, use dois frascos T175 de células. </li><li> Certifique-se de que as células são ~ 90% confluentes e usar em experiências de controlo, ou a placa e tratar como acima descrito no passo 1.2. </li><li> No topo da bancada, meios de aspirado e lavar as células aderentes duas vezes com 15 ml de 1x PBS de cada vez. </li><li> Aspirar o tampão e raspar frascos para remover as células aderentes a partir do fundo do balão. </li><li> Adicionar 15 ml de PBS 1x a cada frasco, redemoinho, e transferir para cada 15 ml tubos cônicos e colocar no gelo. </li><li> Uma vez que é feito raspagem, centrifugar os tubos durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C utilizando uma mesa de centrífuga de topo, usando um rotor de balde oscilante. </li><li> Sobrenadantes Aspirar e ressuspender cada pellet em 1 ml de MIB. </li><li> Combine as duas suspensões e transferir para um pequeno recipiente de vidro para a homogeneização. </li><li> Adicionar MIBpara o reservatório até que atinja o tampão de primeira linha. Homogeneizar células com as pilão ligados a um misturador a velocidade média durante três passagens. Certifique-se que o navio está no gelo durante esta etapa, não para remover as pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passes contínuas. </li><li> Transferir a solução homogeneizada de um tubo cónico de 50 ml. </li><li> Desenhe a solução para uma seringa de 3 ml usando um calibre 18 1 ½ polegada de agulhas e expulsá-lo de volta para o tubo cônico no gelo com uma agulha de calibre 27 ½ polegadas. Cuidar para expelir a solução contra a parede interior do tubo como para utilizar a força de ruptura da membrana celular. </li><li> Repetir os passos de seringa para um total de cinco vezes. </li><li> Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 5 minutos a 600 xg, a 4 ° C numa centrífuga de topo de mesa utilizando um rotor de balde oscilante. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e distribuir entre três tubos de 1,5 ml. NOTA: Mitochondria são no sobrenadante após esta primeira, centrifugação de baixa velocidade, enquanto que as membranas celulares e as células não rompidas foram sedimentadas. </li><li> Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Sobrenadantes Aspirar e combinar as pelotas em 100 l MIB e coloque imediatamente em gelo. NOTA: As mitocôndrias são no sedimento após esta rotação de alta velocidade. As mitocôndrias será normalmente mantêm o seu potencial de membrana de ~ 2-3 de iões de gelo, depois do isolamento e são mais estáveis ​​como uma solução mãe concentrada no MIB. </li></ol></li><li> Isolamento mitocôndrias de tecido do mouse <ol><li> Anestesiar o mouse de acordo com o protocolo IACUC. Definir um vaporizador em 5,0% para induzir a anestesia. Confirmou que o animal é anestesiado por uma falta de reflexo para pitada pé ou reflexo de piscar quando o olho é abordado ou batido com um cotonete. Manter o rato sob anestesia por todo o procedimento cirúrgico, mantendo o vaporizador entre 1,5% e 2,0%. </li><li> Excise o fígado e da medula espinhal de cada animal e local separadamente no gelo frio 1x PBS - / - para enxaguar qualquer sangue. </li><li> Para o fígado, a transferência do tecido para um prato de pesagem em gelo e corte em pequenos pedaços utilizando uma lâmina de barbear fresco durante 1 min. </li><li> Adicionar tecido e tampão apropriado (MIB para o fígado ou SC MIB para a medula espinhal) para o reservatório até que atinja o tampão de primeira linha. Homogeneizar o tecido com o pilão à mão por cinco passes. Certifique-se que o navio está no gelo durante esta etapa, não para remover as pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passes contínuas. </li><li> Transferir os homogeneizados para limpar tubos de 15 ml. </li><li> Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 750 xg, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Salve os sobrenadantes para tubos limpos e colocá-los no gelo. NOTA: As mitocôndrias são no sobrenadante após esta primeira, centrifugação de baixa velocidade, enquanto que as membranas celulares e as células não rompidas foram sedimentadas. </li><li> Re-suspender as pelotas da medula espinhal in 500 ul de SC MIB. </li><li> Re-homogeneizar cada três vezes, só enchendo o recipiente com meio caminho SC MIB neste momento. </li><li> Transferir o novo homogeneizado para um tubo fresco. </li><li> Centrifugar a num rotor de ângulo fixo a 750 xg, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Combinar estes novos sobrenadantes, os quais contêm mais mitocôndrias, com o primeiro sobrenadante de cada amostra. </li><li> Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar os sobrenadantes e ressuspender as pastilhas de fígado em 500 ul de MIB e as pelotas medulares em 50 ul SC MIB e colocar imediatamente em gelo. NOTA: As mitocôndrias são no sedimento após esta rotação de alta velocidade. As mitocôndrias será normalmente mantêm o seu potencial de membrana de ~ 2-3 de iões de gelo, depois do isolamento e são mais estáveis ​​como uma solução mãe concentrada no MIB. </li><li> Realizar um ensaio de concentração de proteína para estimar a concentração de mitocôndrias em solução. Seguir as instruçõess para usando um Kit de Ensaio de Proteínas comerciais ou método semelhante 26. As concentrações típicas são de mitocôndrias: 2 frascos T175 rendimentos ~ 2 mg / mL, 1 de fígado de rato ~ 3-5 mg / ml, e um rato medula espinhal ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> Ensaio citocromo c usando um R &amp; D Rat / Mouse citocromo c Quantikine ELISA Kit (adaptado do protocolo fornecido pelo fabricante). <ol><li> Imediatamente antes de configurar as reações, diluir mitocôndrias a 0,5 mg / ml concentração trabalhar com EB e distribuir mitocôndrias diluídos em tubos de 1,5 ml para as reações (tipicamente 30-50 mL de mitocôndrias por tubo). </li><li> Adicionar ou EB ou DMSO, a 1% do volume total, para as mitocôndrias diluído e incuba-se as reacções no cimo da bancada durante 7-10 min. Estas reacções são estáveis ​​durante até 30 minutos à temperatura ambiente, se for necessário um período de tempo mais longo. </li><li> Mitocôndrias pelete por centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, a 4 ° C durante 5 min e cuidadosaly separar o sobrenadante e colocar em cada uma separada tubos de 1,5 ml. NOTA: Os tubos podem ser congeladas a -20 ° C para posterior análise ou utilizado imediatamente. </li><li> Determinar a libertação de citocromo c por uma comparação da concentração de citocromo c no sedimento e sobrenadante 27. <ol><li> Preparar as amostras por solubilização dos peletes no volume original da reacção com 0,5% de Tx-100 em PBS 1x. </li><li> Para cada amostra, preparar dois poços na placa de ELISA, uma para o sedimento agora solubilizado e um para o sobrenadante a partir da reacção por adição de 100 ul de conjugado de citocromo c (pode ser usado imediatamente para fora do frasco) mais 100 ul de 0,5% Tx 100 em 1x PBS, e então todo o sedimento ou sobrenadante da amostra. </li><li> Gentilmente vortex a placa um nível baixo (nível 2-4) por 20 segundos para misturar, tampa e incubar durante 1 hora, 37 ° C. </li><li> Em seguida, lava-se a placa quatro vezes com tampão de lavagem diluído de acordo com o FABRICAÇÃOinstruções de pronto-socorro. Remova qualquer excesso de solução tocando os poços em papel toalha. </li><li> Em seguida, adicionar 150 ul de 1: 1 de A + B Solução de desenvolvimento a cada poço e incubar a placa durante 20-30 minutos no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Finalmente, adicione 50 ml de solução de parada em cada poço e fazer leituras de absorbância a 540 nm usando um leitor de microplacas. Calcular a quantidade de libertação de citocromo c por comparação da quantidade de citocromo c na pelete vs sobrenadante para cada reacção. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Avaliação da função mitocondrial (Dys) <ol><li> Imediatamente antes de reacções são configurados, diluir mitocôndrias a 0,5 mg / ml de concentração de trabalho com EB e colocado em tubos de 1,5 ml para as reacções (tipicamente 30-50 ul de mitocôndrias são utilizados por tubo). </li><li> Tratamentos mitocondriais <ol><li> Adicionar tratamentos apropriados (controlo EB, 1 uM FCCP misturado com 50 nM de valinomicina, 10 uM rotenona, 5 uM oligomicina, KCN 2 mM, ou 200 uM de ADP, as concentrações finais) para separar as reacções em 1/10 do volume total de mitocôndrias diluído. Incubar as reações na bancada para 7 min. NOTA: É preciso ter cuidado ao manusear estas substâncias como a ingestão ou absorção acidental através da pele pode ser prejudicial. </li><li> Diluir TMRE, reconstituído em água estéril a uma concentração de trabalho de 100 uM e armazenadas a -20 ° C, a 2 uM e adicionar um volume igual ao volume de reacção mitocondrial. </li><li> Incubar as reações na bancada para 7 min. </li><li> Mitocôndrias pelete por centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Carga de metade do volume de sobrenadante de cada amostra para uma placa de 396 poços e ler a fluorescência. NOTA: excitação e de emissão de comprimentos de onda TMRE deve ser optimizado de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o volume e a placa que irá ser utilizado parao ensaio. Usando uma placa de 384 poços padrão preto com 25 ul de 1 uM TMRE (concentração final da reacção) o sinal mais forte foi obtido utilizando comprimentos de onda de excitação / emissão &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Calcula-se a diferença em prega-fluorescência entre o controlo (EB) e cada tratamento dividindo o valor da fluorescência relativa (RFU), obtida a partir do leitor de placas para a amostra experimental pela RFU na amostra de controlo. </li></ol></li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+optical+oxygen+sensing:+protocols+and+critical+analyses.">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis.">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O tratamento de células HEK-293T com citocinas recombinantes provoca quantidades moderadas de morte de células ao longo de 48 horas (Figura 1). A quantidade de morte celular induzida por tratamento TNF-alfa é semelhante aos estudos previamente relatados 30 e a viabilidade celular diminui após a co-administração de várias citocinas que são maiores do que as quantidades aditivas com qualquer citocina sozinha também é consistente com a literatura 31,32. A capacidade de ajust...

As células vivas depositar energia metabólica sob a forma de gorduras e hidratos de carbono e utilizar esta energia para a biossíntese, transporte de membrana e movimento. Alguma energia é obtida no citossol através da conversão dos açúcares alimentares directamente em ATP durante a glicólise. No entanto, a principal fonte de produção de ATP numa célula é aproveitada dentro das mitocôndrias através da cadeia respiratória mitocondrial 1. A arquitectura de mitocôndrias proporciona a orientação espacial necessária para a produção de ATP efectiva e eficiente. As mitocôndrias possuem uma membrana dupla separados por um espaço intermembranar e em conjunto com a matriz, o compartimento mitocondrial mais interna, a casa dos componentes e coordenar as reacções químicas envolvidas na geração de ATP. A membrana interna contém uma série de complexos de proteínas ligadas a membranas que compreendem a cadeia respiratória, assim como o ATP sintase, o complexo de proteína que traz ADP e Pi juntos para a formação de ATP. A pousadamembrana er é dobrada em cristas e os elétrons são passados ​​ao longo dos complexos da cadeia respiratória através do citocromo c, uma transportadora de electrões solúvel que se move entre os complexos dentro do espaço intermembranar. Como electrões mover, a oxidação de equivalentes redutores ocorre e os iões de hidrogénio são bombeados da matriz para o espaço intermembranar. Como consequência da elevada concentração de iões no interior do espaço intermembranar, um gradiente electroquímico constrói resultando em um potencial de membrana, através da membrana mitocondrial interna (Δψ) 2. O oxigênio é o receptor de elétrons final da cadeia de transporte de elétrons e íons de hidrogênio fluir através das sintases ATP do espaço intermembranar de volta para a matriz, e ao fazê-lo diretamente causar a formação de ATP. Este processo tal como descrito na sua totalidade, é conhecida como a fosforilação oxidativa. As dobras do cristas aumentar a área de superfície da membrana interior, permitindo o transporte de electrões máxima e a produção de ATP dentrocada mitocôndria. As proteínas, enzimas e outras moléculas envolvidas na fosforilação oxidativa são derivadas de ambos os genes nucleares e mitocondriais. A mitocôndria contém seu próprio DNA circular, de codificação para 13 proteínas, bem como tRNAs e mRNAs necessárias para a produção de ATP 3. No entanto, muitas mais proteínas são necessárias e, portanto, são nuclear codificado. A maior parte destas proteínas nucleares codificados são direccionadas para a matriz mitocondrial pelo uso de pré-sequências na extremidade N-terminal da proteína precursora, e a sua importação é impulsionado em parte por Δψ 4,5. Além de contribuir para a bioenergética da célula, as mitocôndrias também influenciar principais processos metabólicos, tais como o TCA e beta-oxidação, a sinalização celular através da regulação de cálcio, bem como um papel-chave na apoptose 6. Especificamente, durante períodos de estresse celular, proteínas BCL-2 familiares que residem em ou interagir na membrana externa mitocondrial pode causar mitocondriala permeabilidade da membrana externa (MOMP) 7,8. Durante MOMP, citocromo c e outras proteínas são libertadas no citosol, e, juntamente com várias proteínas citosólicas formar um complexo denominado apoptossomo 9,10. O apoptossomo ativa caspases que transitam para a decompor as proteínas celulares e DNA durante a fase de execução da apoptose. Assim como ocorre MOMP, ΔΨ é recolhido e produção de ATP interrompida. Assim, a função mitocondrial, tal como apoptose é iniciada é comprometida e mudanças na ΔΨ pode ser correlacionada com mitocondrial e célula de saúde 12. Enquanto a apoptose é um ponto final em muitos modelos de doenças, a função mitocondrial e mudanças para ΔΨ também pode fornecer informações valiosas sobre a origem e / ou progressão da doença. Por exemplo, as alterações estruturais e funcionais mitocondriais foram documentadas durante o decurso de doenças neurodegenerativas 13,14. Na primeira parte do protocolo, isolação de mitocôndrias intactas que conservam a sua ΔΨ é descrito. As células HEK-293T foram expostas a diferentes concentrações e combinações de recombinante de TNF-α, IL1-β e IFN-γ para induzir apoptose. Estas citocinas foram escolhidos porque eles são frequentemente relatada como sendo elevada em amostras sépticas humanos primários 15 e a via extrínseca da apoptose pode ser desencadeada pela interacção de ligação ao seu receptor de TNF-α 6. Uma vez que existem variações subtis necessárias para isolar mitocôndrias funcionais de tecidos primários, em comparação com células cultivadas, e porque muita pesquisa utiliza animais, o protocolo também descreve como isolar mitocôndrias de fígado e de medula espinal de anterior esclerose lateral (ALS) modelo de ratinho. A segunda parte do protocolo foi desenvolvido para controlar as perturbações do potencial de membrana mitocondrial utilizando um corante fluorescente sensível ao potencial com um leitor de placa fluorescente. Diferenças entre o estado celular (isto é, saudáveis ​​vs insalubre) são diferenciados por quantificação da força de ΔΨ de mitocôndrias isoladas em conjunto com agentes de desacoplamento, inibidores da cadeia respiratória, inibidores do complexo e ionóforos, os quais causam a dissipação do potencial da membrana mitocondrial. Quanto mais saudável as mitocôndrias, quanto maior for a alteração na ΔΨ aquando do tratamento com inibidores mitocondriais, por conseguinte, a resposta das mitocôndrias podem ser utilizadas como um indicador da função mitocondrial (dis). Uso de mitocôndrias isoladas em vez de na avaliação in situ da função oferece uma evidência definitiva de que o tratamento de uma patologia ou modula alterações directamente para o organelo 16-18. Embora existam métodos na literatura para isolar mitocôndrias de células cultivadas, eles são vagos 17 e / ou utilizar equipamentos especializados 16. Este protocolo descreve em pormenor o método de isolamento e éfacilmente adaptável a outras linhas celulares, incluindo o tecido primário e culturas 13,14,19,20. Muitos estudos mitocôndrias isoladas utilizar as mesmas desacopladores mitocondriais e inibidores utilizados neste protocolo, mas com um eletrodo de Clark (21 é um exemplo representativo de muitos trabalhos na literatura), que por sua vez é uma peça muito específica e especializada de equipamentos. Além disso, este método tradicional tem limitações tais como baixo rendimento e alta complexidade 22,23 e requer uma quantidade substancial de mitocôndrias (~ 500 ng / reacção). Neste protocolo, o potencial fluorescente TMRE sonda de detecção de membrana é utilizado em conjunto com um leitor de placas fluorescente, que é uma máquina padrão em muitos laboratórios. TMRE é amplamente considerada, uma vez que rapidamente entra nas células e mitocôndrias isoladas e podem ser usadas em baixas concentrações 24. Várias reações podem ser rapidamente configurado em conjunto e em lotes analisados ​​usando esse protocolo. Além disso, a reacçãos requer uma pequena quantidade muito de mitocôndrias isoladas (~ 10 ug / reacção). Ao exigir menos material, amostras de tecido ou de cultura de células mais pequenas pode ser utilizada como um ponto de partida para o isolamento de mitocôndrias, mais repetições ou as reacções podem ser configurados, e material potencialmente suficiente para outras experiências mitocôndrias isoladas, tais como a produção de ATP, o consumo de oxigénio, ou importação Os ensaios são possíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

O tratamento de células HEK-293T com 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, e 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 h, conduz a quantidades progressivas de morte celular (Figura 1A ). A viabilidade celular foi avaliada utilizando ensaios de MTT e consistentemente demonstra que existe ~ diminuição de 10% na viabilidade celular com o tratamento com 24 ~ hr e diminuição de 20% com o tratamento de 48 horas. As células tratadas com concentrações semelhantes (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

39.2K visualizações.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

Vídeo: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Isolamento de células endoteliais glomerulares de camundongos imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...