Então, por que esse protocolo é significativo? Bem, as metástases cerebrais são muito difíceis de tratar e este protocolo produz um modelo de rato clinicamente relevante com tumores extracranianos mínimos. Esta técnica permite a análise objetiva da distribuição e resposta de medicamentos de tumores intracranianos.
A principal vantagem desta técnica é que o modelo é altamente reprodutível e as metástases cerebrais se desenvolvem em um tempo relativamente curto após a injeção. A progressão da doença é semelhante entre os animais, tornando mais fácil para os pesquisadores padronizarem os experimentos, os cronogramas de tratamento e os desfechos. Meu conselho para iniciantes é praticar o uso da pinça e seringa enquanto olha através do microscópio de dissecção, familiarizando-se com os marcos anatômicos ao redor do pescoço e praticando o protocolo na presença de um veterinário.
Comece por semear as células cancerosas BT-474 a uma densidade de semeadura de duas vezes 10 para as seis células em um frasco T-75 usando 10 mililitros de meios de crescimento completos e cultura até que as células atinjam uma confluência de 70 a 80% antes da injeção. No dia da injeção, descarte o meio de crescimento e lave a monocamada celular com PBS duas vezes e adicione cinco mililitros de reagente de dissociação de cultura celular pré-aquecido. Incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que as células tenham se desprendido.
Após cinco minutos, retire o balão da incubadora e bata-o suavemente para ajudar no descolamento celular. Adicione cinco mililitros de meio de crescimento completo contendo 10% de FBS para extinguir a atividade do reagente de dissociação. Ressuspeite suavemente as células da solução pipetando para reduzir os aglomerados celulares.
Transfira a suspensão da célula para um tubo de 50 mililitros e centrifugar a 180 G por três minutos à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mililitros de HBSSS sem cálcio e magnésio para minimizar a aglomeração celular. Centrifugar a suspensão celular a 180 G durante três minutos à temperatura ambiente Decantar o sobrenadante para remover o soro residual ou o reagente de dissociação e ressuspender o pellet celular em três mililitros de HBSS.
Coloque um filtro celular de 100 micrômetros em um tubo cônico fresco de 50 mililitros e passe a suspensão celular para remover os aglomerados celulares. Calcular o número de células viáveis utilizando azul de tripano e diluir a suspensão celular com HBSS para uma concentração celular de 2,5 vezes 10 para as seis células por mililitro. Mantenha o tubo horizontal no gelo e agite suavemente o tubo periodicamente para minimizar a aglomeração.
A suspensão celular pode ser armazenada no gelo por um período máximo de seis horas. Rato de punção auricular para identificação e use cortadores elétricos para raspar a pele da região do pescoço. Limpe o excesso de cabelo da pele exposta usando fita adesiva.
Aplique lubrificante ocular nos olhos para evitar a secagem. Prenda o mouse suavemente prendendo os dentes incisivos superiores usando fio preso à placa cirúrgica, seguido de prender as patas dianteira e traseira. Este passo estende o corpo e mantém o pescoço reto durante o procedimento.
Para a preparação pré-operatória da pele, limpe o pescoço com um antisséptico tópico, como iodopovidona para reduzir a carga da microflora da pele e remover os pelos soltos. Limpe do centro da pele, trabalhando para fora para evitar a recontaminação do local da incisão. Repita o processo usando etanol a 70% e realize três rodadas alternadas de iodo e etanol para desinfecção.
Verifique se há reflexo através do teste de pinça para garantir a morte da anestesia antes de continuar o procedimento. Coloque uma cortina cirúrgica estéril sobre o animal. Sob o microscópio de dissecção, faça uma incisão vertical de 15 milímetros ao longo da linha média na região do pescoço do rato usando uma tesoura, começando de cinco milímetros abaixo da mandíbula até a entrada torácica.
Usando dois pares de pinça angulada, parta a pele e as glândulas salivares subjacentes e aplique afastadores para manter a traqueia exposta. Usando dois pares de pinça de ângulo fino, disseque sem rodeios o músculo e o tecido adiposo adjacente à traqueia para expor a bainha da carótida direita. A bainha carotídea é a camada fibrosa que cobre a artéria carótida comum, veia e nervo vago, e esse feixe pode ser visualizado pela artéria carótida comum vermelha brilhante.
Limpe um segmento da artéria carótida comum caudal para a bifurcação carotídea da fáscia circundante e separe-o do nervo vago e das veias. Isole e limpe a bifurcação carotídea dos nervos e fáscia circundantes. Posicione pinças finas sob a artéria carótida externa e passe uma sutura de seda 5-0 sob a artéria.
Amarre e aperte a sutura e corte o excesso de linha. Posicione pinças finas sob a artéria carótida comum e passe uma sutura de seda 5-0 sob a artéria. Amarre um nó e aperte a sutura numa posição proximal ao local de injeção proposto.
Corte o excesso de sutura, deixando cerca de 10 milímetros da linha. Corte e umedeça uma tira de limpadores descartáveis de fiapos baixos cerca de 10 por 5 milímetros. Dobre a tira e coloque-a sob a artéria carótida no local proposto para a injeção.
Isto irá apoiar o vaso durante a injeção. Na artéria carótida comum rostral ao local de injeção proposto, coloque uma terceira ligadura com um nó solto. Isto é apertado somente após a injeção.
Agite suavemente a suspensão celular e desenhe 200 microlitros de suspensão celular em uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 31. Carregue a seringa no controlador da seringa ligado a um pedal de pé ativador. Fixe uma cânula fina com uma agulha de calibre 31 à seringa e prima a linha.
Verifique se a artéria carótida está bem posicionada e pressurizada. Usando duas pinças de ângulo fino, uma tensionando suavemente na extremidade da primeira ligadura e a outra segurando a agulha de calibre 31, insira lentamente a agulha com o bisel no lúmen do vaso sanguíneo, tomando cuidado para não perfurá-la. Injete lentamente 100 microlitros de suspensão celular preparados anteriormente na artéria carótida comum a 10 microlitros por segundo.
Isso entregará 2,5 vezes 10 para as quintas células no vaso sanguíneo. A injeção bem-sucedida pode ser visualizada através da limpeza do sangue do vaso sanguíneo carotídeo. Levante e aperte suavemente a ligadura solta imediatamente após retirar a agulha para evitar o refluxo e o sangramento.
Apare o excesso de suturas e remova o pedaço de limpadores descartáveis umedecidos de fiapos baixos. Usando uma pipeta P-200, lave a cavidade cirúrgica duas vezes com 150 a 200 microlitros de água estéril ou solução salina. Depois de verificar se há sangramentos, reposicione os tecidos moles, as glândulas salivares e a pele sobre a artéria carótida e a traqueia.
Feche a camada de pele da incisão usando um suporte de agulha de sutura, pinça e uma sutura de monofilamento 6-0 absorvível ou não absorvível em um padrão contínuo. Injete 50 microgramas por quilograma de buprenorfina e um miligrama por quilograma de meloxicam através de injeção subcutânea como alívio da dor pós-cirúrgica. Mova o animal para uma gaiola quente e limpa para se recuperar da anestesia.
A lectina foi injetada na artéria carótida comum dos camundongos com ou sem ligadura externa da artéria carótida. Uma redução na lectina foi observada nos tecidos da bochecha quando a artéria carótida externa foi ligada. Os resultados mostraram que a ligadura não afetou a entrega do cérebro.
A progressão do tumor foi monitorada usando a linhagem celular de câncer de mama amplificada por HER2 e expressadora de luciferase. O modelo de metástase cerebral BT474 mostrou um aumento nos sinais bioluminescentes a partir da quinta semana pós-injeção interna de carótida e cresceu progressivamente a partir daí. Das semanas cinco a oito, a intensidade heterogênea do sinal indicou tumor intracraniano com perfusão complexa de líquidos.
A concentração de gadolínio dentro da região do tumor aumentou à medida que vazava da circulação sanguínea para o tecido tumoral. O acúmulo de nanomedicina e metástases cerebrais foi confirmado nos camundongos BT-474 por níveis mais altos de nanomedicina detectados na região do tumor em comparação com as regiões cerebrais não envolvidas. À medida que o modelo de metástase cerebral BT-474 progredia, os animais começaram a perder até 20% do peso corporal, tornando o tempo médio de sobrevivência nove semanas após a injeção.
Os resultados histológicos mostraram que os tumores estavam localizados unilateralmente, coincidindo com o local da injeção carotídea, onde os tumores apareciam principalmente como massas sólidas e solitárias. Bolsões de espaços vazios foram frequentemente observados e consistiram de células necróticas, enquanto excrescências menores também estavam presentes em alguns animais. A coisa mais importante a lembrar ao tentar o protocolo é preparar e posicionar a artéria carótida corretamente antes de inserir a agulha e, em seguida, aplicar a tensão adequada durante a inserção da agulha.
Este modelo é útil para pesquisadores que exploram a entrega de drogas ao cérebro e a eficácia da nova terapêutica para o tratamento de metástases cerebrais.
