We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Cultura 1 celular NOTA: linhas celulares Homalodisca vitripennis estabelecidos pelo laboratório Dr. Wayne Hunter no Serviço de Pesquisa Agrícola do USDA (Ft. Pierce, FL EUA) foram utilizados para iniciar um estoque laboratório composto por estágios de células mistas, incluindo fibroblastos iniciais e monocamadas. <ol><li> Executar os seguintes procedimentos em ambiente estéril laboratório mantido a uma temperatura de 20-24 ° C de 25 cm 2 frascos de cultura. </li><li> Cultivar e manter culturas de 25 centímetros dois frascos de cultura de tecidos, utilizando meio de H2G + Cigarrinha, uma modificação meios de abelha WH2 10 (Tabela 1). </li><li> Incubar frascos de cultura a 24 ° C, com ~ 53% de humidade. </li><li> Use um microscópio invertido com uma ampliação total (MT) de 100X para acompanhar o crescimento da cultura, por exemplo, verificar se há algum crescimento celular anormal, monitorização de quaisquer contaminantes potenciais, e verificar o progresso de crescimento em todo o culsuperfície tura. </li><li> Realize uma mudança médio completo (~ 4 ml de meio de cultura por frasco) a cada 7-10 dias sem perturbar a superfície da cultura. </li><li> Passa culturas quando a superfície da cultura é aproximadamente de 80% coberta por um crescimento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para dissociar as células. Adicionar ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada balão de cultura e expor a cultura (s) para a enzima durante curtos períodos de tempo (5-10 min) para obter a dissociação de células completas. </li><li> Adicionar uma quantidade igual de meio fresco para o frasco de cultura (s) (~ 2 - 3 ml) para parar a actividade da enzima e transferem toda a solução para um tubo cónico de centrifugação. </li><li> As células por centrifugação a 4 ° C durante 6 min a 350 x g. </li><li> Retirar o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e adicionar ~ se 8 ml de meio fresco a cada tubo. Gentilmente homogeneizar células usando uma pipeta. </li><li> Culturas desdobramento à 1: 2 proporção de 25 centímetros 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularem por balão) e deixam as culturas recentemente transmitidos em repouso por 48 horas para permitir que as células em suspensão para fixar firmemente à superfície do frasco. NOTA: O cultivo de células de 48 poços em placas estéreis de cultura de tecido com uma superfície de crescimento de 1 cm 2, também é possível e que pode ser mantida na mesma forma como frascos de cultura, com uma redução do volume de meio de cultura para ~ 250 mL. </li></ol> 2 Extracção vírus inteiro <ol><li> Homogeneizar corpos inteiros de vírus H. positivo vitripennis em tampão fosfato, pH ~ 7,2, com tri-hidrato de dietilditiocarbamato de sódio a 0,02% (DETCA) por rotação durante ~ intervalos de 10 segundos até que não haja mais de grandes aglomerados de tecido presente. Extracto de vírus através de centrifugação a superspeed 124.500 xg durante 4 horas a 4 ° C ou 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Se se formar um precipitado na parte superior, retire-os com um cotonete estéril 11. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Coletar o sedimento edissolvem-se com 5 mL de 10 mM de tampão de fosfato (sem DETCA), pH ~ 7,2, contendo 0,4% de ácido Na-desoxicólico e 4% de éter de polietileno glicol de hexadecilo (Brij 52). <ol><li> Para misturar o sedimento assim, remover o pellet a partir do lado do tubo e esmagar até que em solução, se necessário. </li><li> Adicionar mais tampão fosfato 10 mM, em incrementos de 5 ml ~ para ajudar a pelota entrar em solução, se necessário, e combinar-se dois tubos 11. </li></ol></li><li> Centrifuga-se a solução a 300 xg durante 15 minutos 11. </li><li> Remover o sobrenadante e passar a solução através de um filtro de 0,45 mm, e recolher o filtrado em tubo grande coleção 11. </li><li> Transferência filtrado para uma membrana de diálise com um peso molecular de corte (MWCO) de 3,5 kD, utilizando pequenas quantidades de tampão fosfato 10 mM (pH 7) contendo nenhum DETCA 11, se necessário. </li><li> Colocar a membrana de diálise num copo grande cheio com ddH2O a 4 ° C. Alterar o DDH 2 O a cada hora fou 5-6 horas, até que se forme um precipitado branco na membrana 11. </li><li> Recolhe-se o vírus purificada a partir de dentro da membrana e sujeitar a solução de vírus de 100% de uma série de diluições de 10 vezes por adição de 10 ul de solução de 90 ul de ddH 2 O. Subsequentemente juntar 10 ul de uma diluição de mais 90 ul de ddH2O até atingir uma diluição de 1: 100.000. </li><li> Solução vírus armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. replicação viral <ol><li> Células de sementes em placas de cultura de 48 poços e crescem todas as linhas até o crescimento celular é de 80% confluentes (cerca de 72 horas pós-pass se as células estão crescendo a uma taxa média). </li><li> Inocular cada linha de células com o vírus diluído em série, uma vez o crescimento das células atinge a confluência, isto é, uma linha de uma diluição de 1:10, uma linha de uma diluição de 1: 100, etc, excepto para a linha de cima. Utilizar a linha superior como um controlo e adicionar 10 uL de ddH2O a cada poço como controlo de volume. <ol><li> A fim de estabelecer uma concentração de células a partir da linha de base para comparação com as contagens de células experimentais, dissociam-se e contam a primeira cavidade de cada fileira, antes da inoculação inicial de todos os poços das culturas com vírus. </li></ol></li><li> Monitor de placas de cultura de todas as 24 horas após a inoculação virai para qualquer alteração de cor no meio indica uma alteração do pH e de quaisquer alterações na morfologia celular. </li><li> Imagem uma coluna da placa de teste, em cada ponto do tempo, utilizando um microscópio invertido em 100X TM. </li><li> Remover todo o meio da coluna, que foi representada por imagem em cada ponto de tempo de 24 horas e armazená-lo a curto prazo a -20 ° C, durante a extracção de ARN viral e quantificação ou a longo prazo a -80 ° C. </li><li> Dissociar as células dos poços, após a remoção do meio como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,9, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima e ~ 250 ul de meio fresco para re-suspender a Pelle célulat. </li><li> Adicionam-se 10 ul de 0,4% de azul tripano mancha para cada tubo contendo as células para realizar a contagem de células após a dissociação das células por cada período de 24 horas durante uma semana. Permitir mancha para descansar por 10 min antes de realizar a contagem de células. <ol><li> Efectuar a contagem de células no espaço de 1 hora de exposição à mancha ou células viáveis ​​irão começar a absorção de manchas, bem como as células não viáveis. </li></ol></li><li> Lentamente, adicionar 10 ml da solução de células coradas para cada lado de um hemocitómetro padrão utilizando uma micropipeta. Permitir que a solução a adoptar-se por acção capilar, para evitar bolhas de ar. </li><li> Conte o número de células viáveis ​​(não-coradas) em ambos os lados do hemocitómetro (o equivalente a quatro contagens dos 16 quadrados no hemocitómetro). Efectuar a contagem de células para cada poço da coluna que foi removida. </li><li> Calcular a média das contagens das células de cada coluna usando a seguinte fórmula para se obter o número total da contagem de células: (média do número de células / 4) x factor de diluição = número de células 10 x <sup&gt; 4 ml. Esta é a densidade de células ou o número de células viáveis ​​na cultura. </li></ol> 4 Extração Vírus de Cultura de Células <ol><li> Remover tratado H. vitripennis células de balões de cultura como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,8, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Extracto de vírus a partir de células de cultura de acordo com o protocolo anteriormente descrito nos passos 2,3-2,8. </li></ol> Extração de RNA 5. <ol><li> Extrair RNA de amostras de meio colhidas durante cada ensaio de vírus de uma semana, utilizando uma extracção de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidina concebido para amostras líquidas por protocolo do fabricante. </li><li> Loja extraiu amostras a -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Estabelecer padrões virais para RT-PCR, executando PCR tradicional usando opar de iniciadores HoCV RT-PCR o iniciador 1 (5&#39;-frente GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, reverso 5&#39;-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) com o vírus isolado a partir de todo o corpo H. vitripennis. </li><li> Produto de PCR sujeita a electroforese em gel, durante 60 minutos a 120 V num gel de agarose a 2% contendo 0,1% de brometo de etídio. </li><li> Excisar as bandas do gel e purifica-se utilizando um kit de extracção de gel, conforme o protocolo do fabricante. </li><li> Piscina tudo excisadas e produto gel purificado e ainda purificar por precipitação básica etanol. Eluir o produto a precipitação em cerca de 30 ul de Tris EDTA (TE) para aumentar a concentração total da amostra. </li><li> Quantificar o nível de cDNA em amostras combinadas através de espectrofotometria utilizando 260/230 configurações de comprimento de onda para a detecção de ácido nucleico. </li><li> Executar uma série de diluição em série de dez vezes da amostra purificada variando de 57 ng / mL a 57 ag / mL (10 -18). Realizar a diluição em série semelhante à descrita in 2.8 com os ajustes feitos para a diferença de requisitos de concentração. </li><li> Determinar os limites de detecção da série de diluição através da realização de qRT-PCR, utilizando um kit de qRT-PCR com quantificação fiável de transcritos de baixa abundância. NOTA: As concentrações virais inferior a 5 x 10 -3 cópias não são detectáveis. </li><li> Extrair RNA de amostras experimentais como descrito anteriormente no passo 5.1 e utilizando espectrofotometria de quantificar. </li><li> Normalizar todas as amostras extraídas de 5 ng / mL, utilizando água livre de nuclease. </li><li> Realizar qRT-PCR em todas as amostras, em duplicado, como reacções de 25 ul usando um kit de um único passo de qRT-PCR, com a capacidade para detectar números de cópias baixo como se segue: 50 ° C para manter 10 min; 95 ° C espera por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg; derreter 50-99 ° C durante 5 segundos em cada passo. <ol><li> Faça a mistura principal para que cada mistura de reação contém 12,5 mL de maste 1xmistura r, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador para a frente, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador reverso, 0,25 ul de transcriptase reversa e de quantidades variáveis ​​de modelo com base em valores de normalização. </li><li> Levar o volume total de reacção de 25 ul com RNase isenta de água. </li><li> Incluir cinco concentrações padrão em cada PCR executado com os seguintes números de cópias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 cópias. Definir o limite para cada corrida até um pouco abaixo uma fluorescência de 10x -2.5 para reduzir o ruído durante a aquisição precoce no início de cada execução. </li></ol></li></ol> 7. microscopia confocal <ol><li> Cultivar células Homalodisca vitripennis em um doze poços contendo lamínulas de vidro com 18 mm de diâmetro em cada poço. </li><li> Inocule uma coluna na placa de cada 24 h durante um período de quatro dias, uma vez que uma monocamada é alcançado. Assegurar que cada column contém também um controle, uma diluição baixa viral (1:10) bem e uma diluição viral alta (1: 100.000) também. Utilizar soluções de vírus obtidas a partir do passo 2.8. </li><li> Remova toda a mídia no quinto dia e lavar as células duas vezes com 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixar as células com paraformaldeído a 4% frio, a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 500 ul de 1x tampão de fosfato salino (PBS) para as células e lava-las durante 10 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo a baixa velocidade. Lavam-se as células três vezes. </li><li> Adicionar 500 ul de 0,1% de Triton X-100 às células para permeabilizar eles. Deixar assentar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células uma vez, como descrito anteriormente no passo 7.5. </li><li> Adicionar 500 ul de uma solução a 5% de albumina de soro bovino (BSA) para bloquear as células à temperatura ambiente. Deixe descansar por 2 horas e depois retire. </li><li> Diluir estoque rodamina faloidina vermelho-conjugado (RCP) 1: 250 em 1x PBS contendo 5% BSA e adicionar 250 ul da diluição a cada poço a mancha de F-actina. </li><li> Placa de cobertura em alumínio fóleo para evitar que o corante de branqueamento e incubar as células a 4 ° CO / N. </li><li> Retirar a RCP após 12 h de incubação e substituí-la com 250 ul de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (250 ug / ml) diluídas em PBS 1x contendo 5% de BSA, para corar os núcleos das células . </li><li> Incubar as células contendo DAPI, à TA durante 1 hora. </li><li> Lave as células três vezes com PBS 1x, como descrito anteriormente no passo 7.5. </li><li> Remova cuidadosamente as lamelas dos poços e montar a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem com um reagente anti-fade. </li><li> Permitir que os slides para secar lightproof caixas até visto sob o microscópio confocal. Ver de lâminas preparadas para, logo que possível, como corantes podem desaparecer rapidamente. </li><li> Imagem de células marcadas, utilizando um sistema confocal equipado com um microscópio que contém uma lente de 63X (óleo)-apochromate plano. <ol><li> Defina os comprimentos de onda do laser para 543 ± 10 nm de excitação e 575 ± 10 nm de emissão para Rhoadmine phalloidin vermelho-conjucated, E 369 ± 10 nm de excitação e de emissão de 450 ± 30 nm para DAPI. </li><li> Use ganho idêntico e partiu-configurações para o detector de obter todas as imagens. </li><li> Processar imagens usando o software apropriado para o processamento de imagem e de triagem e de importação desejada imagens em um software gestão de imagem. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+(Hemiptera:+Cicadellidae:+Cicadellinae).">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li><li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. 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The authors have nothing to disclose.

Crescentes preocupações em relação à entrada de espécies invasoras agrícolas têm levado a um aumento da procura de novas metodologias para se defender contra pragas e patógenos emergentes. Um foco de prevenção e gestão de doenças envolve a gestão de vetores de patógenos e era o alvo principal deste estudo. Economia desempenhar um papel vital na decisão de produzir este tipo de biopesticida para gerenciar vetores de patógenos na agricultura porque a aplicação prática precisa ser de grandes quantidades...

O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis Germar 1821) foi identificado como o vetor predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), o agente causal da doença da videira (PD) de Pierce na América do Norte 1. Gestão da população de insetos rapidamente se tornou o foco de investigação para combater este problema devastador para a indústria de viticultura na Califórnia e em todo o sul dos Estados Unidos. Um de sentido positivo, vírus de RNA de cadeia simples, que pertence à família Dicistroviridae, Homalodisca vírus-01 coagulata (HoCV-01) foi identificada em H. selvagem populações vitripennis e mostrado para aumentar a mortalidade nessas populações 2-4, enquanto diminuem a resistência do inseto aos inseticidas. Desenvolvimento de métodos para efetivamente traseira infectado H. vitripennis à idade adulta em um ambiente de laboratório têm sido difíceis porque <em&gt; H. vitripennis têm necessidades nutricionais específicas de palco diferentes que exigem uma variedade de plantas hospedeiras 5-8. Instalações específicas são necessárias para H. vivo traseira vitripennis nos Estados Unidos; por conseguinte, a cultura celular é mais económico e uma alternativa viável, assim como cada vez mais importante para HoCV-01 e detecção da replicação 2,9. Embora métodos básicos para se estabelecer culturas de células de H. vitripennis são descritos, estes métodos não têm sido utilizados para a produção comercial de agentes de controlo biológico, tais como vírus 2. O objectivo global dos processos seguintes é para produzir uma elevada concentração de HoCV-01 apropriada para utilização como um agente de controlo biológico. A replicação viral requer uma célula viva, que é por isso que cultivar com sucesso e otimizando H. vitripennis culturas é vital para o progresso de produzir níveis rentáveis ​​de vírus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;cell culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25&#160;cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA &#8226; 4Na per liter of Hanks&#8242; Balanced Salt Solution with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8937</td>
			<td>48 wells (TC treated with lid)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DETCA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>228680</td>
			<td style="width:167px;">Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;bottle-top vacuum filter system</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431206</td>
			<td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45&#160;&#956;m, membrane area 54.5&#160;cm2, filter capacity 500&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Brij 52</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>388831</td>
			<td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5244</td>
			<td>Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">TRIzol LS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>For electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7637</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect qRT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>204243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td style="width:167px;">Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Rhodamine red-conjugated phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>R415</td>
			<td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM510 Meta Confocal System&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM Zen 2007 Software</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grace&#8217;s Insect medium (supplemented, 1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8142</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-histidine monohydrate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H8125</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 199 (10X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 1066 (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0422</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salts (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51322C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM, amino acid mix (50X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>56419C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 M MgCl solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pen-Strep (w/ Glutamine)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G6784</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nystatin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>N6261</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46305</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis) é um inseto altamente vágil e polífagas encontrados em todo o sudoeste dos Estados Unidos. Esses insetos são os vetores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), uma bactéria restrita ao xilema, que é o agente causal da doença de Pierce (PD) de videira. Doença de Pierce é economicamente prejudicial; assim, H. vitripennis tornaram-se um alvo para estratégias de gestão patógeno. Um dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata vírus-01 (HoCV-01) tem sido associado com um aumento da mortalidade em H. populações vitripennis. Por causa de uma célula hospedeira é necessária para a replicação HoCV-01, a cultura de células fornece um ambiente uniforme para a replicação que é orientada logisticamente e economicamente valiosa para a produção de biopesticida. Neste estudo, um sistema para a propagação em larga escala de H. vitripennis células através de cultura de tecidos foi desenvolvido, providing um mecanismo de replicação viral. HoCV-01 foi extraído a partir de insectos de corpo inteiro e usada para inocular H. cultivadas vitripennis células em níveis variados. O meio de cultura foi removido a cada 24 h durante 168 horas, o RNA extraído e analisado com qRT-PCR. As células foram coradas com azul de tripan e contadas para quantificar a capacidade de sobrevivência de células por microscopia de luz. Partículas de vírus inteiros foram extraídos até 96 horas após a infecção, o que foi o ponto de tempo determinado antes de ser ocorreu colapso total de cultura de células. As células também foram submetidos a coloração fluorescente e visualizadas por microscopia confocal para investigar a atividade viral na F-actina apego e núcleos integridade. A conclusão deste estudo é que H. vitripennis células são capazes de serem cultivadas e utilizadas para a produção em massa de HoCV-01 a um nível apropriado para permitir a produção de um biopesticida.

A adesão celular e crescimento ocorreu dentro de 48 horas de passagem em ambos os pequenos e grandes frascos de cultura, a partir de culturas primárias e passagens contínuas. Crescimento de fibroblastos e desenvolvimento também foi observada dentro deste prazo. Quando frascos recém semeadas foram perturbados antes de 48 horas, houve um declínio visível na fixação das células, levando a culturas de crescimento lento e às vezes nenhum apego ou de crescimento em tudo. As células foram de aproximadamente 80% con...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.6K visualizações.  University of Texas at Tyler.  Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR. 

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Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Imunologia e Infecção

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

Medição da velocidade de propagação do pulso, destensibilidade e tensão em um modelo de rato aórtico abdominal

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagação do Parasita Microsporidiano Edhazardia aedis em Mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...