Edhazardia aedis é um parasita microsporíduo que infecta especificamente os mosquitos Aedes aegypti. Criar esse parasita pode ser um desafio para novos pesquisadores devido à complexidade do ciclo de vida do parasita. Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a criação de E.aedis, incluindo como cronometrar adequadamente os passos para o procedimento, identificar esporos infecciosos e propagar a próxima geração de parasitas.
O tempo preciso deste protocolo pode ser desafiador e pode exigir alguma tentativa e erro. Identificar esporos também pode ser difícil. Os auxílios visuais neste protocolo devem prestar assistência.
Para começar, eclode ovos A.Aegypti infectados com E.aedis colocando-os em uma bandeja de criação de larvas com um litro de água deionizada e adicionando 50 miligramas de alimentos para peixes. Abriga os mosquitos a 27 graus Celsius e 80% de umidade relativa com uma luz de 14 horas, ciclo escuro de 10 horas. Após a eclosão, reduza a densidade de larvas para aproximadamente 100 larvas por bandeja, fazendo novas bandejas conforme necessário.
Adicione um pedaço de comida seca de gato em cada bandeja. Reponha o alimento quando esgotado, mas não forneça nenhum excesso de alimentos. Um pedaço de 200 miligramas de comida de gato a cada três dias é suficiente.
Quando as larvas infectadas estão em terceiro a quarto instars, eclodam ovos A.aegypti não infectados em uma nova bandeja. Criar os mosquitos em densidades como que o A.aegypti saudável chegue de segundo a terceiro lugar em 48 a 72 horas. A eclosão de ovos saudáveis durante vários dias pode garantir que as larvas estejam na fase correta quando necessário.
Para colher e quantificar esporos uninucleados, use uma pipeta de transferência para mover 10 larvas infectadas da quarta estrela para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Remova a água de reprodução com uma pipeta de transferência e lave as larvas uma vez adicionando aproximadamente um mililitro de água deionizada limpa. Retire a água de lavagem e adicione 500 microliters de água deionizada limpa às 10 larvas e homogeneize-as usando um pilão e um homogeneizador mecânico.
Carregue 10 microliters de homogeneização em um hemótmetro e quantifique os esporos a 400X de ampliação. Faça um chorume de larvas frescas misturando 1,2 gramas de pó de fígado, 0,8 gramas de levedura brewer e 100 mililitros de água. Transfira 100 segundos para a terceira larvas aegypti saudáveis em 150 mililitros ou copos de espécimes e adicione cinco vezes 10 para o quarto a um vezes 10 para o quinto esporos em cada xícara com uma pipeta.
Adicione dois mililitros de chorume de alimentos larvais e água deionizada para um volume final de 100 mililitros. Após 12 a 24 horas de exposição, transfira as larvas para bandejas de criação. Adicione comida e crie-os para a idade adulta.
Monitore as larvas dosadas para pupação e transfira pupas para um copo de emergência em uma gaiola. Açúcar alimenta adultos ad libitum. Adultos com ração sanguínea de acordo com os protocolos padrão disponíveis através da BEI Resources.
Coletar ovos de adultos alimentados com sangue. A transmissão vertical de E.aedis ocorre nesta etapa. Quando terminar, limpe todos os materiais que entraram em contato com e.aedis com alvejante de 10% e autoclaving para evitar contaminação.
Este protocolo demonstra o procedimento completo necessário para propagar e.aedis em mosquitos A.aegypti. Ovos aegypti infectados com E.aedis foram eclodidos e larvas foram criadas para o quarto estágio instar. No quarto estágio instar, sinais visuais de infecção puderam ser observados, como esporostos brancos em todos os corpos de gordura de larvas infectadas.
Os esporos uninucleados foram colhidos a partir da quarta larva instar pela homogeneização de 10 larvas em 500 microliters de água deionizada. Estes esporos eram piriformes e facilmente visíveis na ampliação de 400X. Calculou-se uma contagem de esporos de 4.050 esporos por microliter e esses esporos foram utilizados para infectar larvas saudáveis via transmissão horizontal.
O estado de infecção e as cargas de E.aedis de 25 larvas de geração filial foram avaliadas em sete dias após a eclosão. A taxa de infecção vertical de E.aedis na geração filial foi de 96% e a carga média de esporos de indivíduos infectados em sete dias após a eclosão foi de 3,31 vezes 10 para o quinto. Para coordenar adequadamente o estadiamento larval, é aconselhável explicar alguma variabilidade no tempo de criação.
Além disso, os números de esporos aumentam rapidamente, então se você não detectar esporos, tente novamente no dia seguinte. Boa sorte.
