This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.

1. Estabelecimento de gástrico organï¿½de Cultura Nota: Este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de glândulas gástricas de murganho ou tecido humano. Aconselha-se a usar o tecido de aproximadamente 1 cm². O tecido humano pode ser obtido a partir de biópsias gástricas ou ressecção. <ol><li> Preparação de material Nota: A matriz basal utilizado é de Matrigel. Manter a matriz porão em gelo em todos os momentos. Armazenar a matriz basal a -20 ° C e descongelar em gelo antes da utilização. Meio basal refere-se a avançada DMEM / F12 suplementado com HEPES; uma fonte de glutamina apropriado tal como Glutamax e antibióticos apropriados, tais como 1x Primocin. A incubadora é utilizado numa incubadora de cultura celular padrão (37 ° C, atmosfera humidificada, 5% de CO 2) <ol><li> Esterilizar utensílios de preparação por autoclavagem ou utilizando 100% de álcool isopropílico: uma pinça afiada, tesoura, um bisturi e uma lâmina de microscopia de vidro. </li><li> Um dia antes de isolamento, colocar um 24 well placa de cultura celular na incubadora. </li><li> Prepare a matriz porão de acordo com a recomendação do fabricante. Preparar alíquotas de 1 ml para evitar ciclos repetidos de congelamento descongelamento. </li><li> Prepare 500 ml quelantes tampão e fresco no gelo. Preparar tampão 1x a partir de água destilada estéril com 5,6 mM de Na 2 HPO 4, 8,0 mM de KH 2 PO 4, NaCl 96,2 mM, KCl 1,6 mM, 43,4 mM de sacarose, 54,9 mM de D-sorbitol, 0,5 mM de DL-ditiotreitol (CUIDADO), pH 7. Se planear vários isolamentos, preparar uma solução concentrada de 5x sem a DL-ditiotreitol. Filtrar em condições estéreis o tampão. Antes de isolamento, dilui-se o tampão 5x com água estéril e adicionar a 1x DL-ditiotreitol apenas antes do isolamento. </li><li> Preparar e diluir todos os factores de crescimento de acordo com as recomendações dos fabricantes. Use pequeno porte alíquotas e evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Fatores de crescimento funcionais são cruciais para os resultados. </li><li> Meio basal fresco no gelo e arrefecer a centrífuga a 46; C. </li><li> Aquecer outra aliquota de meio basal de 37 ° C. </li></ol></li><li> Isolamento das glândulas <ol><li> Colete aproximadamente 1 cm² de tecido em meio basal de gelo frio. Manter em gelo até a preparação. Enquanto é preferível para processar tecidos, logo que possível, em meio de armazenamento de tecido em gelo se necessário. </li><li> Coloque o tecido em um prato de 10 centímetros Petri e cobri-lo com tampão de quelação 1x frio. Lave delicadamente movendo para trás e para frente. </li><li> Coloque o tecido em uma seco 10 centímetros placa de Petri. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente o muco, bem como a camada muscular sob microscópio estereoscópico. Lave o tecido em tampão quelante 1x frio, movendo suavemente para trás e para frente. </li><li> Coloque 1 cm2 de tecido em um novo e seco 10 centímetros placa de Petri. Usando uma tesoura corte-o em 20-50 pequenos pedaços de aproximadamente 2-5 tamanho mm². </li><li> Utilizando uma pinça, coloque todas as peças em um tubo de 50 ml. </li><li> Dê uma estéril 10 ml pipeta de plástico. Molhar a pipeta em tampão 1x quelante. Guardautilizando esta mesma pipeta ao longo do procedimento. </li><li> Adicionar 10 ml de tampão 1x quelante frio para o tubo de 50 ml. Lavar as peças à vigorosamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Deixe as peças resolver. Remover o sobrenadante. </li><li> Repetir a lavagem (passo 1.2.7) até que o sobrenadante é clara. Isso leva cerca de 50-100 ml de tampão 1x quelante para 1 cm² de tecido humano. </li><li> Incubam-se as peças de tecido em 20 ml de tampão 1x quelante suplementado com 10 mM de EDTA à temperatura ambiente durante 10 min, com inversão suave a cada 2 min. Nota: Tempo e temperatura de incubação este pode ser optimizado para velocidade e / ou preservação da arquitectura glandular. Elas podem variar de várias horas de incubação a 4 ° C sobre uma plataforma de rolamento para 5 min a 37 ° C num agitador com 200 rpm. Bons pontos de partida para o estômago do rato são de 30 min a 4 ° C sobre uma plataforma de rolamento e para o estômago humano, 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Pipeta uma vez suavemente para cima e para baixo usando a pipeta de 10 ml. Permitir que o piECES para resolver. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Utilizando a pipeta, transferir as peças para uma limpeza 10 cm numa caixa de Petri. Remover o líquido. </li><li> Coloque uma lâmina de microscopia de vidro na parte superior das peças de tecido. Observe o tecido intacto sob um microscópio invertido para cultura de células com ampliação de 10X. </li><li> Aplique pressão para a lâmina de vidro e uma placa de Petri. Segure tanto na mão (com luvas estéreis) e pressionando o vidro com o dedo polegar. A borda do tecido aparece turvo, indicando que as glândulas são libertados para fora do tecido. </li><li> Observe as glândulas liberado sob um microscópio invertido para cultura de células com ampliação de 10X. </li><li> Recolha glândulas e tecidos em 30 ml de meio basal frio. Vamos fragmentos de tecido grandes resolver. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante que contém as glândulas em dois tubos de 15 ml. </li><li> Centrifugar 5 min a 200 xg e 4 ° C. Sobrenadante de descarte. O sedimento contém glândulas isolado. Mantenha-os no gelo. </li></ol></li><li> Semeadura de Glândulas <ol&gt; <li> Para a semeadura, mantenha matriz porão gelada em todos os momentos, por isso vai ficar líquido. </li><li> Alternativa 1: Semente 6 poços de uma fila de diluição. <ol><li> Suspender o sedimento em 60 mL de matriz porão. </li><li> Prepare 5 estéreis tubos de 1,5 ml em gelo com cada uma contendo 50 ul de matriz basal. Transferir 10 uL da suspensão de glândulas matriz / cave para dentro do primeiro tubo de 1,5 ml. Suspender as glândulas e transferir 10 ul desta solução para o próximo tubo de 1,5 ml. Repita o procedimento para os próximos tubos. </li></ol></li><li> Alternativa 2: propagar uma quantidade calculada de glândulas por poço. Comece com 100 glândulas por matriz porão 50 ul em um poço de uma placa de 24 poços. <ol><li> Suspender cuidadosamente as glândulas peletizadas em 10 ml de meio basal. Colocar 50 uL sobre um limpa 10 ml numa caixa de Petri. Contagem do número de glândulas sob um microscópio invertido para cultura de células com ampliação de 10X. </li><li> Calcular a concentração de glândulas na solução. Transferir o volume que Contains 400 glândulas para um novo tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar 5 min a 200 xg e 4 ° C. Elimine o sobrenadante e manter o tubo em gelo. Adicionar 200 ul matriz porão e ressuspender cuidadosamente. Manter em gelo. </li></ol></li><li> Pegue a 37 ° C quente placa de 24 poços (ver passo 1.1.2) da incubadora. Coloque uma gota de 50 ul de glândulas matriz de porão no centro do poço. A gota deverá formar uma cúpula. </li><li> Transferir cuidadosamente a placa de novo na incubadora de cultura de células. Deixe a matriz porão solidificar 10 min. </li><li> Prepare meio quente com todos os fatores de crescimento. <ol><li> Para glândulas humanos: Suplementar o meio basal com os seguintes factores de crescimento para Organóides gástricos humanos: 50 ng / ml de EGF, 10% de meio condicionado de noggin, 10% de meio R-spondin1 condicionado, 50% de meio de Wnt-condicionado, 200 ng / ml de factor de crescimento de fibroblastos (FGF) 10, 1 nM de gastrina, e 2 uM de inibidor TGFbeta e 10 uM em dupla espiral associada a Rho formando proteína serina / treonina cinase<html> inibidor (RHOKi). </li><li> Para glândulas murinos: Suplementar o meio basal com os seguintes factores de crescimento de rato Organóides gástricas: 50 ng / ml de EGF, 10% de meio condicionado de noggin, 10% de meio R-spondin1 condicionado, 50% de meio de Wnt-condicionado, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM de gastrina, 0,5 mM de inibidor de TGFbeta e 10 uM RHOKi. </li></ol></li><li> Pegue a placa da incubadora. Juntar cuidadosamente 500 ï¿½ de meio com todos os fatores de crescimento (1.3.6) para cada poço sem perturbar a matriz porão. Coloque-o de volta para a incubadora. </li><li> Atualizar as médias 3 vezes por semana (a cada 2-3 dias). Por meio de refrescamento, remover o meio de idade com deixando a gota de matriz porão intacta. Juntar cuidadosamente, meio quente fresco com todos os fatores de crescimento. Não adicione RHOKi. Apenas adicionar RHOKi diretamente após a semeadura das glândulas ou após a divisão dos Organóides (etapa 2). </li></ol></li></ol> 2. A passagem de gástrico organï¿½de Cultura Antes de microinjeção. ove_content &quot;&gt; Nota: Todo o tipo de cultura organï¿½de tem seu próprio tempo de duplicação mouse intestinal, assim como as culturas gástricas são geralmente divididos. 1: 5 a cada 5-7 dias culturas intestinal humano são divididas. 1: 5. a cada 10-12 dias Humano culturas gástricas são divididas 1: 5 a cada 14 dias Se iniciada a partir de células individuais, Organóides gástrico humano também pode levar 20 dias para formar adequadamente É um bom sinal se estruturas de brotamento cercam o lúmen central Neste protocolo, Organóides são divididos em... 4 placas de poços para microinjecção. Manutenção de Organóides segue o mesmo protocolo, mas pode utilizar qualquer outra placa de cultura celular, tais como placas de cultura de 24 células normais. <ol><li> Preparação de material <ol><li> Pipetas Pasteur autoclave. </li><li> O dia antes da passagem, colocar um poço 4 placa de cultura celular na incubadora a 37 ° C. Os 4 placas de poços têm bordas baixas e permitir micromanipulação. </li><li> Prepare a matriz porão de acordo com a recomendação do fabricante. No dia da passaging, descongelar matriz porão em gelo. </li><li> Preparar e diluir todos os factores de crescimento de acordo com as recomendações dos fabricantes. </li><li> Meio basal fresco em gelo e arrefece-se a centrífuga a 4 ° C. </li></ol></li><li> Passagem de culturas organï¿½de <ol><li> Pegue a placa com as Organóides da incubadora. Remover forma de um poço. </li><li> Adicionar 1 ml de meio basal frio à matriz basal no poço. Usando uma micropipeta 1 ml, pipetar vigorosamente cima e para baixo até que a matriz porão é dividido. Transferir para um tubo de 15 ml. Coloque no gelo. </li><li> Dê uma pipeta de Pasteur de vidro e uma fonte de fogo, como um bico de Bunsen. <ol><li> Segurar a ponta da pipeta para o fogo até que a abertura da ponta diminuiu de 1,5 mm a cerca de 0,5 mm (Figura 1). Deixe a pipeta legal para RT. </li><li> Molhar a pipeta em meio basal. Uma pipeta de forma otimizada estreitou vai ocupar o meio visivelmente mais lento do que uma pipeta estreitou-un, mas ainda vai tudoow pipetando bem. </li></ol></li><li> Tome-se Organóides na pipeta e vigorosamente pipeta 10x cima e para baixo. A quebra das Organóides pode ser observada a olho nu. </li><li> Adicionar 9 ml de meio basal frio e centrifugar durante 5 min a 200 xg e 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente descarte tudo sobrenadante. Suspender o sedimento em 250 mL matriz porão. Manter em gelo. </li><li> Pegue a quente 4 placa de cultura de 37 ° C e coloque uma gota de matriz 50 Organóides ul / cave em cada poço. </li><li> Transferir a placa cuidadosamente para trás para a incubadora. Deixe a matriz porão solidificar a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Prepare meio adequado para qualquer rato ou humanos Organóides conforme listado na etapa 1.3.6. </li><li> Pegue a placa da incubadora e sobrepor cada gota matriz cave com 500 ï¿½ de meio. </li><li> Transferir a placa à incubadora. </li><li> Atualize a média 3 vezes por semana a cada 2-3 dias (ver 1.3.8.). </li><li> Para o congelamento de Organóides, mechanically perturbar Organóides como descrito para a divisão neste protocolo (Passos 2.2.1-2.2.5.). Suspender os fragmentos organï¿½de em 500 ml de meio de congelação e congelar a -80 ° C usando criotubos e um recipiente de congelamento. Para armazenamento a longo prazo, para transferir os tubos em azoto líquido. </li><li> Para o descongelamento de Organóides, preparar a placa de cultura, matriz porão, fatores de crescimento, meio frio e quente como descrito nas etapas 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Aquece-se a ampola congelada usando um banho de água, e as células de transferência imediatamente após a descongelação para um tubo de 15 ml com 10 ml de meio basal frio. Centrífuga e placa das células, conforme descrito no 2.2.5 a 2.2.12. Nota: microinjeção de Organóides é trabalhoso, mas permite a possibilidade única de estudar a interação em 3D. </li><li> Se os estudos em 3D não são necessários, sementes Organóides em duas dimensões. Para isso, interromper as Organóides como previsto nos passos 2.2.1 a 2.2.6. Adicionar meio de 2.250 ul frio com todos os fatores de crescimento para 250 ul de porão matrix com fragmentos organï¿½de. <ol><li> Semente 5 em poços de uma placa de 24 poços com 500 ul por poço. Alterar média 3 vezes por semana, com a substituição cuidadosamente os superiores 400 ul somente, para manter a matriz porão na parte inferior da placa sem serem incomodados. Nota: Organóides irá anexar à placa de cultura de células e expandir em 2D. A microscopia electrónica mostrou que o lado apical das células enfrenta a forma do poço (dados não mostrados). </li><li> Antes de infecção, incluindo o intercâmbio de todas médio matriz porão, para permitir que as bactérias para anexar às células. Um protocolo semelhante também foi descrita para a infecção por H. pylori 14. 2D camadas de células não pode conter todos os tipos de células que estão presentes no Organóides 3D. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. microinjeção de organï¿½de Cultura. Nota: Este protocolo pode ser utilizado para microinject bactérias em Organóides. Pode ser útil para iniciar a injecção com Organóidesque são mais permissiva para microinjecção. Por exemplo, rato Organóides gástricas podem crescer em grandes Organóides císticos que são fáceis de atingir. <ol><li> Preparação de material <ol><li> Puxe um capilar de vidro em duas agulhas de injeção, utilizando um extrator micropipeta, de acordo com a recomendação do fabricante. O puxador de micropipeta vai aquecer o capilar de vidro no meio e vai puxar o tubo capilar em duas partes, gerando, assim, duas agulhas de vidro. É prático para puxar várias agulhas e armazená-los em uma placa de Petri limpa. </li><li> Para permitir que a infecção bacteriana, remover os antibióticos a partir de todos os meios por pelo menos 3 mudanças de meio (= uma semana). Isto irá diluir os antibióticos de matriz porão. Se for utilizada uma estirpe bacteriana que é resistente a um antibiótico específico, adicionar este antibiótico específico para minimizar as possibilidades de contaminação. </li><li> Prepare a bancada de trabalho para microinjeções. Para o trabalho em diferentes níveis de segurança biológica, pode ser necessário colocar um estéreomicroscópio dentro de um banco estéril. Neste protocolo, injetar H. pylori sob condições de nível de biossegurança 2 sob um microscópio estereoscópico dentro de um banco estéril. </li><li> Cultura das bactérias de acordo com protocolos padrão 13,23. </li><li> Para estimar a multiplicidade de infecção (MOI), estimar a dois parâmetros: o número de bactérias e o número de células por organï¿½de como descrito abaixo. A MOI pode correlacionar-se com os resultados, por exemplo com hospedeiros de IL-8, a expressão de ARNm de 13. <ol><li> Para calcular a densidade bacteriana na solução infecção, em primeiro lugar estabelecer a curva padrão de unidades de densidade óptica e formadoras de colónias (CFU) de acordo com protocolos padrão 24. Uma densidade óptica de 0,1 a 550 nm deve dar aproximadamente 10 7 CFU / mL. </li><li> Para estimar o número de células por organï¿½de, contar o número de Organóides em um bem. Disrupt Organóides como descrito nas etapas 2.2.1-2.2.4. Após a centrifugação de 5 min a 200 xg e 4 ° C,adicionar 1 ml de solução de dissociação enzimática e ressuspender. <ol><li> Incubar a 37 ° C com agitação repetida durante 5-10 min. Determinar se as células foram dissociadas em células individuais sob o microscópio (tal como o microscópio invertido Leica DMIL a ampliação de 10X). Se necessário prolongar a incubação. </li><li> Contagem de células por organï¿½de utilizando um hemocitómetro e calcular o número de células por organï¿½de. Organóides gástricas humanas com um diâmetro de cerca de 200 um tem aproximadamente 4.000 células. A injecção de 0,2 mL de uma solução bacteriana com 1 x 10 9 bactérias por ml resultados em uma MOI aproximada de 50. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> A injecção de Organóides. Nota: Para micro-injecção, a agulha de vidro é estabilizado em um suporte, o qual pode ser manobrado em 3 dimensões por um micromanipulador. Organóides permanecem dentro da matriz no interior do porão bem. Devido ao tamanho e posicionamento no poço, nem todos os são igualmente um OrganóidesmENABLE para injecção. Geralmente, as 30 maiores Organóides em um poço pode ser alvo de 5 min. <ol><li> Bactérias colheita e lave-os em meio basal de acordo com protocolos padrão de 24. </li><li> Calcular o número de bactérias por ml, de acordo com a densidade óptica (ver passo 3.1.5.1). Dilui-se as bactérias a 1 x 10 9 bactérias por ml em meio basal. </li><li> Dê uma agulha de vidro. Usando fórceps quebrar a ponta de modo a que a abertura irá ser de aproximadamente 10 m de largura. </li><li> Insira a agulha no suporte da injeção e corrigi-lo para o micromanipulador. </li><li> Tome-se, aproximadamente, 10 solução bacteriana ul na agulha. </li><li> Colocar uma placa de 4 bem com bordas baixas que contêm culturas organï¿½de, ao microscópio estereoscópico. </li><li> Navegando com o micromanipulador, segmentar um único Organóides com a agulha. Posicione a agulha perto do organï¿½de e, em seguida, inserir a agulha no organï¿½de com um movimento rápido. Injectar approximately 0,2 ul solução bacteriana em cada organï¿½de utilizando o microinjector. </li></ol></li><li> Colheita Organóides para qualquer análise. <ol><li> Como exemplo, corrigir Organóides após 4 horas. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de formaldeído a 2% e incuba-se 20 min à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. Organóides podem ser processados ​​para imuno-histoquímica de acordo com procedimentos padrão 25. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Aiuto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Models+to+Investigate+Human+Cytomegalovirus+Infection+in+Neural+Cells.">Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).</li><li>Penkert, R. R., Kalejta, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cell+Lines+Model+Experimental+Human+Cytomegalovirus+Latency.">Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency.</a> mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).</li><li>Roelandt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+support+complete+replication+of+hepatitis+C+virus.">Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).</li><li>Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+hepatitis+C+virus+infection+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).</li><li>Shlomai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+host+interactions+with+hepatitis+B+virus+using+primary+and+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocellular+systems.">Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+Hepatitis+C+Virus+Infection+of+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes+Reveals+a+Critical+Transition+to+Viral+Permissiveness+during+Differentiation.">Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+hepatocytes+in+hepatitis+C+virus+infection.">Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection.</a> Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).</li><li>Ng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Support+Plasmodium+Liver-Stage+Infection+In+Vitro.">Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro.</a> Stem Cell Report. 4 (2), (2015).</li><li>Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+cell+cultures+and+organoids+for+protozoan+parasite+propagation+and+studying+host-parasite+interaction.">Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction.</a> Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+NHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+Bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>McCracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids.">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Human+Gastric+Epithelial+Stem+Cells+and+Their+Responses+to+Bacterial+Infection.">In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), (2014).</li><li>Schlaermann, P., Toelle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. , (2014).</li><li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+Plays+a+Functional+Role+in+Helicobacter+pylori-induced+Epithelial+Cell+Proliferation.">CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation.</a> PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt+villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon,+Adenoma,+Adenocarcinoma,+and+Barrett's+Epithelium.">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+ve+Stem+Cells+Drive+Self-Renewal+in+the+Stomach+and+Build+Long-Lived+Gastric+Units+In+Vitro.">Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Genome-Stable+Bipotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Liver.">Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Models+of+Human+and+Mouse+Ductal+Pancreatic+Cancer.">Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+single-cell+imaging+of+NF-kappaB+oscillations+using+monoclonal+cell+lines.">High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines.</a> BMC cell. 11, 21 (2010).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Maintenance+of+Helicobacter+Species.">Laboratory Maintenance of Helicobacter Species.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2006).</li><li>Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+lacking+the+Math1+tumour+suppressor+are+refractory+to+Notch+inhibitors.">Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors.</a> Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Video+Protocol+of+Retroviral+Infection+in+Primary+Intestinal+Organoid+Culture.">A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Stange, D. E., Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Troy++Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium.">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li><li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/TCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells.">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li><li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology.">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+&#946;-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex.">Wnt Signaling through Inhibition of &#946;-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li><li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+'Living+Organoid+Biobank'+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations. 
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

O estudo de agentes patogénicos se baseia em sistemas modelo adequados para imitar a infecção in vivo. Para alguns agentes infecciosos, sistemas modelo adequados faltam enquanto alguns dos sistemas usados ​​estão longe de ser ideal. Um exemplo é a bactéria gástrica Helicobacter pylori (H. pylori), que está causalmente relacionada com o desenvolvimento de cancro gástrico. No entanto, na ausência de um sistema de cultura de células mais adequado, muitos estudos que objetivam analisar os mecanismos moleculares subjacentes linhas celulares de cancro uso de desenvolvimento de câncer, que representam o ponto final da cascata canceroso. Pilhas, não transformadas seria um modelo melhor para estes estudos. No entanto, as células primárias são disponíveis apenas a partir de um pequeno número de doadores e não podem ser cultivadas durante longos períodos de tempo. Nos últimos anos, a pesquisa com células-tronco tem feito progressos significativos para proporcionar novas fontes de culturas de células primárias para o estudo da biologia da infecção. Culturas a partir detrês fontes de células-tronco têm sido utilizadas: as células-tronco embrionárias (ESC), células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) ou células-tronco adultas. Eles têm sido utilizados para modelar as infecções com os vírus, tais como o citomegalovírus ou 1,2 Vírus da Hepatite C 3 - 7, parasitas, tais como Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii 8 ou 9, e as bactérias, tais como Bacterioides thetaiotaomicron 10 ou Salmonella enterica 11. Mais recentemente, várias abordagens têm sido publicados para modelar a infecção por H. pylori com Organóides derivados de ESC ou iPS células 12, as células-tronco adultas 21,22 rato ou humanas células-tronco adultas 13 - 15. O desenvolvimento de culturas de células organï¿½de estaminais adultas originado a partir de um estudo, no qual as células estaminais individuais isolados a partir de epitélio intestinal murino foram semeadas em uma matriz de 3-dimensional eincorporado em meio que mimetizava o ambiente das células estaminais intestinais contendo EGF como mitogénio, R-espondina para melhorar a sinalização Wnt e Noggin para inibir proteína morfogénica do osso (BMP) de sinalização 16. Nomeadamente estas culturas não requer a co-cultura com células mesenquimais. Nestas condições, as células estaminais proliferar e formar pequenas estruturas com domínios abrigar células das criptas intestinais, e domínios que contêm as células das vilosidades intestinais. Os Organóides assim se auto-organizar para imitar a situação in vivo. Hoje em dia, as células estaminais adultas a partir de diversos tecidos de murino e humanas podem ser crescidas in vitro e auto-organizar em Organóides que se assemelham a sua contraparte in vivo, tais como o intestino delgado e cólon 17, estômago 13,18, 19,20 fígado, pâncreas e 21 próstata 22. Aqui nós fornecemos um protocolo de vídeo à cultura mouse ou Organóides gástricos humanos de cel-tronco adultasls e microinject-los com H. pylori. Este protocolo é baseado em relatórios anteriores 13,18. Este método pode ser adaptado para a cultura e infectar outras culturas, tais como organï¿½de Organóides intestinais.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock concentration 50 x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL, final concentration 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;i A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final concentration 2 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;M, final concentration 1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHOKi Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td>Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 &#181;g/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10</td>
			<td>Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic dissociation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell&#174; Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
			<td>biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Neolabs</td>
			<td>2-1033</td>
			<td>Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Well Multidishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td>You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workbench</td>
			<td>Clean Air</td>
			<td></td>
			<td>Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100T-10</td>
			<td>1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Cag A antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-25766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Este protocolo permite o isolamento de glândulas gástricas (Figura 2). Glândulas são semeadas em matriz basal, que se solidifica como gota dentro de um poço, fornecendo uma estrutura 3 dimensional rica em laminina e colagénio para permitir que as glândulas crescer em Organóides (Figura 3). Organóides geralmente começam como pequenas cistos e dentro de 12-16 dias, que se expandem para as esferas com um diâmetro de 50-300 ^ M (Figura 4). Alguns Organóides vai ...

Watch this Scientific Journal Video about Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori at JoVE.com

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K visualizações.  University Medical Centre Utrecht. Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Vídeo: Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Imunologia e Infecção

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

O Madagascar silvando barata como um modelo de animais não-mamíferos alternativo para investigar a eficácia da droga, patogenia e virulência

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolamento de comunidades de bacterianas intracelulares único gerado a partir de um modelo murino de infecção do trato urinário para análise de célula única a jusante

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of secreting proteins into the bloodstream and are easily accessible, making them potentially superior tissue sites for replacement hormone production or vaccination by gene transfer. Suggested methods for gene delivery include transcutaneous injection and retrograde infusion through salivary ducts. We demonstrate how to perform Retrograde Salivary Gland Infusion (RSGI) in non-human primates. We describe the important anatomic landmarks including identification of the parotid papilla, an atraumatic method of cannulating and sealing Stensen&#39;s Duct utilizing basic dental tools, polyethylene tubing, and cyanoacrylate, and the appropriate rate of infusion. While this is the least traumatic method of delivery, the method is still limited by the volume able to be delivered (&#60;0.5 mL) and the potential for trauma to the duct and gland. We demonstrate using fluoroscopy that an infusate can be fully delivered into the gland, and further demonstrate by immunohistochemistry the transduction of a typical vector and expression of the delivered gene.

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen&#039;s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Salivary glands have been proposed as a tissue target site for gene therapy, especially in the area of vaccination by gene transfer. We demonstrate gene delivery in a non-human primate model utilizing retrograde parotid infusion.

Infusão de glândula parotóide retrógrada através do duto de Stensen em um primata não humano para entrega de genes vetoriados

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...