Nosso ensaio de alta produtividade adiciona aos métodos disponíveis para a identificação de pequenas moléculas e seus alvos que modulam a sinalização TCR e a ativação de células T. Nosso ensaio tem um aspecto auto-corretivo através da filtragem de compostos tóxicos e identificação de inibidores de sinalização TCR e apoptose induzida por estimulação. A identificação de mediadores da sinalização TCR pode auxiliar na evolução da terapia para doenças imunológicas.
Fornecemos um forte estímulo para os timócitos derivados de ratos TCR-policlonais. É possível usar camundongos TCR transgênicos e estimulá-los com outros tetramers de ligantes de peptídeos para estimulação mais fraca. Este ensaio envolve o uso de pequenos volumes e de placas de pequeno volume para a colheita das células.
Isso requer um manuseio cuidadoso das placas e do seu conteúdo. Há muitos compostos na biblioteca de inibidores da quinase que são considerados perigosos. Para considerações de segurança, trate todos os compostos como igualmente perigosos e siga as precauções de segurança recomendadas pelo fornecedor.
Para iniciar o tratamento de timócitos com inibidores de quinase, use uma pipeta multicanal para adicionar 40 microliters por poço de timócitos a uma placa de pequeno volume. Coloque o prato no gelo. Em seguida, pipeta uma parte dos inibidores da quinase, DMSO e dexametasona, e quatro partes da mídia RPMI completa em uma placa de 96 poços.
Designe oito poços da placa de pequeno volume para controles não tratados, quatro poços para controles positivos tratados com dexametasona para morte celular adicionando a dexametasona diluída na concentração de cinco micromolares, e quatro poços aos controles tratados com veículos, adicionando 0,5 microlitres do DMSO diluído. Em seguida, dos poços correspondentes da placa inibidora, adicione 0,5 microliters de cada inibidor diluído à placa de 96 poços. Para começar a estimulação de timócitos, primeiro certifique-se de que as contas anti-CD-3 e CD-28 sejam uniformemente re-suspensas.
Em seguida, lave um mililitro das contas com dois mililitros do buffer PBS. Coloque o tubo em um suporte magnético para separar contas do supernascida e aspirar a solução. Em seguida, suspenda novamente as contas em um mililitro do meio RPMI completo.
Adicione 10 microliters por poço da suspensão de contas a cada amostra tratada pelo inibidor, as quatro amostras tratadas com DMSO e quatro das oito amostras não tratadas. Adicione 10 microliters do RPMI completo aos quatro poços não tratados restantes. Use um agitador orbital de microplacar para agitar suavemente a placa.
Em seguida, incubar os timócitos em ambiente de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 17 a 20 horas, ou durante a noite. Prime uma lavadora automática de placas de fluxo laminar, primeiro com 150 mililitros de solução Tween de etanol, depois com água deionizada suplementada com 1%Tween 20, e finalmente, com tampão de lavagem FACS. No final da incubação usando o sistema de arruela de placa, lave a placa com tampão de lavagem FACS usando um ciclo de lavagem de nove vezes.
Cada lavagem adiciona e remove 55 microliters de tampão de lavagem por fluxo laminar, resultando em uma diluição exponencial dos reagentes nos poços. Para colorir antígenos superficiais, primeiro dilua um volume unitário de anticorpos anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 e anticorpos anti-CD-69 em volumes de 100 unidades do buffer de lavagem FACS. Em seguida, suspenda novamente as células em 25 microliters da mistura de anticorpos de coloração.
Use um agitador orbital de microplacar para agitar suavemente a placa e, em seguida, deixe a placa no gelo por 30 minutos. Para fixar as células, primeiro lave a placa com 55 microliters de tampão de lavagem FACS usando ciclo de lavagem de nove vezes como descrito anteriormente. Em seguida, adicione 50 microliters do buffer de fixação-impermeablização a cada poço.
Misture bem e incubar a placa no gelo por 30 minutos. Após a incubação, prepare um perm de um X e lave tampão diluindo 25 mililitros do estoque fornecido de 10X em 225 mililitros de água Ultrapure. Prime a lavadora de placa com tampão de um X e lave a placa com 55 microliters do buffer one-X usando um ciclo de lavagem de nove vezes como descrito anteriormente.
Para começar, misture um mililitro do anticorpo anti-caspase 3 com dois mililitros do perm de um X e tampão de lavagem. Adicione 25 microliter por poço da mistura às células fixas. Use um agitador orbital de microplacar para agitar suavemente a placa.
Deixe a placa no gelo por uma hora. No final da incubação, repita o passo de lavagem nove vezes com o perm one-X e o tampão de lavagem. Em seguida, adicione 25 microliters do tampão de lavagem FACS a todos os poços da placa.
Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para misturar a solução. Finalmente, transfira as amostras mistas em tubos de microtiter. Cubra os tubos com o tampão de lavagem FACS a um volume total de 200 microliters e prossiga para a análise da citometria de fluxo.
Após a estimulação anti-CD-3, o CD-28, um aumento na ativação caspase-3 e a baixa regulação do TCR foram observados tanto nas amostras não tratadas quanto nas amostras tratadas por simulação do DMSO. Além disso, observou-se aumento da expressão CD-69 em ambas as amostras estimuladas. As amostras tratadas com dexametasona mostraram um aumento na ativação caspase-3 independente da regulação do CD-69, como esperado para o efeito independente indutor de apoptose e a estimulação tcr.
O comprometimento seletivo dos fenômenos de ativação de células T foi demonstrado por diferentes inibidores que suprimiram tanto a ativação caspase-3 quanto a regulação do CD-69, ou inibiram a regulação do CD-69, mas não prejudicaram a ativação do caspase-3. Houve também inibidores que não visavam uma quinase relevante da via de sinalização TCR e, portanto, não suprimiam tanto a regulação do CD-69 quanto a ativação do caspase-3. O resultado da tela da staurosporina, o controle positivo da apoptose, mostrou altos níveis de ativação caspase-3, como esperado.
No entanto, o resultado também mostrou baixos níveis de expressão CD-69 que podem ser atribuídos à sua inibição mediada da proteína quinase C ou sua apoptose induzida antes da expressão CD-69. A comparação de diferentes protocolos de ensaio não mostrou diferenças nas manchas ativas de caspase-3, CD-69 e TCR do controle negativo, o controle positivo para morte celular, o controle do veículo e uma amostra tratada com inibidores. Os estágios de pré-incubação destinam-se a facilitar o uso da placa de pequeno volume para a cultura das células.
O protocolo padrão dependente da centrífuga também é fornecido no manuscrito. Inibidores ou alvos potencialmente interessantes podem ser validados usando diferentes tipos de células e também em diferentes espécies, como linfócitos de camundongos pagopherais ou células primárias humanas. A caracterização subsequente das moléculas identificadas e dos alvos pode ajudar a melhorar a compreensão da biologia das células T e expandir-se sobre possíveis alvos para a imunomodulação.
