Este protocolo fornece um meio para acultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes. É fácil desenvolver as vesículas gigantes, e apenas um volume muito pequeno de solução amostral é necessário para preparar as vesículas. Demonstrando o procedimento estará Yuri Ota, doutorando do nosso laboratório.
Comece adicionando 20 microliters de solução POPC recém-preparada e quatro microliters de solução biotina-PEG-DSPE recém-preparada a um frasco de vidro. Evaporar o solvente orgânico pelo fluxo de ar até formar uma filmagem lipídica. Coloque o filme em um desiccator por uma hora para evaporar completamente o solvente orgânico.
Em seguida, adicione 200 microliters de óleo mineral ao frasco. Cubra a abertura do frasco com filme de parafina de plástico, e sonicar o conteúdo do frasco em um banho ultrassônico a 120 watts por pelo menos uma hora. Para uma pequena preparação vesícula, crie um filme lipídico, como acabou de demonstrar, e adicione 200 microliters de glicose de 200 milímetros no meio LB ao filme.
Em seguida, sonicar o filme a 120 watts por pelo menos uma hora, seguido pela extrusão das vesículas gigantes resultantes em pequenas vesículas usando uma mini extrusora e uma membrana de policarbonato com um tamanho de poros de 100 nanômetros. Para pré-cultura celular bacteriana, inocular E.coli de uma placa LB em mililitros de meio LB para uma cultura noturna a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, transfira 20 microliters do supernascer da cultura para 1,98 mililitros de meio LB fresco para mais duas horas de cultura.
No final da incubação, verifique a densidade óptica em 600 nanômetros, ou valor de 600 OD, da solução pré-cultura em um espectotômetro. Uma solução pré-cultura com um OD 600 de um a 1,5 deve ser usada. Em seguida, misture a solução pré-cultura com solução de sacarose recém-preparada e meio LB fresco, de acordo com a tabela um.
Para formação de vesículas gigantes, adicione 50 microlitadores de uma solução aquosa externa recém-preparada de vesículas gigantes a um tubo de plástico de 1,5 mililitro. Camada suave 150 microliters da solução de óleo contendo lipídios sobre a solução aquosa externa de vesículas gigantes. Incubar a solução resultante por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente, antes de verificar para garantir que a interface do óleo e soluções aquosas seja plana.
Para a célula bacteriana de água e óleo contendo formação de gotículas, adicione dois microliters de uma solução aquosa interna recém-preparada de vesículas gigantes a 50 microliters da solução de óleo contendo lipídios sonicados em um tubo plástico litoleiro de 0,6 mililitro. Em seguida, toque no tubo para emulsionar os dois componentes. Em seguida, use uma pipeta para adicionar 50 microliters de água e solução de gotícula de óleo à interface do óleo e solução aquosa, e sedimentar as vesículas gigantes contendo células bacterianas por centrifugação.
Em seguida, aspire a camada de óleo superior e colete as vesículas gigantes. Para preparar uma câmara artesanal, faça um buraco de sete milímetros com um soco oco em um selo de 10 por 10 por um milímetro de dupla cara, em seguida, cole a vedação de duas caras em um vidro de cobertura de 30 por 40 milímetros. Para preparar uma membrana bi-camada suportada, adicione 30 microliters da pequena solução vesícula ao orifício da câmara artesanal.
Incubar as vesículas em temperatura ambiente por 30 minutos. No final da incubação, lave suavemente o orifício duas vezes com 20 microliters de meio LB, suplementado com 200 milimil. Para imobilizar vesículas gigantes na membrana bi-camada de apoiador, introduza 10 microliters de neutravidina em solução de vesícula gigante aquosa externa para o buraco para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.
No final da incubação, lave suavemente o orifício duas vezes com 20 microliters de meio LB, suplementado com 200 milimil. Em seguida, sele o orifício com um vidro de cobertura de 18 por 18 milímetros. Para monitorar o crescimento bacteriano dentro das vesículas gigantes, selecione o objetivo de 40X em um microscópio invertido e coloque a câmara no sistema de estágio de aquecimento do microscópio.
Em seguida, incubar as vesículas gigantes contendo células bacterianas na câmara em condições estáticas por seis horas a 37 graus Celsius, capturando e registrando imagens do crescimento celular bacteriano a cada 30 minutos, com a câmera científica complementar de óxido de metal semicondutor. Vesículas gigantes contendo células bacterianas normalmente variam em tamanho de 10 a 30 micrômetros. Para ambos os tamanhos de vesículas gigantes, as células E.coli sofrem processos de alongamento e divisão, com algumas células de E.coli crescendo para um número muito grande de células durante o período de observação de seis horas.
A frequência relativa de vesículas gigantes contendo um único nível celular é aproximadamente 10% das vesículas gigantes obtidas, e as vesículas gigantes encapsuladas ao nível de célula única são aproximadamente 50% das vesículas gigantes contendo células bacterianas. A estabilidade da interface óleo-água é importante para a obtenção de vesículas gigantes contendo células bacterianas. Tome cuidado para aspirar o óleo cuidadosamente antes da correção vesícula gigante.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes individuais. Nosso método de cultura bacteriana é uma nova ferramenta em microbiologia para cultivar bactérias ambientais desconhecidas para obter ou analisar seus produtos metabólicos.
