Este projecto foi financiado pelo Land Baden-Württemberg, bem como pela União Europeia, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Os autores agradecem Rainer Wittig (ILM Ulm) para fornecer a linha de células U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 e Claudia Hintze para assistência técnica hábil.

1. celular em crescimento esferóide e Incubação <ol><li> Experimento 1: celulares esferóides incubadas com um quimioterápico <ol><li> Prepare de agarose a 1,5% em meio de cultura pela adição de 0,45 g de agarose de 30 ml de meio de cultura (suficiente para 6 placas). </li><li> Aquece-se a mistura a partir do passo 1.1.1 a, pelo menos, 80 ° C, com agitação de vez em quando. </li><li> Encher 50 ul da mistura aquecida do passo 1.1.2 em cada poço de uma placa de 96 poços e deixar solidificar dentro de 1-2 horas. Armazene as placas fechado e coberto na geladeira a 5 ° C até o uso. </li><li> Semente de cerca de 150 células MCF-7 de cancro da mama em cada poço do preparado placa de 96 poços em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com meio F-12 de cultura de Ham suplementado com 10% soro fetal de vitelo (FCS) e 1% de penicilina / estreptomicina . </li><li> Grow esferóides de 5-7 dias até um diâmetro de cerca de 200-300 um numa incubadora a 5% de CO 2 e 3776; C. </li><li> Incubar os esferóides de células com o antibiótico antraciclina doxorubicina cloridrato de 6 horas a uma concentração que varia entre 2 um e 8 uM (em meio de cultura) em uma incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C. </li><li> Lavar os esferóides de células com meio de cultura ou solução salina equilibrada de Earle (EBSS) antes da microscopia. </li></ol></li><li> Experimento 2: processo de oxidação em esferóides expressando um sensor redox <ol><li> Semente de cerca de 400 células de glioblastoma U251-MG-L106 permanentemente transfectadas com a glutationa sensível do sensor redox fluorescente verde Grx1-roGFP2 em poços revestidos com gel de agarose (procedimento descrito nos passos itens 1.1.1-1.1.3) de uma placa de 96 poços em DMEM meio de cultura suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 ug / ml). </li><li> Grow esferóides de 5-7 dias até um diâmetro de cerca de 200-300 um numa incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C. </li><li> Adicionar 10 &amp; #181; litros de uma solução de peróxido de hidrogénio (purum aa, ≥ 30%) a 990 ul de água bi-destilada para criar uma solução de estoque de 100 mM para ser usado no prazo de 12 horas. </li><li> Dilui-se a solução-mãe a partir do passo 1.2.3 a 50 uM em EBSS direita antes da experiência. </li><li> Incubar os esferóides de células através do sistema de microfluidos durante a medição de peróxido de hidrogénio com 50 ^ M em EBSS para a oxidação do sensor redox. </li></ol></li><li> Experimento 3: Iniciação e rotulagem de necrose celular dentro de esferóides <ol><li> Semente de cerca de 400 células (por exemplo, células de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) em poços revestidos com gel de agarose (procedimento descrito nos passos itens 1.1.1-1.1.3) de uma placa de 96 poços em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml). </li><li> Grow esferóides de 5-7 dias até um diâmetro de cerca de 200-300 um numa incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C. </li><li> Incubar a célulaesferóides com o inibidor de transporte de electrões mitocondrial rotenona durante 3 horas a uma concentração de 1 uM em meio de cultura para induzir a necrose celular. Além disso, a co-incubação com um corante verde citotoxicidade durante 3 horas a uma concentração de 1 ml em 1 ml de meio de cultura de modo a marcar células necróticas. </li><li> Lave os esferóides de células com meio de cultura ou EBSS antes de microscopia. </li></ol></li></ol> 2 Ajuste folha de luz NOTA: Para alcançar melhores resultados tem que ser assegurado que a cintura do feixe da folha de luz está no plano de foco da lente objetiva. A posição do feixe de cintura apenas podem ser alinhadas por meio da observação da folha de luz na posição vertical relativamente ao capilar (ver passos 2,5-2,8). <ol><li> Usar um microscópio invertido e montar o módulo de excitação SPIM, como descrito na referência. 16, para a placa de base da mesa de posicionamento (ver a Figura 1A). </li><li> Equipar o microscópio com um 10X / 0,3 ou 20X / lente objectiva de microscópio de 0,5 e um filtro de passagem longa apropriado (por exemplo, λ ≥ 515 nm) no caminho de detecção do microscópio. </li><li> Montar uma câmara integrando para o orifício de detecção do microscópio. </li><li> Usar um feixe colimado paralelo de um laser ou de um díodo de laser com um comprimento de onda de excitação de 470 nm, preferencialmente, e aplicá-lo ao módulo SPIM. </li><li> Gire a lente cilíndrica de 90 graus, o que transfere a folha de luz em uma posição vertical para um ajuste axial da cintura do feixe da folha de luz. </li><li> Coloque um capilar contendo um líquido com um corante fluorescente no suporte da amostra. </li><li> Montar o suporte da amostra, com o capilar para a mesa de posicionamento do microscópio e alinhar a posição do capilar de tal forma que ele é centrado e a cintura do feixe de luz da folha está em foco. </li><li> Ajustar a cintura do feixe por variação da posição axial da própria lente cilíndrica. Volte a lente após anúncioajusta-. </li></ol> Aplicação Esferóide 3. celular e sincronização de alimentação Microscópio <ol><li> Colocar os esferóides de células separadamente ou em grupos dentro de borosilicato rectangular capilares de vidro 16 com uma secção transversal interna de 600 um x 600 ^ m e uma espessura de parede de 120 um. Duas técnicas de aplicação de um esferóide das células provaram ser bem sucedidas. <ol><li> Leve o capilar vazio na posição vertical com o polegar eo dedo médio e selar a abertura superior com o dedo indicador. Traga a abertura inferior perto do esferóide de células em seu líquido circundante (EBSS ou meio de cultura). Solte o dedo indicador da abertura superior. Líquido com o esferóide de células em que vai ser embebido em imediatamente por forças capilares. Ajustar a posição do esferóide dentro do capilar cheio pela gravidade na respectiva posição vertical do capilar. </li><li> Alternativamente, aplicam-se os esferóides de células para o capilar por meio de pipetagem. Tome cuidado that da abertura da ponta da pipeta é, por um lado, suficientemente grande para o tamanho do esferóide e, por outro lado, inferior ou igual em tamanho que o diâmetro interno do capilar. </li></ol></li><li> Colocar o tubo capilar com o esferóide nele num suporte de amostras para a microscopia especial. </li><li> Montar o suporte da amostra, com o capilar para a mesa de posicionamento do microscópio e alinhar a posição do esferóide de células de tal modo que é centrada e focada. </li><li> Definir a correspondência entre a folha de luz e o plano focal da lente objectiva de microscópio, no caminho de detecção através do ajuste da posição da reflexão de espelho e a lente cilíndrica (ver parafuso de ajuste na Figura 1B). </li><li> Ajustar o parafuso micrométrico (ver Figura 1B) de acordo com os índices de refracção e a abertura numérica da lente objectiva para compensar o efeito de aquário. NOTA: Diferentes índices de refração da amostra e os meios de comunicação ao redor tele chumbo lente objetiva para a diferença entre o deslocamento da lente objetiva ea mudança do plano focal. Uma vez que a folha de luz é movida pela torre objectivo, a incompatibilidade entre o deslocamento da folha de luz (que corresponde ao deslocamento da lente objectiva) e o deslocamento do plano focal é compensado por um braço de alavanca (ver Figura 1B). O parafuso micrométrico é usado para adaptar a distância entre a parte superior e inferior do pino para ajustar o deslocamento da folha de luz de acordo com a abertura numérica da lente objectiva e os índices de refracção. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> A Figura 1 (A) Imagem do módulo de iluminação plano único montado na placa de base da mesa de posicionamento de um microscópio invertido, (B) a instalação da iluminação único planomódulo ea sincronização de alimentação microscópio para compensar a elevação-incompatibilidade (efeito aquário) entre o plano focal eo plano de iluminação. Δz o indica o deslocamento da lente objetiva e Δz f a mudança do plano focal ea folha de luz. A capa mostra seções transversais de esferóides contendo capilares. Esquerda: capilar rectangular com diâmetro interior de 600 um (parede 120 um). Direita: Setup utilizado para a rotação. Um capilar interna redonda (diâmetro interno 400 um, diâmetro externo de 550 mm) é rodado dentro do capilar rectangular exterior. O espaço entre os dois capilares é enchido com um fluido de imersão. 4. Medição em Dinâmica meio líquido NOTA: O protocolo anterior é usado para incubação estática antes de uma medição onde o esferóide de células tenha sido previamente incubadas e mantido no lugar no capilar pela gravitação simples. Não há necessidade de mais FIXAÇÃOna. No entanto, para as medições em meios em que uma incubação dinâmico e, por conseguinte, um ambiente dinâmico é desejável medir a cinética da captação de fluxo, pode-se realizar este sub-protocolo. Passos 4,5-4,9 são fundamentais para evitar bolhas de ar que atingem a amostra. <ol><li> Encher o capilar com FCS durante 30 min para suportar a adesão celular, depois de um esferóide célula para a superfície de vidro interior. </li><li> Deixe o revestimento FCS remanescente no capilar empobrecido secar durante pelo menos 12 horas. </li><li> Introduzir o esferóide de células para o capilar revestido de FCS, tal como descrito na etapa 3.2. </li><li> Deixar o capilar na incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2-4 horas adicionais para fazer com que a adesão celular do esferóide. </li><li> Configure o afluxo parte do sistema de microfluídica (ver Figura 2). Usar uma bomba peristáltica para preencher o afluxo da tubagem (diâmetro interno: 0,89 mm) com meio de cultura contendo o corante fluorescente, fármaco ou agente. </li><li> Connect o afluxo parte do sistema de microfluidos de uma armadilha de bolhas (ver Figura 2). </li><li> Em primeiro lugar prender o capilar livre de bolhas para a tubagem de afluxo e, em seguida, apertar o outro lado do capilar para o tubo de drenagem. </li><li> Ajustar a temperatura do líquido do banho de água para o valor desejado (por exemplo, 37 ° C). </li><li> Ajustar a bomba peristáltica para a velocidade da bomba desejado (por exemplo, taxa de fluxo: 9 mL / min, velocidade de bomba no capilar: 25 mm / min). </li><li> Recolha o líquido bombeado ou em uma (instalação de circuito aberto) destinatário, alimentá-lo de volta à sua fonte (instalação de circuito fechado) ou alimentá-lo diretamente para o tubo da bomba peristáltica (instalação de circuito fechado apertado). </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 configuração microfluídicos (open-loop e apertado em circuito fechado); inlay: Iluminação de um spheroid dentro de um micro-capilar usando microscopia de fluorescência de luz folha de base acoplado a um microscópio invertido. 5 Aquisição de Dados e Análise <ol><li> Defina a potência do laser e do tempo de integração para a aquisição de imagem. </li><li> Ter cuidado para que os parâmetros definidos na etapa 5.1 não excedam os valores de dose de luz sobre 50-100 J / cm 2, para as células nativas ou 10-20 J / cm 2, para as células incubadas com um corante fluorescente ou transfectadas com um plasmídeo que codifica para a proteína fluorescente evitar fototoxicidade (ver detalhes Ref. 12). </li><li> Definir o incremento para a z-pilha de Δz = 5-10 uM que é preferível para a análise de dados em 3 dimensões, como a espessura da folha de luz é de cerca de 10 um. </li><li> Realizar medições de imagens individuais ou Z-stacks pela variação do plano focal dentro do esferóide celular. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. 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Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O presente manuscrito descreve uma folha de luz ou microscopia de iluminação plano único (SPIM) dispositivo que é otimizado para sistemas de células em 3 dimensões, por exemplo, tumores esferóides multicelulares (MCTS). Três aplicações exemplares incluem (1) absorção de uma droga citostática e sua conversão parcial para um produto de degradação (cuja contribuição para a eficácia quimioterapêutica ainda a ser avaliada), (2) as medições do estado redox de utilização de um sensor de glutati...

Além de métodos bem estabelecidos (confocal ou multi-fotão microscopia de varredura a laser 1-4, estruturado de microscopia de iluminação 5,6) folha de luz ou de microscopia de iluminação plano único (SPIM) tem provado ser um método valioso de imagens 3D 7,8, 9. De particular interesse é a sua aplicação a culturas de células de 3 dimensões, como por exemplo, esferóides multicelulares tumorais (TCM), que são cada vez mais utilizados para a investigação de descoberta de fármacos 10,11. Além disso, o SPIM é um método preferencial quando mesmo após a exposição a longo prazo ou medidas repetidas doses de pouca luz são necessárias para manter a viabilidade da amostra, uma vez que para a medição de cada plano da amostra somente este plano será exposto à luz. Isto está em contraste com outras técnicas de microscopia, em que para a detecção de cada plano focal toda a amostra é iluminado, de modo que após a gravação de numerosos aviões as somas de dose de luz e podem danificar-se a amostra 12. </p&gt; A microscopia de luz ou SPIM folha baseia-se na iluminação da amostra no sentido perpendicular à linha de observação ou pela utilização de uma lente cilíndrica, ou através da leitura do feixe de laser excitante (para uma revisão ver ref. 8). Isso muitas vezes requer câmaras de amostras especiais 13,14 ou matrizes, por exemplo, agarose 7,15, implementado em microscópios especiais de alto custo. Como uma alternativa aos sistemas de um dispositivo de iluminação para comparavelmente simples SPIM foi desenvolvido e adaptado para um microscópio invertido convencional 16 (ver Figura 1). É constituída por um feixe laser expandido até um diâmetro de 8 mm e focada por uma lente cilíndrica (distância focal: 50 mm, abertura numérica: 0,08) para uma folha de luz de espessura 6-10 uM sobre uma profundidade de campo de cerca de 100 pm . As amostras estão situadas num capilar rectangular de 600-900 um de diâmetro interno colocado em frente do len objectivo microscópios para a detecção de fluorescência. Estas características principais são actualmente preenchido e optimizado pelo uso de avançadas abordagens de micro-capilares para segurar e para fazer rodar as amostras, o ajustamento síncrono da folha de luz iluminante (na direcção axial) e a lente objectiva utilizados para a detecção de fluorescência (caminho óptico idêntico comprimentos de deslocamento exigem uma correcção do arrastamento mecânico), bem como a adaptação de um sistema de microfluídica para aplicação de corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas, minimizando, assim, as quantidades e as despesas necessárias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Um módulo de folha de luz ou microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensional, por exemplo, esferóides multicelulares tumorais (TCM). As formas de módulos SPIM excitação e deflecte a luz de tal modo que a amostra é iluminada por uma folha de luz perpendicular ao percurso de detecção do microscópio. O sistema é caracterizado pela utilização de um capilar para a realização rectangular (e em uma versão avançada também por uma abordagem de micro-capilar para rotação) das amostras, através de ajuste da folha síncrono de luz que ilumina a lente objectiva e usado para a detecção de fluorescência, bem como , por adaptação de um sistema de microfluidos para a aplicação de corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas em pequenas quantidades. Um protocolo para trabalhar com este sistema é dado, e alguns detalhes técnicos são relatados. Os resultados representativos incluem (1) medição da acimater de uma droga citostática (doxorrubicina) e a sua conversão parcial para um produto de degradação, (2) as medições redox por utilização de um sensor de glutationa geneticamente codificado por adição de um agente oxidante, e (3) a iniciação e rotulagem de necrose celular da inibição da a cadeia respiratória mitocondrial. Diferenças e vantagens da presente módulo SPIM em comparação com os sistemas existentes são discutidos.

Experimento 1: celulares esferóides incubadas com um quimioterápico Uma varredura z-pilha de uma previamente incubadas células MCF-7 de células esferóide (8 uM de doxorrubicina, 6 horas) está descrito na Figura 3. Ele fornece informações detalhadas sobre a absorção celular e a distribuição de 17 doxorrubicina e do seu produto de degradação 18,19. Dentro da camada celular externa da doxorrubicina fluorescente vermelho esfer...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Um módulo para microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensionais. A amostra está localizado dentro de um capilar rectangular, e através de um sistema de microfluidos corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou de drogas pode ser aplicada em pequenas quantidades.

Único plano Iluminação Módulo e Abordagem Micro-capilar por um microscópio Wide-campo

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

9.6K visualizações.  Aalen University.  Um módulo para microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensionais. A amostra está localizado dentro de um capilar rectangular, e através de um sistema de microfluidos corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou de drogas pode ser aplicada em pequenas quantidades. 

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Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular organelles 2,3, as well as for high spatial and temporal resolution readout of their position relative to the center of the trap. The system described herein has one such "traditional" trap operating at 980 nm. It additionally provides a second optical trapping system that uses a commercially available holographic package to simultaneously create and manipulate complex trapping patterns in the field of view of the microscope 4,5 at a wavelength of 1,064 nm. The combination of the two systems allows for the manipulation of multiple refractive objects at the same time while simultaneously conducting high speed and high resolution measurements of motion and force production at nanometer and piconewton scale.

The system described herein employs a traditional optical trap as well as an independent holographic optical trapping line, capable of creating and manipulating multiple traps. This allows for the creation of complex geometric arrangements of refractive particles while also permitting simultaneous high-speed, high-resolution measurements of the activity of biological enzymes.

Construção de um microscópio de alta resolução com recursos de captura óptica convencional e holográfico

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

Engenharia

Analysis of Contact Interfaces for Single GaN Nanowire Devices

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit a strong degradation after annealing due to the occurrence of void formation at the contact/SiO2 interface. This void formation can cause cracking and delamination of the metal film, which can increase the resistance or lead to a complete failure of the NW device. In order to address issues associated with void formation, a technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from the substrates to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN NW devices. This procedure determines the degree of adhesion of the contact films to the substrate and NWs and allows for the characterization of the morphology and composition of the contact interface with the substrate and nanowires. This technique is also useful for assessing the amount of residual contamination that remains from the NW suspension and from photolithographic processes on the NW-SiO2 surface prior to metal deposition. The detailed steps of this procedure are presented for the removal of annealed Ni/Au contacts to Mg-doped GaN NWs on a SiO2 substrate.

A technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from their substrate to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN nanowire devices.

Análise de Contato Interfaces para únicos dispositivos de nanofios de GaN

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit  a strong degradation after annealing due to the  occurrence of void formation at the ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is presented. The SANS shear cell consists of a concentric cylinder Couette geometry that is sealed and rotating about a horizontal axis so that the vorticity direction of the flow field is aligned with the neutron beam enabling scattering from the 1-2 plane of shear (velocity-velocity gradient, respectively). This approach is an advance over previous shear cell sample environments as there is a strong coupling between the bulk rheology and microstructural features in the 1-2 plane of shear. Flow-instabilities, such as shear banding, can also be studied by spatially resolved measurements. This is accomplished in this sample environment by using a narrow aperture for the neutron beam and scanning along the velocity gradient direction. Time resolved experiments, such as flow start-ups and large amplitude oscillatory shear flow are also possible by synchronization of the shear motion and time-resolved detection of scattered neutrons. Representative results using the methods outlined here demonstrate the useful nature of spatial resolution for measuring the microstructure of a wormlike micelle solution that exhibits shear banding, a phenomenon that can only be investigated by resolving the structure along the velocity gradient direction. Finally, potential improvements to the current design are discussed along with suggestions for supplementary experiments as motivation for future experiments on a broad range of complex fluids in a variety of shear motions.

A shear cell is developed for small-angle neutron scattering measurements in the velocity-velocity gradient plane of shear and is used to characterize complex fluids. Spatially resolved measurements in the velocity gradient direction are possible for studying shear-banding materials. Applications include investigations of colloidal dispersions, polymer solutions, and self-assembled structures.

Medição de materiais Microstructure Sob fluxo Usando 1-2 Plane Fluxo-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle&#039;s Mapping and Quantification in Organ Tissue

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

Induzida por laser Breakdown Spectroscopy: Uma Nova Abordagem para Mapeamento e Quantificação de nanopartículas em Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

Em ruptura dielétrica Situ dependentes do tempo no Microscópio Eletrônico de Transmissão: A possibilidade de compreender o mecanismo de falha em dispositivos microeletrônicos

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope de Inspeção MEMS e Caracterização

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building blocks in a bottom-up approach is still open. The scanning probe microscope (SPM) could be a tool of choice; however, SPM-based manipulation was until recently limited to two dimensions (2D). Binding the SPM tip to a molecule at a well-defined position opens an opportunity of controlled manipulation in 3D space. Unfortunately, 3D manipulation is largely incompatible with the typical 2D-paradigm of viewing and generating SPM data on a computer. For intuitive and efficient manipulation we therefore couple a low-temperature non-contact atomic force/scanning tunneling microscope (LT NC-AFM/STM) to a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles. This setup permits &#34;hand controlled manipulation&#34; (HCM), in which the SPM tip is moved according to the motion of the experimenter&#39;s hand, while the tip trajectories as well as the response of the SPM junction are visualized in 3D. HCM paves the way to the development of complex manipulation protocols, potentially leading to a better fundamental understanding of nanoscale interactions acting between molecules on surfaces. Here we describe the setup and the steps needed to achieve successful hand-controlled molecular manipulation within the virtual reality environment.

We demonstrate the precise manipulation of individual organic molecules on a metal surface with the tip of a scanning probe microscope driven in 3D by the experimenter's hand using a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles.

Mão Controlado Manipulação de solteiro moléculas através de um Scanning Probe Microscope com uma interface de realidade virtual 3D

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Demonstração de um microscópio integrado Hyperlens e super resolução imagem

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new techniques capable of characterizing their dynamics. Investigating single dopants requires sub-nanometer spatial resolution, which motivates the use of scanning tunneling microscopy (STM). However, conventional STM is limited to millisecond temporal resolution. Several methods have been developed to overcome this shortcoming, including all-electronic time-resolved STM, which is used in this study to examine dopant dynamics in silicon with nanosecond resolution. The methods presented here are widely accessible and allow for local measurement of a wide variety of dynamics at the atomic scale. A novel time-resolved scanning tunneling spectroscopy technique is presented and used to efficiently search for dynamics.

We demonstrate an all-electronic method to observe nanosecond-resolved charge dynamics of dopant atoms in silicon with a scanning tunneling microscope.

Todo-eletrônico nanossegundo-resolvido encapsulamento microscopia: Facilitar a investigação do Dopant única carga dinâmica

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

Litografia de feixe de elétrons do nanômetro do dígito com uma aberração corrigida digitalização microscópio eletrônico de transmissão

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...