This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

O modelo de isquemia cerebral introduzido aqui dá volumes de infarto altamente reprodutíveis determinada 24-48 horas e 7 dias após a ligadura MCA por diferentes abordagens 8,15,17. Este modelo MCAO tem uma baixa taxa de mortalidade (menos de 1%) em comparação com os outros, minimizando o número de animais utilizados nos estudos. Uma etapa fundamental para se obter esta baixa taxa de mortalidade é de manter as condições de assepsia adequadas para evitar infecções que poderiam prejudicar a sobrevivência após a indução acidente vascular cerebral. Este modelo MCAO pode não só ser usado como um modelo MCAO permanente, que é considerado um modelo clinicamente relevante para a investigação de translação 18, mas também como um modelo de transição por ligadura temporária da ACC e da MCA com um nó corrediço e posterior reperfusão no momento desejado 19. Este método tem sido utilizado com sucesso em ratinhos e ratos 17,20. Todas essas evidências indica que MCAO por ligação é um modelo versátil alta de isquemia cerebral com múltiplas aplicações. A critical passo desta técnica é que não requer cirurgia invasiva sob um estereomicroscópio; a craniotomia deve ser realizada com muito cuidado, para não danificar o osso zigomática bem como a MCA. No entanto, a utilização de animais sham (os quais são submetidos ao procedimento cirúrgico e da MCA mas CCA ligadura não é executada) proporciona uma ferramenta útil para discriminar efeitos dependentes de procedimentos cirúrgicos. A extensão da lesão cerebral após esta técnica pode ser quantificada por vários métodos. Nosso protocolo de seccionamento do cérebro, coloração de Nissl e subsequente estimativa do volume por Cavalieri permite uma quantificação exacta da região danificada e minimiza o número de ratos utilizados neste tipo de estudos desde secções de cérebro de série também pode ser utilizado para a análise imuno-histoquímica diferente. Para um melhor desempenho desta metodologia, é importante escolher os parâmetros apropriados utilizados no software estereologia (Tabela 1), que será necessária para a estimativa the volume das diferentes regiões pela fórmula: V = 1 / * ssf um f * t * i ΣP (SSF é a fracção de amostragem fatia, t é a espessura média das secções, uma f é a área do espaçamento da grelha e ΣP o número de pontos que afectam a estrutura). A MCAO distal por ligação pode ser útil para caracterizar o infiltrado de leucócitos e subpopulações de células imunes que 8,13 participar no processo inflamatório após lesão cerebral 1-4. Aqui, propomos duas metodologias diferentes para a caracterização do cérebro de células imunes, uma abordagem estereológica precisa e uma análise de citometria de fluxo para melhor caracterizar vários leucócitos as subpopulações. Tirando vantagem da série de corte cerebral, a quantificação do número total de neutrófilos pode ser conseguida pelo método de fraccionamento óptico 16, o qual calcula o número total de células a partir do número de células wit amostradoha aleatoriamente amostradas (SRS) conjunto sistemático de espaços virtuais imparciais contagem abrangendo toda a região de interesse, no nosso caso, a região de infarto, com distância uniforme entre os espaços virtuais de contagem imparciais em direções X, Y e Z. Este método fornece uma ferramenta precisa para estimar o número total de neutrófilos no cérebro isquémico em diferentes momentos após a ligação. Embora ainda não tenha sido demonstrado neste estudo, este protocolo pode também ser usado para a estimativa dos diferentes sub-populações de neutrófilos após isquemia e 21 para uma quantificação precisa de qualquer outra população de células encontradas no cérebro isquémico como outros leucócitos infiltrados (monócitos / macrófagos) e também para estimar neurônios sobreviventes ou mesmo para a neurogênese quantificação após acidente vascular cerebral. O passo mais importante para uma estimativa exacta da área desejada é a selecção dos parâmetros apropriados, como os mostrados na Tabela 3, para a quantificação de neutrófilos na região isquémica.Estes parâmetros serão usados ​​para o software de estereologia para calcular o número total de células positivas para (N), usando a equação N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / tsf (ΣQ- é o número total de células contadas com o de fraccionamento, SSF é a fração de amostragem seção, asf é a área fração de amostragem, e tsf é a espessura fração de amostragem) 5. Embora esta metodologia é mais lento do que outras técnicas de quantificação (por exemplo, análise de marcadores de neutrófilos por mg de tecido, densitometria de imagens ou o número de neutrófilos por campo representativo), que tem a vantagem de ser uma técnica imparcial e um sólido que proporciona uma precisão quantificação do número de células. A abordagem isolamento de leucócitos cérebro permite uma identificação e quantificação simultânea de vários subtipos de células imunológicas, sem a necessidade de influenciar o sistema por coloração in vivo ou manipulações genéticas. Célula subsequente triagem do mielóide p caracterizadoopulations ou a sua separação imunomagnética pode ser usado para várias aplicações a jusante, tais como outros estudos sobre gene ou expressão da proteína. A caracterização precisa de neutrófilos, monócitos e microglia obtidos com este método proporciona uma elevada especificidade em relação a métodos existentes, tais como os estudos de imuno-histoquímica, uma vantagem que permite a atribuição de funções específicas para as diferentes células mielóides cérebro que medeiam a resposta imune inata. Além disso, ela pode ser alargada de modo a caracterizar outras populações de cérebro com o rótulo adequado, como através do sangue, macrófagos (CD11b CD45 + CD68 + oi), e pode ser aplicado para o estudo de outras patologias do SNC ou ferimentos. Portanto, esta técnica fornece uma ferramenta essencial para explorar a heterogeneidade da resposta inflamatória no cérebro. A principal limitação desta técnica reside na preparação das suspensões de leucócitos a partir de tecido cerebral fresco, o que pode alterar oestado de activação das células ou das suas alterações antigénio. Embora esta técnica permite uma caracterização qualitativa mais detalhada em relação aos estudos de imuno-histoquímica, ele fornece uma quantificação menos precisas com base em isolamento celular. Apesar disso, a eficiência de nosso protocolo de isolamento de células é semelhante a outras metodologias publicadas e 9 pode ser eficientemente usado para detectar diferenças no número de células do sistema imunológico do cérebro entre o controlo e grupos MCAO ou mesmo entre grupos MCAO submetidos a diferentes tratamentos 8. As etapas críticas do presente protocolo são a dissecção dos tecidos, o procedimento de rompimento do tecido, e a remoção da mielina. Em relação à coleta de tecido, uma etapa de normalização podem ser incluídos (por pesagem do tecido coletado) para evitar a variabilidade devido a diferentes performances de dissecação. Além disso, a normalização entre diferentes grupos MCAO também pode ocorrer através do volume de enfarte (previamente determinada por R Magnéticaesonance). Outra maneira de resolver este problema é a utilização de todo o hemisfério ipsilateral de ambos os grupos isquémicos e de controlo, ou mesmo utilizar o hemisfério contralateral do rato isquémica como controlo, para minimizar o número de animais utilizados. Embora esta abordagem evita a diferenças entre cada dissecção, tem uma desvantagem principal; um factor de diluição é adicionado através do aumento do número total de células, mas não o número de células mielóides, que estão localizados exclusivamente no núcleo e peri-enfarte áreas do córtex ipsilateral. Quanto rompimento do tecido, este protocolo ilustra as etapas para a ruptura mecânica das células do cérebro, evitando tratamentos enzimáticos e prevenir superfície antígeno alteração 9,22, uma questão essencial para posterior análise qualitativa e quantitativa das subpopulações de células inflamatórias. Para além da preparação da suspensão de células de interesse, a remoção de amostras de cérebro de mielina é um passo altamente recomendado para evitar a interferência com downstaplicações resma, como a separação de células imunomagnï¿½ica ou citometria de fluxo 23,24. Isto pode ser realizado através de diferentes métodos, tais sacarose ou gradientes de Percoll, ou grânulos anti-mielina. Aqui, e com base em estudos anteriores que comparam diferentes métodos para isolamento suspensão de células do cérebro, ruptura mecânica em combinação com o uso de Percoll para remover mielina é usado para melhorar a produção e viabilidade celular 25.

Morfológicas fenotípica, e expressão do gene de alterações da microglia, bem como o extravasamento e a activação de macrófagos e neutrófilos haematogï¿½ea Acredita-se que desempenham um papel fundamental na cascata fisiopatológica após lesão cerebral 1-4. Este protocolo prevê duas abordagens para estimar o número de diferentes subpopulações de células mielóides do cérebro isquêmico e para realizar sua caracterização fenotípica. Além disso, também proporciona uma descrição de um modelo experimental de isquemia cerebral em ratos, que consiste na ligação permanente ou transitória de ambas Artéria Cerebral Média distal (ACM) e da artéria carótida comum (ACC), incluindo a forma de avaliar a enfarte pelo método Cavalieri precisa utilizando um software de estereologia. A primeira abordagem para caracterizar as subpopulações de células mielóides do cérebro isquémico é um método de estereologia com base na abordagem de fraccionamento óptico 5. Este é o maiscomumente usado sonda estereologia em ciências da vida e fornece um alto grau de precisão, com baixos coeficientes de erro 5-7. Esta é a melhor escolha para quantificação celular quando o tecido é cortado em secções, uma vez que evita o viés sobre a estimativa da célula devido à fragmentação do tecido em secções. Este método é uma forma muito poderosa para caracterizar os números, a dinâmica e as mudanças fenotípicas de subpopulações de neutrófilos infiltrados do tecido isquêmico 8. A segunda abordagem baseia-se na caracterização de um protocolo modificado a partir Campanella e colaboradores 9 que proporciona um modo simples para isolar suspensões cerebrais de leucócitos e para os caracterizar por citometria de fluxo. Em contraste com técnicas de imunohistoquímica convencionais, citometria de fluxo caracterização permite a diferenciação entre microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrado células mielóides (CD45 oi CD11b +) com base em sua diffos níveis de expressão de CD45 erent 9-13. Além disso, os monócitos pró-inflamatórias (CD45 oi CD11b + Ly-6G - Ly-6C oi), neutrófilos (CD45 oi CD11b + Ly-6G +) e outros subconjuntos de leucócitos no tecido isquémico podem ser distinguidos. Esta abordagem proporciona um ensaio rápido e fiável para avaliar neuroinflamaï¿½o em modelos de isquemia cerebral. No entanto, o processamento de tecidos podem influenciar o estado de activação e os números das diferentes populações de células presentes no tecido isquémico fornecendo uma caracterização semi-quantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Activação da microglia, bem como o extravasamento de neutrófilos e macrófagos haematogï¿½ea, acredita-se desempenhar um papel crucial na lesão cerebral após apoplexia. Estas subpopulações de células mielóides pode exibir diferentes fenótipos e funções e devem ser diferenciadas e caracterizados para estudar sua regulação e contribuição para o dano tecidual. Este protocolo prevê duas metodologias diferentes para cérebro caracterização de células imunes: uma abordagem da estereologia precisa e uma análise de citometria de fluxo. A abordagem estereologia baseia-se no método de fraccionamento da óptica, o qual calcula o número total de células em uma área de interesse (cérebro enfartado) estimada por amostragem aleatória sistemática. A segunda abordagem caracterização oferece uma maneira simples para isolar suspensões de leucócitos cérebro e caracterizá-los por citometria de fluxo, permitindo a caracterização de microglia, monócitos e neutrófilos infiltrados do tecido isquémico. Além disso, também details um modelo de isquemia cerebral em camundongos que afeta exclusivamente córtex cerebral, gerando infartos altamente reprodutíveis com uma baixa taxa de mortalidade, bem como o procedimento para o processamento cerebral histológico para caracterizar o volume de enfarte pelo método de Cavalieri.

O modelo de isquemia cerebral mostrado aqui gera enfarte observados exclusivamente no córtex sem afectar o tecido estriado uma vez que os ramos lenticulostriatal da MCA que irrigam o corpo estriado não são ocluídas (Figura 1). Por coloração de Nissl, a área danificada pode ser identificado como uma área cortical hipocrômico (Figura 2). Este modelo caracteriza-se por os volumes de enfarte altamente reprodutíveis às 24 horas após a MCAO (IH 15,89% ± 0,28) estimada pelo método de Nissl Cavalieri em secções coradas (Figura 2). A estimativa do volume enfartada pelo método Cavalieri é uma abordagem precisa com um erro de baixo que se reflecte no coeficiente de erros (CE) de Gundersen nos hemisférios contralesional e ipsilesional, bem como na área enfartada (Tabela 2). Volume de tecido danificado pode ser expressa em mm 3, mas também como% IH usando a fórmula na secção 3.2.13. Além disso, a estimativado volume total das regiões ipsilesional contralesional e permitem o cálculo do índice do edema para corrigir o volume com enfarte e para evitar uma sobreavaliação do tecido danificado (Tabela 2). Dado o processamento cortes seriados do tecido cerebral, o que pode ser aproveitado para realizar uma estimativa exacta do número total de sub-populações de células, como os neutrófilos infiltrados, na área isquémica, utilizando a abordagem Fracionador óptica (Figura 3 e Tabela 4) com os parâmetros apresentados na Tabela 3. Este protocolo prevê um número total de neutrófilos (glóbulos Ly6G-positivos) na área infartada de 23.328 ± 3.623 às 24 horas e 82.856 ± 8.143 em 48 horas em camundongos após pMCAO (Figura 3D). De acordo com estudos anteriores, a infiltração de neutrófilos está diretamente relacionada com o tamanho do infarto (Figura 3E). Estimativa de tele número de neutrófilos pelo método Fracionador óptica é uma abordagem precisa com um erro baixa que é reflectida pela CE de Gundersen (Tabela 4). O isolamento de leucócitos por citometria de fluxo e caracterização protocolo permite o isolamento de 47.922 ± 23.174 células mielóides do córtex do hemisfério ipsilesional de ratos isquémicos. Este compreende 10-30% do total de eventos encontrados na suspensão de células. A grande maioria dos eventos capturados usando esse protocolo de presente um parâmetro baixo FSC, associado a restos celulares (Figura 4). CD11b coloração mostra que as células CD11b + tem um valor maior do FSC (Figura 4), ​​sugerindo que os detritos celulares não é marcado com este marcador e, como indicado anteriormente, que podem ser excluídos de análises posteriores definindo o limite FSC em 200 9. O montante variável de restos celulares obtidos com este método sugere que as diferenças no processo de amostraing (calendário, conservação de tecidos, a temperatura da amostra, a remoção da mielina eficiente, etc.) podem ser responsáveis ​​por isso. Além disso, também é necessário o uso de filtros de células para evitar a presença de grampos celulares nas amostras; este passo tem de ser feito antes da coloração das células. Usando a estratégia de gating mostrado na Figura 5, que é baseado em CD11b e expressão de CD45, que pode discriminar entre residentes e células mielóides infiltradas no tecido isquémico. Esta população CD11b + aumentos no hemisfério isquêmico quando comparado com o ingênuo e com o grupo sham, em que estas células são geralmente associada a uma baixa expressão de CD45 indicando que microglia está proliferando após isquemia (Figura 4, Figura 5 e Tabela 5) . Esta diferença é provavelmente devido à infiltração de células a partir da periferia, como evidenciado pelo aparecimento de um CD11b CD45 + subpopulação de células oi no cérebro isquémico (Figura 4, A Figura 5 e Tabela 5) que é baixa no número ingênua e em cérebros sham. A contribuição de infiltrados para a população de células CD11b + em isquemia cerebral é um processo muito dinâmico 4. No modelo MCAO por ligadura, que pode variar de 30% a 60% do total de células CD11b +, dependendo do tamanho da lesão e do momento em que a caracterização foi feita. Os neutrófilos, caracterizadas como células Ly-6G +, são a população de células mais numerosas infiltrada encontradas em 24 horas após a MCAO no cérebro isquémico rato usando este modelo de isquemia cerebral, uma vez que compreendem a 70-80% do CD11b CD45 + oi. O restante das células são na sua maioria uma subpopulação de CD11b CD45 + hi Ly-6G - Ly-6C hi monócitos pró-inflamatórias. Neste modelo, a população vai aumentar em número em áreas cerebrais isquémicos de 24 a 48 horas após a MCAO. Figura 1:. O procedimento cirúrgico para a ligadura MCA (A) Após a retracção do músculo temporal, uma pequena craniotomia é realizada no crânio do rato. MCA é ligado por um nó ou um nó corrediço usando uma sutura 9/0. (B) Imagens representativas da lesão cortical gerado pelo modelo MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação do volume de infarto por Cavalieri. (A) Imagens representativas de secções de cérebro coradas Nissl-24 h após a ligadura permanente da MCA. A alta ampliação mostra a área hipocromatic após coloração Nissl queidentifica a área danificada (núcleo) após MCAO. O (PI) região peri-enfarte também é mostrada. (B) Quantificação do volume de enfarte representado como% Hemisfério enfarte (% IH), utilizando o método Cavalieri, em secções coradas Nissl-série, 24 horas após a MCAO (n = 50 murganhos ). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Figura 3: Estereológica quantificação de neutrófilos na área enfartada 24 e 48 horas após a ligação, utilizando o método Fracionador óptica. (A) Imagem representativa de neutrófilos infiltrados (células Ly6G-positivos) na área isquêmica em 24 horas após MCAO. Delimitação mostra a área enfartada. (B, C) ​​Exemplos de um dissector óptico para quantificação de neutrófilos pelo fraccionador óptico. (D) Quantificação de neutrófilos totais da região enfartada em 24 e 48 h (n = 4 ratos). (E)A correlação entre o número de neutrófilos com o tamanho do infarto em 24 e 48 horas após a ligadura MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Figura 4:. Análise dot-gráfico de dispersão representativas de leucócitos cerebrais obtidos a partir de hemisférios naïve, sham e isquémica (24 horas após a MCAO) sobre a base de parâmetros físicos (SSC e FSC) Uma população de eventos que expressam CD11b (vermelho) foi identificado em todos os grupos. Essa população foi fechado e caracterizados de acordo com a expressão de CD45. As células que expressam níveis baixos de CD45 (verde) estavam presentes no córtex isquémico e não-isquémica cerebral e correspondeu às células microgliais. Em contraste, as células que expressam níveis elevados de CD45 (amarelo) foram apenasencontrada no hemisfério isquêmica e em menor grau no grupo sham. Uma análise mais aprofundada da população oi CD11b + CD45 indica que os neutrófilos (Ly-6G + células, azul) e pró-inflamatórios monócitos (células Ly-6C hi, laranja) são os principais subpopulações de células encontradas no cérebro infiltra 24 horas após o AVC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Figura 5:. Gating estratégias para diferenciar residente de células mielóides infiltradas no tecido isquémico CD11b + células foram primeiro fechado de acordo com a intensidade de fluorescência do isotipo (O). Um gráfico representativo do ponto de suspensões de células do cérebro isquémico é mostrado no canto superior direito do painel. EmAdicionalmente, os valores típicos para o número total de eventos e para o número de CD11b + fenómenos adquiridos usando esta técnica é mostrado (não de células / hemisfério cerebral isquémica;. (A) análise de intensidade de fluorescência de CD45 das células CD11b + é mostrada no painel B. A análise de gráfico representativo do ponto de CD45 e CD11b expressão do CD11b + subpopulação fechado é mostrado no canto superior direito do painel. Além disso, o número típico de células CD45 hi lo CD45 adquiridos por hemisfério cerebral isquêmico usando esta técnica é mostrado (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parâmetros utilizados para o método de Cavalieri </td></tr><tr><td> Seção de espessura (t) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Fração de amostragem Slice (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Distância entre as seções </td><td> 600 pm </td></tr><tr><td> Espaço da Grelha </td><td> 100 pm </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Parâmetros utilizados para a quantificação da estereologia do tecido enfartado. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Resultados </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarto </td></tr><tr><td> Área (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> Volume (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Volume Corrigido para Ao longo da projeção (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), alfa (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Hemisfério Infarto </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Cérebro Edema (Ips Vol / Vol Cont) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Exemplos representativos de volumes contralesional, ipsilesional e infarto pelo método de Cavalieri usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colde span = &quot;2&quot;&gt; parâmetros usados ​​para o fraccionamento da Optical </td></tr><tr><td> Seção Espessura (TSF) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fração de amostragem Slice (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Contando Quadro Altura </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Contando Largura do quadro </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Tamanho da grade X </td><td> 230 pm </td></tr><tr><td> Tamanho da grade X </td><td> 230 pm </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 pm </td></tr><tr><td> Optical Disector Altura </td><td> 14 mm </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Parâmetros utilizados para a quantificação estereológica de neutrófilos infiltrados após isquemia cerebral com a sonda de fraccionamento da óptica usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Estimativa de neutrófilos pelo Fracionador óptica </td></tr><tr><td> Número de locais de amostragem </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Forma Fator </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Total de marcadores Contado </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Os neutrófilos estimadas por Fracionador Optical </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,09 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Exemplo representativo dos neutrófilos infiltrados estimado após isquemia cerebral com a sonda Fracionador óptica usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Os neutrófilos </td><td> Os monócitos </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> Ingénuo </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1.523 </td></tr><tr><td> Sham 24 hr </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1.124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 hr </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4,826 ± 1,345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Resultados representativos das células mielóides estimados após a isquemia cerebral com a abordagem por citometria de fluxo.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K visualizações.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico. 

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The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Medicina

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Permanente oclusão vascular cerebral<em&gt; Via</em&gt; Dupla ligadura e transecção

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realizando Permanente Distal Oriente cerebral com carótida comum Oclusão da Artéria em ratos idosos para estudar Cortical Isquemia com Deficiência Sustentada

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.