Name: highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
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The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

NOTA: É crítico para manter condições isentas de RNase durante todo o procedimento. 1. adenilação de 3 &#39;Linker <ol><li> Diluir oligonucleótido de ADN concebidos para reacções 3 &#39;de ligação para 100 uM em meio livre de nuclease de H 2 O. NOTA: O oligonucleótido deve ter um &#39;grupo fosfato, um dinucleótido randomizados no terminal 5&#39; 5 fim, e um &quot;3 didesoxicitosina. A 5 &#39;grupo fosfato é um requisito da enzima Mth para eficiente 5&#39; 10 adenilação. O fosfato pode ser adicionado ao pré-tratamento do oligonucleótido com um polinucleótido-quinase, ou encomendado com a modificação directa. O dinucleótido randomizado na extremidade 5 &#39;é importante para minimizar a preferência ligases de ARN que exibem determinados para-extremidade final juntando reacções sobre os outros seis sequência. A 3 &#39;didesoxicitosina coloca um elemento de bloqueio na extremidade 3&#39; do oligonucleótido to inibir a formação de concatâmeros ligante-ligante durante os passos de ligação subsequentes e também serve para bloquear &#39;extremidade da molécula de miARN-Ligante formada na extremidade de 3&#39; da reacção de ligação 3 11. A sequência de oligonucleótido ligante escolhido para o método de miR-Seq imparcial é como se segue: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montar o seguinte reacção adenilação: 200 pmol 3 &#39;oligonucleótido ligante, 4 ul 10x 5&#39; tampão de adenilação de ADN, ATP 1 mM de 4 ul, 4 ul de RNA-ligase Mth, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 40 ul. </li><li> Incubar reacção a 65 ° C durante 1 hora. Terminar a reacção por aquecimento a 85 ° C durante 5 min. </li><li> Precipitar ligante adenilada pela adição de 2,5 volumes de etanol a 100% e 1/3 volume de 10 M de acetato de amónio para remover o ATP residual e para evitar imprevistos em ligaduras reacções futuras. <ol><li> Resumidamente, misture o alcohol, sal, oligo e solução até à homogeneidade, girando à velocidade máxima numa microcentrífuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C durante 20 min. Lavou-se a pelota em etanol a 70%, ar seco, e ressuspender em um volume apropriado de livre de nuclease H 2 O para dar 50-100 uM de oligo adenilada. </li></ol></li><li> Confirme adenilação executando um gel de poliacrilamida 18%. <ol><li> Prepare o gel por mistura do seguinte em conjunto: 6,3 g de ureia, 6,75 ml de 40% de acrilamida, e 1,5 ml de 10x TBE. Adicionar H2O a 15 ml. </li><li> Misturar até que a ureia é completamente dissolvido e adicionar 150 ul 10% (w / v) de persulfato de amónio (APS) e 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Depois gel definiu, pré-corrida por 30 minutos a 24 V / cm de largura com gel TBE 1x tampão de corrida à temperatura ambiente. Depois de 30 minutos é de até poços lave com tampão de corrida. </li><li> Misturar 5 pmol de oligonucleótidos adenilada e com igual volume de tampão de carga desnaturante ARN 2x (95% (v / v) de formamida,0,02% (w / v) de SDS, 0,02% de azul de bromofenol (w / v), 0,01% (w / v), xileno cianol, EDTA 1,0 mM), o calor rapidamente para 75 ° C, e SNAP arrefecida em gelo. Dispensar amostra inteira dentro do poço do gel. Também incluem uma quantidade idêntica de controle não-adenilada e baixos padrões de tamanho peso molecular. </li><li> Submeter o gel a 24 V / cm até o azul de bromofenol é ¾ do caminho para o fundo do gel. Desmonte aparelho, gel pós-mancha com uma solução de SYBR-gold 1x em 1x TBE e visualizar na caixa UV-transilluminator (Figura 2). NOTA: Gel purificar o oligo adenilada de um modo semelhante ao descrito acima, se &quot;nenhum ARN de entrada&quot; controles estão resultando numa elevada quantidade de produto de PCR, em comparação com amostras com níveis de ARN de entrada. </li></ol></li></ol> 2. Ligador Ligadura para 3 &#39;Fim da miARN <ol><li> 3 &#39;Ligadura <ol><li> Montar os seguintes componentes em gelo, na ordem indicada: 1,0 ul de 50% (w / v) de PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x tampão de ligase de RNA (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenilada 3 &#39;Ligante (100 uM), 0,5 ul de inibidor de RNase, 0,5-8,0 ug de RNA total, 0,5 ul de RNA-ligase de T4 2, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 5 mL. </li><li> Misturar por pipetagem a reacção como a solução é demasiado viscoso para vórtice, devido à alta concentração de PEG 8000. Uma vez cuidadosamente misturado, coloque a reacção num termociclador com uma tampa aquecida. Definir o bloco a 16 ° C, e incubar durante 4 horas. NOTA: A reacção pode ser dimensionado para um volume final de 20 ul, sem qualquer perda na eficiência da ligação. Reagir durante 4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, para se obter eficiências de ligação essencialmente idênticos. </li></ol></li><li> Gel Purificação <ol><li> Após 3 &#39;ligadura, misturar a mistura reaccional com um volume igual de 2x tampão de carga de ARN. Aquece-se a 70 ° C durante 5 min, e encaixe fria em gelo. </li&gt; <li> Correr a amostra num gel de poliacrilamida a 15% para a purificação PAGE. <ol><li> Prepare-se um gel de poliacrilamida a 15% contendo ureia 7 M, de um modo semelhante ao descrito anteriormente no passo 1.5. </li><li> Pré-correr o gel a 24 V / cm de largura do gel para, pelo menos, 30 min. Desligue a alimentação, lavar poços, amostra de carga e gel corrida em mesma tensão como pré-corrida. </li><li> Coloque a amostra e execute a página até o azul de bromofenol acaba de sair o gel. O produto desejado migrará perto do cianol xileno. </li></ol></li></ol></li><li> Coloração, visualização e Excisão <ol><li> Desmonte aparelho de gel e coloque gel na bandeja limpa com 1x tampão de corrida (TBE), 1x SYBR-ouro e pedra para 15 min. </li><li> Retire o gel da coloração prato e visualizar na caixa transiluminador UV coberta com filme plástico limpo. O produto de ligação deve ser cerca de 45 nucleótidos de comprimento. </li><li> Impostos especiais de consumo da região que contém o produto da ligação com uma razo limpor lâmina e coloque em 0,5 ml tubo micro-centrífuga. </li></ol></li><li> Isolamento produto e precipitação <ol><li> Pierce fundo do tubo 0,5 ml de microcentrífuga com uma agulha de 30 G e colocar o tubo perfurado em um segundo limpo, baixa retenção, 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 5 min a 15.000 x g ~. </li><li> Visualmente confirmar que toda a fatia de gel foi movido através do furo no tubo interior. Se necessário, use uma ponta de pipeta limpa para empurrar alguns fragmentos de gel mais perto do buraco. </li><li> Descartar o tubo vazio de 0,5 ml e adicionar 400 ul de tampão de coluna de alto teor salino (HSCB NaCl 400 mM, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, SDS a 0,1%) para a pasta de acrilamida. Tubo (s) de rocha, a 4 ° C durante a noite. </li><li> Transferência de lodo a uma coluna de rotação de acetato de celulose de 0,22 micron, com uma pipeta de ponta de todo o furo. Centrifugar durante 3 minutos à temperatura ambiente em ~ 15.000 xg para recolher todo o líquido para longe da matriz de gel de acrilamida. </li><li> Transferir o líquido para um, de baixa retenção limpo, tubo de 1,5 ml contering 1 ml de 20 mg / ml de glicogênio. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Misturar a solução por inversão do tubo várias vezes e precipitar no freezer -80 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a plena velocidade a 4 ° C durante 20 min para sedimentar o ácido nucleico. Remover o sobrenadante e lava-se em etanol a 70%. Ar sedimento seco durante 10 min à temperatura ambiente e seguir directamente a 5 &#39;passo de ligação. </li></ol></li></ol> 3. Ligador Ligadura para 5 &#39;Fim da miARN-3&#39; Ligador híbrido <ol><li> Para o ácido nucleico sedimentadas, adicionar os seguintes componentes: 2 uL de PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul de RNA-ligase 10x Tampão, 0,5 ul de ATP (10 mM), 0,5 ul de RNA-NN oligo (100 uM), e H 2 O para um volume final de 4 mL. NOTA: A composição do &#39;oligo NN-ARN &quot;é como se segue 5&#39;-didesoxi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 invertido&#39; e foi purificado por HPLC pelo fabricante. </li><li> Misturaresta amostra por pipetagem cima e para baixo repetidamente. Fazer isso há algum tempo (até 5 minutos), para assegurar que o sedimento foi completamente re-solubilizado. Se a re-solubilização é problemático, aquecer a amostra brevemente (3-5 min) a 37 ° C e retomar pipetagem para misturar. </li><li> Uma vez que o sedimento é de volta em solução, transferir o conteúdo para um tubo limpo de PCR contendo 1 ml de uma mistura 1: 1 de inibidor de RNase e T4 RNA ligase 1 (5 unidades). Novamente misture por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Incubar a reacção num termociclador a 37 ° C durante 4 h. Prosseguir imediatamente para a síntese de cDNA. </li></ol> 4. Transcrição Reversa / cDNA Synthesis <ol><li> Adicionar os seguintes componentes para a 5 &#39;da reacção de ligação: 2 ul de tampão 5x RT, 0,75 ul de DTT 100 mM, 1 ul Iniciador RT Ilumina-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA 5&#39;-3&#39; (1 uM), e 0,5 ul de dNTPs (10 mM). </li><li> Misturar por pipetagem e aquecer a 65 ° C durante 5 min. Em seguida, resfriar lentamente no banco top. </li><li> Depois da reacção ter arrefecido até à temperatura ambiente, coloque o tubo em gelo e adicionar 0,5 ul de cada enzima transcriptase inversa e um inibidor de RNase. Misturar por pipetagem, e colocados no termociclador para o passo de extensão indicado nas instruções do fabricante. </li><li> Uma vez completa suplemento de 5 ul livre de nuclease H2O para levar o volume final da biblioteca de cDNA até 15 ul. </li></ol> 5. Preparação Biblioteca <ol><li> Para a indexação de PCR, montar a seguinte reacção em gelo: 6 ul de 5x Tampão Phusion, 1 ul de dNTPs (10 mM), 0,9 ul de DMSO, 0,75 ul 5 &#39;iniciador (25? M), 0,75 ul iniciador 3&#39; (25? M), biblioteca de cDNA de 3 ul (concentração variável, dependendo da quantidade de entrada), 0,5 ul Phusion polimerase (1 unidade), isento de nuclease de H 2 O para um volume final de 30 ul. Escolha as seqüências de primers para garantir a compatibilidade com o modelo ea plataforma de sequenciamento deescolha. <ol><li> Executar a reacção de PCR com as seguintes definições: desnaturação inicial a 98 ° C durante 3 minutos, durante os primeiros 4 ciclos, desnaturar a 98 ° C durante 15 seg, recozimento a 50 ° C durante 15 seg, estender a 72 ° C durante 15 seg . NOTA: Dependendo da quantidade de material de entrada, variar o total de números de ciclos de PCR. Tipicamente, para uma entrada de 1-2 ug de RNA total, 13 ciclos de PCR no total são suficientes para gerar a biblioteca de miR-Seq. </li><li> Realizar os ciclos subsequentes, por exemplo, ciclos de 5-12, de um modo em duas etapas, onde os ciclos de recozimento e de extensão são combinados e realizados a 70 ° C durante 30 seg e desnaturação é novamente 98 ° C durante 15 seg. NOTA: O volume de reacção é de 30 uL para permitir a pausa do programa de PCR e remover uma alíquota de 10 ul em números de ciclos pré-determinados para monitorizar a aparência do produto desejado. Tipicamente, os ciclos de 10, 13, e 16 são escolhidos para o teste a partir de uma amostra de ARN total. </li></ol></li><li> Preparara 8% não desnaturante em gel de acrilamida por mistura de 2 ml de 40% de acrilamida, 1 ml de 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Em seguida, adicione 100 ml de 10% de APS e 10 ml de TEMED. Despeje gel e deixe set. <ol><li> Pré-correr o gel a 12 V / cm de largura de gel durante 30 min. Poços flush. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de 10x (15% de Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) de SDS, 0,01% (w / v) de azul de bromofenol), adicionar 10 ul de amostra a cada poço de dimensões 5 milímetros x 1 mm x 15 milímetros. Normalmente, cada poço pode carregar até 30 l de amostras. Executar o gel de amostra a 10 V / cm de largura de gel em tampão 1 x TBE até que o corante azul de bromofenol apenas corre para fora do fundo do gel. </li><li> Mancha e visualizar gel como descrito no passo 2.3. </li><li> Excisar o par de banda de base 146 e elui-se durante a noite em 0,25 mL de HSCB de uma forma similar ao que é descrito na secção 2.4. Precipitar o DNA num volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Lavar o granulado em 70% eThanol e ressuspender em tampão TE. </li><li> Quantificar a biblioteca usando PicoGreen de acordo com as recomendações do fabricante. </li></ol></li></ol>

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	<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).</li><li>Consortium, T. E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs.">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

A metodologia aqui descrita faz uso de diversas variáveis-chave para maximizar a eficiência de ligação, ou seja, altas concentrações de PEG, o uso de ligantes randomizados, e alta concentração de ligantes 2,6,9. Esta abordagem permite que bibliotecas de sequenciamento de forma confiável quantitativos a partir de amostras de RNA total de 2. Nós conduzimos várias titulações de ARN de entrada e concluíram que a metodologia anterior é o mais adequado para quantidades de ARN total na gama...

Metodologias baseadas em alta capacidade de sequenciamento têm sido amplamente aplicada em muitas amostras biológicas nos últimos anos em expandir muito a nossa compreensão da complexidade molecular de sistemas biológicos 3,4. No entanto, a preparação de amostras de RNA de high-throughput seqüenciamento muitas vezes transmite preconceitos específicos inerentes à metodologia empregada, o que limita a utilidade potencial destas técnicas poderosas. Estes método específico polarizações ter sido bem documentado para preparações de biblioteca, de pequena ligadura de ARN baseado em 1,2,5,6. Estes preconceitos resultar em variação mil vezes na lê números de miRNAs sintéticos equimolares, fazendo inferência de abundância miRNA a partir de dados de sequenciamento descontroladamente variável e sujeito a erros. Os estudos focam as propriedades de ligases T4 RNA derivadas de fagos têm documentado que as enzimas exibem preferências à base de nucleótidos 7, que se manifestam como bibliotecas enviesados ​​em experiências de sequenciação de alto rendimento <saté&gt; 1,2,8. A fim de minimizar os preconceitos transmitidos por ligases RNA, várias estratégias têm sido empregadas; macromolecular aglomerando 9, randomizando a sequência de nucleótidos do adaptador que é proximal em relação ao local de ligação 6, e empregando concentrações elevadas de adaptador de ligação 2. Através de uma combinação destes três abordagens temos desenvolvido um fluxo de trabalho para a preparação isenta de bibliotecas de ARN pequenas compatíveis para a sequenciação de alto rendimento (Figura 1). Para comparações diretas entre os protocolos atuais e nosso método otimizado, por favor consulte o nosso recente relatório 2. Este método produz optimizado eficiências de ligação de mais de 95% em ambas as 3 &#39;e 5&#39; etapas e permite a ligação isenta de moléculas de ARN a partir de pequenas amostras biológicas sintéticas e 2.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

Mirna clonagem e sequenciamento de alto rendimento, denominada miR-Seq, assume-se como uma abordagem ampla transcriptoma quantificar miRNAs com resolução de nucleotídeo único. Esta técnica de captura miARNs, anexando os adaptadores 3 &#39;e 5&#39; de oligonucleótidos para moléculas de miARN e permite a descoberta de novo miARN. Acoplamento com plataformas de sequenciamento de próxima geração poderosos, miR-Seq tem sido fundamental para o estudo da biologia miRNA. Contudo, desvios significativos introduzidas por passos de ligação de oligonucleótidos têm impedido o miR-SEQ de ser empregado como uma ferramenta de quantificação precisa. Os estudos anteriores demonstram que polarizações em métodos de miR-Seq actuais conduzem frequentemente a quantificação imprecisa miARN com erros de até 1.000 vezes superior para algumas miARNs 1,2. Para resolver estes preconceitos, transmitidas por meio de ligação de ARN, temos desenvolvido um método de ligação de ARN pequenas que resulta em eficiências de ligação de mais de 95% tanto para 3 &#39;e 5&#39; etapas de ligação. O benchmarking este improvou método de construção da biblioteca utilizando miARNs equimolares sintéticos ou mistos diferencialmente, produz consistentemente lê números com desvio inferior a duas vezes a partir do valor esperado. Além disso, essa alta eficiência método miR-Seq permite preciso de todo o genoma miRNA perfil de in vivo total de amostras de RNA 2.

Os resultados esperados para o método anterior deve, inicialmente, ser observação de uma única troca de nucleótidos (aumento) no tamanho do oligonucleótido de ADN que foi sujeita a adenilação por Mth RNA ligase (Figura 2). Após 3 &#39;ligadura, a visualização do gel de acrilamida indica (ver Figura 3) bandas de peso molecular elevado afiadas evidentes na região de nucleótidos 100-300 do gel. Isto indica que a amostra de ARN total a ser utilizado é de alta qualidad...

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

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Biology

11.8K visualizações.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

Vídeo: Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Bioquímica

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Bioengenharia

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Genética

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Analisando a dinâmica do tRNA usando AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autor em destaque: Papel do AQRNA-seq no mapeamento de pequenos RNAs e desvendamento de mecanismos de tradução de proteínas

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicina

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

Resumo

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O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos