These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Declaração de Ética: tecidos e amostras de plasma humanos identificados-De foram obtidos a partir Hendrick Medical Center sob um Comitê de Ética aprovou o protocolo. 1. Adição de anticorpo biotinilado NOTA: O monitoramento desse passo é opcional. Veja protocolo alternativo se não monitoramento. <ol><li> Obter derivativos placas revestidas com avidina comercialmente disponíveis (ver Materiais e Equipamentos Tabela). </li><li> Adicionar 50 ul de fosfato tamponado salino (PBS) pH 7,2 aos poços. NOTA: PBS pré-incubar a 28 ° C para minimizar as mudanças de temperatura de ressonância relacionados. </li><li> Abra o software do scanner bioassay e siga o assistente de configuração para definir o procedimento experimental que inclui seleção de espaços em branco, padrões e amostras no layout da placa, ajuste de temperatura (28 ° C), o número de leituras por min (1), e comprimento de experiência ( 150 min para acomodar para as etapas de preparação). </li&gt; <li> Insira a placa de ensaio preparado no scanner bioassay livre rótulo e iniciar a primeira verificação. Quando a primeira verificação for concluída, selecione &quot;auto de referência para começar&quot;. A linha de base é o conjunto inicial de varreduras recolhidos no início da experiência. Se esta for a primeira leitura realizada nesta placa específica, permitem que o scanner para executar a equilibrar temperatura e eliminar a deriva da linha de base. Veja a Figura 2 para um screenshot de uma linha de base, seguido pela adição de amostra. </li><li> Depois da linha de base se estabilizou, ou, pelo menos, 5 scans, pausar a leitura e ejetar a placa. </li><li> Remover PBS despejando na pia e adicionar 50 ul de anticorpo biotinilado na RL21A [10 ug / ml em PBS pH 7.2], mas a todos os poços de controlo na placa. Adicionar 50 ul de PBS aos poços de controlo. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura até a saturação é atingido, aproximadamente, 1,5 horas. </li><li> Pausa de leitura e ejetar a placa. </li><li> Lava-se a<html> a placa 3 vezes com 200 ul / poço de solução salina tamponada com fosfato + 0,05% Tween 20 (PBST), seguido por 3 lavagens com 200 ul / poço de PBS pH 7,2. Repita com PBS. Toque o excesso de PBS de placa em papel toalha antes de passar para a próxima etapa. NOTA: Este passo pode ser realizado em um lavador de placas automático ou lavar a placa 3 vezes com 200 uL de PBST por operações de imersão líquido para uma pia e substituindo PBST com uma pipeta. </li><li> Adicionar 50 ul de PBS, pH 7,2 a todos os poços activas. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura para monitorar ressonância pós-lavagem. </li><li> Pare a leitura e ejetar a placa. </li></ol> Protocolo alternativo para o Passo 1: <ol start="13"><li> Adicionar 50 ul de anticorpo biotinilado na RL21A [10 ug / ml de PBS] a todos os poços. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1,5 horas ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com 200 ul / poço de PBST seguido por 3 lavagens com 200 ul / poço de PBS como no passo 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. A adição de analito <ol><li> Remover o PBS e adicionar 50 ul por poço de tampão de ensaio apropriada. Para este ensaio, disponível comercialmente de soro humano normal foi utilizado diluído 1:20 em PBS. </li><li> Abra o software do scanner bioassay e siga o Assistente de Configuração para definir procedimento experimental. </li><li> Insira a placa no scanner bioassay e começar uma linha de base ler. Se esta é a primeira leitura realizada nesta placa específica, deixar o scanner prazo para equilibrar a temperatura e eliminar deriva na linha de base. </li><li> Depois da linha de base se estabilizou, ou, pelo menos, 5 scans, pausar a leitura e ejetar a placa. </li><li> Remover o tampão de ensaio a partir dos poços. </li><li> Pico controlos com HLA A * 02: 01 monómero tendo relevante (FLSL) ou (SLLV, YLEV, ou péptidos irrelevantes KVL) em concentrações variando de [0,625-10 jig / ml] em tampão de ensaio. Adicionar 50 ul de padrões para os poços da placa de controle </li><li> Adicionar 50 ul de analito em tampão de ensaio para a amostrapoços da placa. Para este ensaio, cravado soro humano disponível comercialmente foi usado. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura até a saturação é atingido, aproximadamente 30-60 min. </li><li> Pausa de leitura e ejetar a placa. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com 200 ul / poço de PBST seguido por 3 lavagens com 200 ul / poço de PBS como no passo 1.9. </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de ensaio a todos os poços activas. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura para monitorar ressonância pós-lavagem. </li><li> Pare a leitura e ejetar a placa. NOTA: O tampão de ensaio poderia ser PBS, meios de cultura de tecidos, ou soro humano diluído a 1:20 em PBS, dependendo do objetivo do ensaio. </li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> Analisar o uso do software do scanner bioassay ou exportar arquivos de dados brutos para software de análise estatística preferido. O software do scanner bioassay gera automaticamente a curva de ligação com base nolayout da placa fornecida durante a configuração experimental. NOTA: Se não estiver usando o software do scanner bioassay para análise, siga os passos de 3,2-3,4. </li><li> Subtraia a linha de base e controle negativo de cada ponto de dados subseqüente. </li><li> Calcula-se a média e desvio padrão para poços em replicado em cada ponto de tempo. </li><li> Gerar um gráfico da curva de ligação ou selecione dados finais para gráficos de barras. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Os autores, Debra Wawro Weidanz e Robert Magnusson, são, respectivamente, Diretor Presidente e Diretor de Tecnologia da Resonant Sensores Incorporated, que produz o leitor e ensaio placa placas bioassay utilizados neste artigo.

O método aqui descrito apresenta um sistema de rastreio para o diagnóstico de cancro biomarcador que permitem a rápida detecção de complexos de péptido / HLA solúveis em soro, plasma, urina ou saliva amostras de pacientes em um alto rendimento de formato de 96 ou de 384 poços. Este sistema de ensaio utilizando o receptor de células T imitando anticorpos monoclonais e de um sistema de detecção livre de etiqueta reduz o tempo de análise para menos de 1 h em comparação com 3,5 h por ELISA convencional. Esta abordagem de alto rendimento permite estratificação rápida de pacientes para ensaios clínicos de vacinas contra o câncer terapêuticos ou biofármacos. Os métodos actuais para a detecção de alvos destas doenças requerem purificação por afinidade e HPLC-MS / MS de amostras de doentes individuais, um processo que consome tempo e complicado. Embora este método é susceptível de técnicas de ELISA convencionais, existe a preocupação de que os reagentes de detecção secundárias, tais como o anticorpo anti-microglobulina β2 poderia alterar a estrutura da HL nascenteUma molécula e inibem a ligação para a detecção de limitação TCRm. Detecção de livre-Label alivia essas preocupações. Este procedimento pode ser modificado para ser utilizado em outros sistemas sem etiqueta, tal como um sistema de ressonância de plasmon de superfície. No entanto, isso iria reduzir consideravelmente a capacidade de rendimento mais elevados em comparação com o sistema de bioensaio usado neste estudo. Este protocolo pode ser modificado de forma eficaz para a detecção de marcadores não-HLA no soro e no plasma de pacientes com aderência aos poucos passos críticos. A monitorização do processo de revestimento inicial anticorpo é recomendado para a optimização da superfície, como um &lt;200 pm mudança irá provavelmente resultar em baixo do sinal para a etapa de detecção subsequente. A linha de base e pós-lavagem leituras são úteis para a análise de ponto final como a abundância de proteínas séricas podem mascarar a ligação de baixa concentração de analito. Finalmente, a variação da temperatura de amostras pode resultar na variação de poço a poço. Recomenda-se que todas as amostras de ser pré-incubada umad o biosassay livre controlador de temperatura unidade rótulo fixado em 2-3 ° C acima da temperatura ambiente. As amostras refrigeradas deve dispor de tempo suficiente para alcançar a temperatura de funcionamento. Modificações futuras deste protocolo incluirá multiplexação de TCRm na superfície da placa. O sistema de bioensaio é actualmente passível de manchas de poços a uma densidade de, pelo menos, 8-Plex. Com a introdução de 4-8 TCRm a cada poço, por volumes de amostra de teste são reduzidos e permitir a recolha de dados cada vez mais complexos por paciente. Esta capacidade poderia informar mais pacientes no que diz respeito às opções terapêuticas.

Os antigénios de classe I de Leucócitos Humanos (HLA) Amostras péptidos de 8-11 aminoácidos de comprimento, derivadas da degradação proteossómica do repertório de proteínas intracelulares e apresenta estes péptidos na superfície de todas as células nucleadas 1,2. O complexo HLA é &quot;biomarcador da natureza&quot;, indicando a saúde de cada célula (Figura 1) para circulação de linfócitos T citotóxicos (CTL). Reconhecimento da doença associada peptídeos resulta em eliminação da célula incriminada por CTL. Assim, a resposta imune adaptativa é altamente eficaz na eliminação de infecções virais e tumores. No entanto, o sistema imunitário exerce uma pressão que muitas vezes promove a selecção de vírus ou tumorais capazes de evadir uma resposta de CTL eficaz. Receptor de células T (imitando TCRm) anticorpos monoclonais (mAbs) que reconhecem específico peptídeo / HLA-A * 02: 01 complexos, tais como aqueles derivados a partir de proteínas associadas com cancro da mama, factor de inibição de migração de macrófagos (MIF19-27) 3 e NY-ESO-1 157-165, permitir a detecção e destruição de células de câncer de mama, na ausência de um anti-tumor eficaz CTL de resposta 4,5. Este trabalho representativo é focado sobre a HLA-A * 0201, que é expressa em cerca de 30% da população. No entanto, a identificação de outros complexos de HLA / péptido relevantes, seguida pela produção de TCRm permite o desenvolvimento de imunoterapias para o diagnóstico de doenças visadas e companheiro, expandir a utilidade do presente trabalho para uma população muito mais ampla. Uma parte dos complexos de péptido / HLA ligados para a superfície da célula é libertado para o plasma. Devido à natureza altamente complexo de peptídeos / piscinas HLA, métodos atuais para a mineração do immunopeptidome de biomarcadores HLA associados são demorados. Este processo requer a purificação por afinidade de HLA solúvel a partir de plasma, a separação de péptidos HLA associados por meio de cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa(RP-HPLC) e sequenciação de péptidos por espectrometria de massa em tandem (MS / MS) 6,7. Embora este processo é uma opção viável para a descoberta de novos alvos terapêuticos, é um processo complicado, como uma ferramenta de diagnóstico companheiro para metas associadas HLA já na vacina terapêutica ou gasoduto biofarmacêutica 8-10. TCRm dirigidos contra estes objectivos fornecer as ferramentas para o desenvolvimento de diagnóstico rápido companheiro destinadas a estratificar pacientes em ensaios clínicos relevantes e fornecer opções terapêuticas mais informadas. Neste trabalho, um sistema de triagem descoberta de biomarcadores para o diagnóstico de câncer é apresentada, que utiliza TCRm e um sistema de bioensaio livre-label que monitora interações biológicas com passos mínimos de processamento. O sistema de bioensaio livre de marcador baseia-se um método, que utiliza o efeito de modo guiado de ressonância (GMR) que ocorre em grelhas de guias de onda dieléctricas 11-14. Quando os contatos de luz de banda larga a difracçãoralar nas placas necessárias para este sistema, dois comprimentos de onda específicos são reflectidas. A interacção da ligação entre um receptor e o seu ligando imobilizado é monitorado em tempo real, seguindo o deslocamento do comprimento de onda de ressonância com um analisador de espectro 12. Picos de ressonância separadas para ocorrer incidente TE (vector eléctrico normal ao plano de incidência) e TM (vector magnético normal ao plano de incidência) estados de polarização que fornecem vários pontos de dados que pode potencialmente aumentar a precisão da detecção 11,14. Usando placas de anticorpo pré-sensibilizados neste sistema de ensaio livre de marcador, o tempo de execução de ensaio com a análise de dados é de aproximadamente 45 min. Além disso, múltiplas amostras pode ser interrogada em um formato de 96 ou de 384 poços, uma clara vantagem sobre um formato baseado em HPLC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

De acordo com a American Cancer Society, mais de 200.000 mulheres serão diagnosticadas com câncer de mama invasivo em cada ano e aproximadamente 40.000 morrerão da doença. A classe I amostras de antigénio de leucócitos humanos (HLA) de péptidos derivados de degradação proteossómica de proteínas celulares e apresenta estes fragmentos na superfície celular para serem interrogados pelo circulantes linfócitos T citotóxicos (CTL). Geração de imitador do receptor de células T (TCRm) anticorpos monoclonais (mAbs) que reconhecem o cancro da mama específico peptídeo / HLA-A * 02: 01 complexos, tais como aqueles derivados de factor de inibição de migração de macrófagos (MIF 19-27) e NY-eso 1 157-165 permitir a detecção e destruição de células de câncer de mama, na ausência de uma resposta eficaz CTL anti-tumor. Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células de câncer de mama e representam biomarcadores de câncer potencialmente relevantes. Neste trabalho, um sistema de triagem avanço biomarcador para o diagnóstico de câncers incorporando receptor de células T anticorpos monoclonais imitam combinados com um romance, livre de marcador de biossensor utilizando ressonância de modo guiado (GMR) tecnologia de sensor é apresentado. Detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada. O impacto deste trabalho poderia revolucionar a medicina personalizada através do desenvolvimento de diagnósticos de doenças de companhia para immunotherapies alvejados.

Um conjunto representativo de experiências foi realizada utilizando o bem caracterizado TCRm, RL21A, um anticorpo IgG2a monoclonal murino que reconhece especificamente um péptido (MIF ou FLSL 19-27) dentro do contexto de HLA-A * 02: 01 3 molécula. O monómero de péptido / HLA cognato, bem como irrelevante HLA monómero 15, foi usado para demonstrar o procedimento descrito. A Figura 3 ilustra o formato de ensaio. RL21A é específico para o monómero FLSL / HLA, com pouca reactividade cruzada com o outro péptido / HLA 3 complexos. Esta especificidade, se condensa com o sistema de bioensaio livre de marcador (Figura 4). A sensibilidade do sistema de bioensaio livre etiqueta para esta experiência é na gama nanomolar baixa, tal como determinado por titulação do anticorpo RL21A em FLSL imobilizado / monómero de HLA (Figura 5). Embora o sinal de fundo é aumentada de forma significativa em amostras de soro, sPecific detecção de monómero FLSL / HLA no soro humano cravado é alcançado na Figura 6 e um gradiente de concentração é facilmente discernível nestas amostras. Finalmente, os sobrenadantes de linha celular MDA-MB-231, previamente demonstrado que apresentam o FLSL / HLA-A * 02: 01 molécula, são mostrados para conter monómero solúvel FLSL usando esta plataforma de ensaio isento de etiqueta (Figura 7). A subsequente adição de monómero FLSL / HLA aumenta o sinal em RL21A (Figura 7). Devido à sensibilidade do sistema, bem à variação bem incluindo deslocamentos de ressonância negativos podem ocorrer como resultado das flutuações de temperatura como pode ser visto como uma função dos desvios padrão das Figuras 4 e 5. Estas variações podem ser drasticamente reduzida por pré-incubação de todas as amostras e o leitor de placas de bioensaio a uma temperatura em ligeiro excesso de temperatura ambiente (isto é, 28 ° C). Na Figura 8, brevemente, 96-bem placas de poliestireno foram revestidos com [10 ug / ml] de RL21A durante 2 horas à temperatura ambiente, lavada com PBST, bloqueadas com 0,5% de leite com baixo teor de gordura, lavados com PBST e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente, com diluições em série de FLSL HLA monómero em soro humano normal diluído a 1:10 em PBS, para gerar uma curva padrão, ou plasma do paciente diluído a 1:10 em PBS. A placa foi lavada com PBST, incubadas 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo de coelho anti-humano β2 microglobulina [1: 5000] a detectar HLA intacto, e lavou-se em PBST. As placas foram então incubadas durante 30 minutos com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho [1: 10.000] e lavadas com PBST. Detecção colorimétrica foi realizada utilizando ABTS (2,2&#39;-azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] sal -diammonium) substrato com um tempo de incubação de 15 min e observado a 405 nm num leitor de microplacas. FLSL / HLA foi detectado em três amostras de doentes. Na Figura 8B, RL.064 plasma do paciente foi diluída a 1:20 em PBS e, em seguida, adicionared à placa e monitorizada no detector livre de marcador durante 60 min. A detecção específica de complexo FLSL / HLA no soro de um paciente foi realizada. Teste t de Student foi realizado utilizando gráficos e estatísticas de software (p &lt;0,05). Na Figura 8C, as secções de tecido foram coradas a 1 ug / ml com rato como controlos negativos anti-HLA-A2 (BB7.2) como um controlo positivo, RL21A, IgG2b e IgG2a, respectivamente. A coloração foi detectada utilizando um kit de detecção anti-ratinho, DAB (diaminobenzadina), e hematoxilina QS para a coloração nuclear tal como indicado pelo fabricante. Coloração de tecido tumoral por RL21A confirma a apresentação de complexos de FLSL / HLA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Tumor apresentação de antígenos pelo antígeno leucocitário humano classe I transformação cancerosa é um distúrbio intracelular. HLA amostra intracellulproteínas AR e revelam mudanças relacionadas ao câncer na superfície da célula. TCRm CTL e são capazes de reconhecer as células cancerosas através de complexos HLA-peptídeo distintas para estas células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Tela de aquisição de dados no software do scanner bioensaio Exemplo de aquisição de dados que mostra o varrimento de linha de base inicial, seguido pela adição de anticorpo RL21A para uma placa revestida com 10 ug / ml de complexo FLSL / HLA. As concentrações de anticorpos são como indicado. Cada linha representa um indivíduo bem monitorizados ao longo do tempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Formato de Ensaio de ilustração de anticorpos imobilizados sobre a superfície de grade de difracção da placa de ensaio rel capturanente péptido / complexos de HLA em solução. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figura 4: Especificidade de RL21A para FLSL / HLA complexo Demonstração da especificidade do biotinilado RL21A TCRm relevante para a sua monómero (FLSL) em relação ao monómero de HLA HLA irrelevante (YLEV, SLLV, e KVL).. Biotinilado RL21A TCRm [10 ug / ml] foi imobilizado na superfície da placa de ensaio revestida de avidina e a detecção foi realizada utilizando monómero não marcado HLA relevante ou irrelevante [10 ug / mL] em PBS. RL21A era específico para Complexo FLSL / HLA. Two-way ANOVA foi realizada por meio de gráficos e estatísticas software (p &lt;0,001). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figura 5:. A ligação de sensibilidade RL21A ao seu cognato péptido / complexo HLA Ilustração do DETECTIno limite de sensibilidade e de RL21A se ligar ao complexo FLSL / HLA. HLA biotinilado Monómero FLSL [10 ug / ml] foi imobilizado na superfície da placa de ensaio e RL21A não marcada foi adicionada à placa em diluições em série em PBS tal como indicado. Detecção para este sistema foi na faixa de baixo nanomolar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figura 6: Detecção de complexos de HLA em Soro Humano cravado demonstração da detecção de HLA no soro humano.. Biotinilado RL21A TCRm [10 ug / ml] foi imobilizado na superfície da placa de ensaio revestida de avidina. Soro humano normal reunido com cravado relevante (FLSL) ou irrelevante (SLLV) monómero HLA foi diluído a 1:20 em PBS e, em seguida, adicionado à placa e monitorizada no detector livre de marcador durante 60 min. A detecção específica de complexo FLSL / HLA no soro humano foi realizada. Em geral, o sinal de fundo (monómero SLLV irrelevante) é elevadaer para amostras de soro diluídas em comparação com analitos purificados em PBS (ver Figura 4). Two-way ANOVA foi realizada por meio de gráficos e estatísticas software (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figura 7:. Complexos HLA solúveis foram detectados em câncer de mama sobrenadantes de cultura de células A capacidade de detectar HLA em sobrenadantes de células de câncer de mama é demonstrada. Biotinilado RL21A TCRm, RL9A TCRm (controlo negativo), e um controlo de isotipo foram imobilizados na superfície da placa de ensaio. Cravada [5 ug / ml] e os sobrenadantes de cultura de células não enriquecido MDA-231 foram adicionados e a ligação foi monitorizada durante 60 min no detector livre de marcador. FLSL e monômero SLLV HLA cravado amostras representam controles positivos para RL9A e RL21A vinculativo. One-way ANOVA foi realizada por meio de gráficos e estatísticas software (p &lt;0,0001). Figura 8:. A detecção específica de complexos FLSL / HLA em amostras de doentes (A) Uma enzima tradicional Linked Immunosorbent Assay (ELISA) foi utilizado para detectar FLSL / HLA complexos específicos no plasma do doente. (B) biotinilado RL21A TCRm ou IgG2a [10 ug / ml] foi imobilizado na placa de ensaio avidina. (C) o tecido do tumor de mama de RL.064 paciente estava manchado como descrito anteriormente 3 para verificar apresentação tumor dos complexos FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células cancerosas, o que representa um potencial biomarcador câncer relevante. Utilizando tecnologia de sensor livre de marcador e do receptor de células T imitando anticorpos monoclonais, a detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada, permitindo o desenvolvimento de um romance câncer plataforma de diagnóstico.

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

detection-human-leukocyte-antigen-biomarkers-breast-cancer-utilizing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K visualizações.  Texas Tech University Health Sciences Center.  Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células cancerosas, o que representa um potencial biomarcador câncer relevante. Utilizando tecnologia de sensor livre de marcador e do receptor de células T imitando anticorpos monoclonais, a detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada, permitindo o desenvolvimento de um romance câncer plataforma d...

Vídeo: Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Livre de rótulo neutrófilo enriquecimento de secreção do paciente-derivado das vias aéreas usando microfluídica inercial de circuito fechado

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...